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DNA 백신

DNA vaccine
참고 항목: RNA 백신
DNA 백신을 만드는 것.

DNA 백신은 면역 반응을 유도하는 메커니즘으로 특정 항원 부호화 DNA 서열을 유기체의 세포에 전이시키는 백신이다.[1][2]

DNA 백신은 면역반응이 모색되는 항원을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 유전공학적으로 조작된 플라스미드를 주입하여 세포가 항원을 직접 생성하여 보호면역학적 반응을 유발하는 방식으로 작용한다.[3]DNA 백신은 기존 백신에 비해 이론적 이점이 있는데, 여기에는 "더 다양한 종류의 면역 반응을 유도할 수 있는 능력"[4]이 포함된다.몇몇 DNA 백신은 수의학용으로 실험되었다.[3]동물의 질병으로부터 보호를 받는 경우도 있고, 그렇지 않은 경우도 있다.[3]암뿐만 아니라 인간의 바이러스, 박테리아, 기생충 질병에 대한 접근법에 대한 연구가 진행 중이다.[4]2021년 8월 인도 당국은 ZyCoV-D에 긴급 승인을 내렸다.카딜라 헬스케어가 개발한 이 백신은 인간에게 승인된 최초의 DNA 백신이다.[5]

역사

참고 항목:백신 § 히스토리

기존 백신은 병원체에서 나온 특정 항원이나 백신 접종된 유기체의 면역 반응을 자극하는 감쇠된 바이러스를 포함한다.DNA 백신은 항원의 세포 생성(단백질 생합성)을 암호화하는 유전자 정보(DNA 또는 RNA)를 포함하고 있기 때문에 유전자 백신의 구성원이 된다.DNA 백신에는 병원균에서 나온 특정 항원을 암호화하는 DNA가 들어 있다.DNA는 체내에 주입되어 세포에 의해 흡수되는데, 정상적인 신진대사 과정은 그들이 섭취한 플라스미드의 유전코드를 바탕으로 단백질을 합성한다.이러한 단백질은 박테리아나 바이러스의 특징인 아미노산 염기서열 영역을 포함하고 있기 때문에 이물질로 인식되며 숙주세포에 의해 처리되어 표면에 표시되면 면역체계가 경각심을 갖게 되고 면역반응을 유발하게 된다.[6][7]또는, DNA는 세포의 진입을 용이하게 하기 위해 단백질로 캡슐화 될 수 있다.만약 이 캡시드 단백질이 DNA에 포함된다면, 결과 백신은 되돌릴 위험 없이 살아있는 백신의 효능을 결합할 수 있다.[citation needed]

1983년 뉴욕 보건부의 엔조 파올레티와 데니스 파니칼리는 유전자 공학을 이용해 일반 천연두 백신을 다른 질병을 예방할 수 있는 백신으로 변형시켜 재조합 DNA 백신을 생산하는 전략을 고안했다.[8]이들은 다른 바이러스(이름으로 헤르페스 심플렉스 바이러스, B형 간염, 인플루엔자)의 유전자를 삽입해 수두 바이러스의 DNA를 변형시켰다.[9][10]1993년, 제프리 울머와 머크 연구소의 동료들은 플라스미드 DNA를 인코딩한 독감 항원을 가진 생쥐를 직접 주사하는 것이 독감 바이러스에 대한 후속 실험 감염으로부터 동물들을 보호한다는 것을 증명했다.[11]2016년에 지카 바이러스를 위한 DNA 백신이 국립보건원에서 인간에게 실험을 시작했다.이 연구는 18세에서 35세 사이의 최대 120명의 과목들을 참여시킬 계획이었다.이와는 별도로 이노비오제약과 진원생명과학은 마이애미에서 지카를 상대로 다른 DNA 백신을 실험하기 시작했다.NIH 백신은 고압으로 상팔에 주입된다.백신 대량 생산은 2016년 8월 현재 미해결 상태로 남아 있다.[12]에이즈 예방을 위한 DNA 백신에 대한 임상시험이 진행 중이다.[13]

2021년 8월 인도 당국은 ZyCoV-D에 긴급 승인을 내렸다.카딜라 헬스케어가 개발한 이 백신은 COVID-19에 대한 최초의 DNA 백신이다.[5]

적용들

2021년 현재 미국에서는 어떤 DNA 백신도 인간 사용이 승인되지 않았다.질병으로부터 보호할 수 있을 만큼 강력한 반응을 이끌어낸 실험은 거의 없으며 이 기술의 유용성은 인간에게 증명되어야 한다.웨스트 나일 바이러스로부터 말을 보호하기 위한 수의학 DNA 백신이 승인되었다.[14]안티베놈 세라 개발의 수단으로도 DNA 면역력이 조사되고 있다.[1]DNA 면역은 단클론 항체 유도를 위한 기술 플랫폼으로 활용될 수 있다.[2]

이점

  • 감염[7] 위험 없음
  • MHC Class I과 Class II 분자[7] 모두의 항원 표시
  • 유형 1 또는 유형 2에[7] 대한 편광 T 셀 반응
  • 관심 항원에 초점을 맞춘 면역반응
  • 개발 및 생산의[7] 용이성
  • 보관 및 배송에 대한 안정성
  • 가성비
  • 펩타이드 합성, 재조합 단백질의 표현 및 정화, 독성 보조제[15] 사용의 필요성 제거
  • 면역생물의[6] 장기 지속성
  • 체내 표현은 단백질이 일반적인 진핵구조와 더 밀접하게 유사하도록 하며, 변환 후 수정을[6] 수반한다.

단점들

  • 단백질 면역체로 제한됨(세균 다당류 등 비단백질 기반 항원에는 유용하지 않음)
  • 박테리아 및 기생충 단백질의[7] 비정형 처리 가능성
  • 플라스미드 DNA 나노입자의 코 스프레이를 사용하여 뇌세포와[16] 같은 비표적 세포를 감염시킬 때 잠재성
  • 동일한 시설에서 서로 다른 유형의 살아있는 백신을 제조할 때 교차 오염

플라스미드 벡터

벡터 설계

DNA 백신은 고압 벡터를 사용할 때 최고의 면역 반응을 이끌어낸다.이것들은 관심 있는 유전자(또는 보완 DNA)[17]의 생체내 전사 및 번역을 추진하는 강력한 바이러스 촉진제로 구성된 플라스미드들이다.인트론 A는 때때로 mRNA 안정성을 향상시키고 따라서 단백질 발현을 증가시키기 위해 포함될 수 있다.[18]플라스미드는 또한 소의 성장 호르몬이나 토끼 베타 글로불린 폴리아데닐화 순서와 같이 강력한 폴리아데닐화/전사 종말 신호를 포함한다.[6][7][19]폴리시스트로닉 벡터(관심 유전자가 여러 개 있음)는 둘 이상의 면역체를 표현하거나, 면역겐과 면역억제 단백질을 표현하기 위해 구성되기도 한다.[20]

약 200Kbp까지 비교적 작은 유전코드를 운반하는 플라스미드는 면역겐이 발현되는 "차량"이기 때문에 단백질 발현을 위해 벡터 설계를 최적화하는 것이 필수적이다.[20]단백질 표현을 강화하는 한 가지 방법은 진핵 세포에 대한 병원성 mRNA의 코돈 사용을 최적화하는 것이다.병원균은 대상 종과 AT 성분이 다른 경우가 많으므로 대상 종에서 더 일반적으로 사용되는 코돈을 반영하도록 면역체의 유전자 순서를 변경하면 발현이 개선될 수 있다.[21]

또 다른 고려사항은 프로모터의 선택이다.SV40 프로모터는 RSV(Rous Sarkoom Virus) 프로모터에 의해 구동되는 벡터가 훨씬 더 높은 표현률을 보인다는 연구 결과가 나올 때까지 일반적으로 사용되었다.[6]보다 최근에는 즉시조기촉진제(CMV)와 레트로바이러스 시스 작용 전사원소를 사용함으로써 모델 시스템에서 표현과 면역유전성이 더욱 높아졌다.[22]표현 속도 개선을 위한 추가 수정사항으로는 엔핸서 시퀀스, 합성 인트론, 아데노바이러스 3자 리더(TPL) 시퀀스 삽입 및 폴리아데닐화 및 전사종료 시퀀스 수정 등이 있다.[6]DNA 백신 플라스미드의 예는 SV40 프로모터를 사용하는 pVAC이다.

구조 불안정 현상은 플라스미드 제조, DNA 예방접종, 유전자 치료 등에 특히 우려된다.[23]플라스미드 백본과 관련된 부속 영역은 광범위한 구조적 불안정 현상에 관여할 수 있다.유전적 불안정의 잘 알려진 촉매들은 직접, 반전, 탠덤 반복을 포함하는데, 이것은 상업적으로 이용 가능한 많은 복제와 표현 벡터에서 눈에 띈다.따라서 관련 없는 비코딩 백본 시퀀스의 감소 또는 완전 제거는 그러한 사건이 발생하는 경향과 결과적으로 전체 플라스미드의 재조합 잠재력을 현저하게 감소시킬 것이다.[24]

플라스미드의 메커니즘

일단 플라스미드가 전이된 세포핵에 삽입되면, 그것은 외국 항원의 펩타이드 끈을 코딩한다.그것의 표면에서 세포는 조직적합성 복합체(MHC) 등급 I과 클래스 II 분자를 모두 가진 외래 항원을 표시한다.그런 다음 항원을 나타내는 세포는 림프절로 이동하여 T세포에 신호를 보내는 항원 펩타이드와 비용조절 분자를 제시하여 면역반응을 일으킨다.[25]

백신 삽입 디자인

면역균은 항체나 세포독성 T세포 반응을 개선하기 위해 다양한 세포 구획을 대상으로 할 수 있다.분비되거나 혈장막 결합 항원은 세포질 항원보다 항체 반응을 유도하는 데 더 효과적이며, 세포질 분해에 대한 항원을 표적화하고 이후 주요 조직적합성 복합체(MHC) 등급 I 경로에 진입함으로써 세포독성 T세포 반응을 개선할 수 있다.[7]이것은 일반적으로 N-단자 유비쿼터스 신호의 추가에 의해 이루어진다.[26][27][28]

단백질의 순응은 항체 반응에도 영향을 미칠 수 있다."순서된" 구조(바이러스 입자 등)는 순서가 없는 구조보다 더 효과적이다.[29]서로 다른 병원균에서 나온 미니겐(또는 MHC class I emptope)의 문자열은 일부 병원균에 세포독성 T세포 반응을 일으키며, 특히 TH emptope가 포함된 경우 더욱 그러하다.[7]

배달

DNA 백신과 유전자 치료 기술은 비슷하다.

DNA 백신은 여러 가지 방법으로 동물 조직에 도입되었다.1999년, 가장 인기 있는 두 가지 접근법은 염분에 DNA를 주입하는 것이었다: 표준 피하 주사 바늘을 사용하거나 유전자 총 분만을 사용하는 것이다.[30]그 사이에 몇 가지 다른 기술들이 기록되어 있다.

식염수 주입

식염수 주사는 보통 골격근육(IM)에서 근내(IM) 또는 근내(ID)에서 진행되며 세포외 공간에 DNA를 전달한다.이것은 1) 전기수술에 의해,[31] 2) 부피바카인과 같은 미오톡신(myotoxins)으로 일시적으로 근육섬유를 손상시켜, 3) 식염수나 수크로스의 고음질 용액을 사용하여 도움을 줄 수 있다.[6]이 방법에 대한 면역 반응은 바늘 종류,[15] 바늘 정렬, 주사 속도, 주사 부피, 근육 유형, 나이, 성별, 생리학적 조건 등의 요인에 의해 영향을 받을 수 있다.[6]

진건

유전자총 전달은 압축된 헬륨을 가속제로 삼아 금이나 텅스텐 미세입자에 흡수된 플라스미드 DNA(pDNA)를 대상 세포로 가속시킨다.[6][20]

점막 표면 전달

대안으로는 코와 폐 점막과 같은 점막 표면에 알몸 DNA를 주입하는 [20]에어로졸, 눈과[32] 질 점막에 pDNA를 국소적으로 투여하는 것이 있었다.[20]또한 점막 표면 전달은 장 점막[35] 및 재조합 아데노바이러스 벡터에 구강 투여를 위한 계양 지질-DNA 준비,[7] 생분해성 미세소극,[33][20] 감쇠 살모날라,[34] 시겔라 또는 리스테리아 벡터를 사용하여 달성되었다.[20]

폴리머 차량

박테리아 세포와 합성 중합체로 구성된 하이브리드 차량이 DNA 백신 전달에 채용되었다.대장균 내핵과 폴리(베타-아미노 에스테르) 외피 기능이 시너지 효과를 발휘해 세포 흡수 및 내복, 포고솜 탈출, 세포 내 화물 농도 등 항원 제시 세포 유전자 전달과 관련된 장벽을 해소해 효율을 높인다.[jargon]쥐를 대상으로 실험한 결과, 하이브리드 벡터는 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다.[36][37]

ELI 면역

DNA 백신 접종에 대한 또 다른 접근방식은 표현도서관 면역(ELI)이다.이 기법을 사용하면 잠재적으로 병원체의 모든 유전자가 한 번에 전달될 수 있는데, 이것은 감쇠하기 어려운 병원균이나 배양에 유용할 수 있다.[6]ELI는 어떤 유전자가 보호 반응을 유발하는지 식별하는 데 사용될 수 있다.이것은 상대적으로 작은 게놈을 가진 머린 폐 병원체인 마이코플라즈마 풀모니스로 실험되었다.부분적 표현 라이브러리라도 이후의 도전으로부터 보호를 유도할 수 있다.[38]

유용한 표 비교

표 2.
납품방법 DNA의 공식화 대상 조직 DNA의 양
파렌테랄 주입(고분자 바늘) 식염수 내 수용액 IM(골격); ID; (IV, 피하 및 복강 내 가변 성공) 다량(약 100~200μg)
진건 DNA 코팅 금구슬 ED (피부 손상), 질 점막, 외과적으로 노출된 근육 및 기타 장기 소량(16ng)
공압(제트) 분사 수용액 ED 매우 높음(최대 300μg)
국소적용 수용액 안구체 소량(최대 100μg)
사이토감염[jargon] 매개체 지질(양식); 미세공간; 재조합성 아데노바이러스 벡터; 감쇠된 시겔라 벡터; 에어로졸화 양이온지질 제제 IM; IV (조직에 시스템적으로 감염됨), 복강 내, 장 점막에 대한 구강 면역; 코/엉덩이 점막 가변적
표 3.
납품방법 장점 단점
근육내 주입 또는 피부내 주입
  • 특별한 배송 메커니즘 없음
  • 영구식 또는 반영구식
  • pDNA는 몸 전체에 빠르게 퍼진다.
  • 근육조직의 형태학에 의한 비효율적인 흡수 부위
  • 비교적 많은 양의 DNA가 사용됨
  • Th1 응답이 필요한 응답이 아닐 수 있음
진건
  • 세포에 직접 투하된 DNA
  • 소량 DNA
  • Th2 응답이 필요한 응답이 아닐 수 있음
  • 불활성 입자를 운반체로 필요로 함
제트 분사
  • 입자가 필요 없음
  • DNA는 피부 표면 아래 mm에서 cm의 세포로 전달될 수 있다.
  • 고압 배출 후 상당한 양의 DNA 피복
  • 10배 낮은 발현과 낮은 면역반응
  • 다량의 DNA(최대 300μg) 필요
지질 매개 전달
  • 높은 수준의 면역 반응이 발생할 수 있음
  • 정맥내 전달된 pDNA의 전염을 증가시킬 수 있음
  • 정맥내 공급되는 지질-DNA 복합체가 잠재적으로 모든 조직을 감염시킬 수 있음
  • 인트라나로 전달되는 지질-DNA 복합체는 비강 무스코사 및 IgA 항체의 생성뿐만 아니라 원위점막에서도 발현될 수 있다.

복용량

전달 방법은 효과적인 면역 반응을 일으키는 데 필요한 선량을 결정한다.식염수 주사는 10μg에서 1mg까지 다양한 양의 DNA를 필요로 하는 반면 유전자 총 전달은 1001000배 더 적게 필요하다.[39]일반적으로 0.2μg – 20μg이 필요하지만 16ng의 양이 보고되었다.[6]이 양은 종에 따라 다르다.예를 들어 생쥐는 영장류보다 약 10배 적은 DNA를 필요로 한다.[7]식염수 주사는 DNA가 대상 조직의 세포외 공간(보통 근육)에 전달되기 때문에 더 많은 DNA가 필요한데, 이때 DNA는 세포가 차지하기 전에 물리적인 장벽(기초 라미나 다량의 결합조직 등)을 극복해야 하기 때문에, 유전자 총은 DNA를 세포에 직접 전달하여 세포에 구동/강력 DNA를 전달한다.적은 "쓰레기"[6][7]로 팅

면역반응

도우미 T 셀 응답

항원 표시는 T세포가 "세포독성" CD8+ 세포가 되거나 "헬퍼" CD4+ 세포가 되도록 자극한다.세포독성 세포는 표면에 특정한 이물질이나 비정상적인 분자를 운반하는 다른 세포들을 직접 공격한다.도우미 T세포, 즉 Th세포는 다른 세포와 소통함으로써 면역 반응을 조정한다.대부분의 경우 T세포는 항원이 신체의 MHC, 즉 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 세포 표면에 운반되는 경우에만 항원을 인식한다.

DNA 면역은 림프관절제술과 다양한 사이토카인 프로파일의 생성을 포함한 다수의 T 반응을H 일으킬 수 있다.DNA 백신의 주요 장점은 T-세포 도움의 유형을 TH1 또는 TH2 반응에 치우치게 조작할 수 있다는 것이다.[40]각 타입은 림프코인과 케모킨 발현, 특정 종류의 면역글로불린, 림프구 밀거래의 패턴, 선천적인 면역반응의 유형을 가지고 있다.

다른 유형의 T 셀 도움말

제기된 T세포 도움말의 유형은 전달 방법과 표현된 면역물질의 종류뿐만 아니라 서로 다른 림프구획의 표적에 의해 영향을 받는다.[6][41]일반적으로 식염수 바늘 주사(IM 또는 ID 중 하나)는 TH1 반응을 유도하는 경향이 있는 반면 유전자 총 전달은 TH2 반응을 상승시킨다.[40][41]이는 세포내 및 혈장막 결합 항원에 대해서는 해당되지만, 전달 방법에 관계없이 TH2 반응을 발생시키는 것으로 보이는 분비 항원에 대해서는 해당되지 않는다.[42]

일반적으로 제기되는 T-세포 도움말의 유형은 시간이 지남에 따라 안정적이며, 보통 순한 표본에서 반대 유형의 반응을 일으켰을 수 있는 도전하거나 후속 면역 후에도 변하지 않는다.[40][41]하지만, Mor 등..(1995) [17]생쥐에게 pDNA를 투여하여 생쥐의 말라리아 기생충 플라스모디움 요엘리(PyCSP)의 원주 단백질을 인코딩하여 증식시킨 결과, 초기 TH2 반응이 부스팅 후 TH1 반응으로 바뀐 것을 발견했다.

다양한 유형의 T-셀 도움말에 대한 기초

이러한 다른 방법들이 어떻게 작용하는지, 항원의 형태, 그리고 T세포 도움의 다른 프로파일들은 이해되지 않는다.IM 주입에 사용되는 비교적 많은 양의 DNA가 TH1 반응의 유도를 담당한다고 생각되었다.단, TH 타입의 선량 관련 차이는 없다.[40]제기된 T세포 도움의 종류는 항원이 세포를 제시하는 차별화된 상태에 의해 결정된다.덴드리틱 셀은 IL-12(TH1 세포 개발을 지원하는) 또는 IL-4(TH2 반응을 지원하는)를 분비하기 위해 분화할 수 있다.[43]바늘에 의해 주입된 pDNA는 덴드리트 세포에 내포되어 있는데, 이것은 자극되어 TH1 사이토카인(IL-12) 생산을 위해 구별되는 반면,[44] 유전자 총은 DNA를 세포 안으로 직접 폭격하여 TH1 자극을 우회한다.

편광 T-세포 도움말의 실제 사용

T세포의 편광은 알레르기 반응과 자가면역 질환에 영향을 미치는데 유용하다.자가면역질환의 경우 자가파괴 TH1반응(관련 세포독성 T세포 활성과 함께)을 비파괴 TH2반응으로 전환하는 것이 목표다.이것은 전임상[7] 모델에서 원하는 유형의 반응에 대한 사전 예방을 위해 성공적으로 적용되었으며 확립된 질병에 대한 반응을 이동하는 데 다소 성공적이다.[45]

세포독성 T세포 반응

DNA 백신의 장점 중 하나는 살아있는 백신에 관련된 고유의 위험 없이 세포독성 T 림프구(CTL)를 유도할 수 있다는 점이다.자연 감염을 모방한 것처럼 보이는 방법으로 면역항암제 및 면역처방성 CTL 에피페어뿐만 아니라 [46]부지배성 CTL 에피페어에 대해서도 CTL 반응이 제기될 수 있다.[33][jargon]이것은 CTL 상피와 면역력을 제공하는 데 있어 그들의 역할을 평가하는 데 유용한 도구로 증명될 수 있다.

세포독성 T세포는 MHC 등급 I 분자에 복합된 작은 펩타이드(8-10 아미노산)를 인식한다.[47]이러한 펩타이드들은 분해되어 내소성 망막(ER) 내의 초기 MHC 등급 I 분자로 전달되는 세포질 단백질에서 유래한다.[47]따라서 유전자 제품을 ER로 직접 조준하는 것은 (N-terminus에서 ER 삽입 신호 시퀀스를 추가하여) CTL 반응을 강화해야 한다.이것은 인플루엔자 단백질을 발현하는 재조합형 백신 바이러스를 사용하여 성공적으로 증명되었지만,[47] 그 원리는 DNA 백신에도 적용되어야 한다.유비퀴틴 신호 시퀀스 또는 다른 신호 시퀀스의 돌연변이를 추가하여 세포 내 분해(따라서 MHC 클래스 I 경로에 진입)를 위한 항원을 대상으로 하는 것이 CTL 반응을 증가시키는데 효과적인 것으로 나타났다.[27]

인플루엔자 뉴클레오프로틴에 대한 DNA 백신의 경우 B7-1 또는 B7-2와 같은 공동 자극 분자와 공동 자극하거나,[46][48] 뮤린 말라리아 모델인 P 요엘리에 대한 DNA 백신의 경우 GM-CSF와 결합하면 CTL 반응이 향상될 수 있다.[49]플라스미드 인코딩 방식의 공동 자극 분자 IL-12와 TCA3는 HIV-1과 인플루엔자 뉴클레오프로틴 항원에 대한 CTL 활동을 증가시키는 것으로 나타났다.[48][50]

유머(안티바디) 반응

항체 및 항원의 도식도

DNA 백신 접종에 의해 도출되는 항체 반응은 항원 유형, 항원 위치(즉, 세포 내 대 분비), 수, 빈도 및 면역 선량, 항원 전달의 현장 및 방법 등 여러 변수에 의해 영향을 받는다.

항체 반응의 운동학

한 번의 DNA 주사 후 유머 반응은 재조합 단백질을 한 번 주입한 후보다 훨씬 오래 지속될 수 있다.B형간염바이러스(HBV) 봉투단백질(HBsAg)에 대한 항체반응은 최대 74주 동안 증강 없이 지속됐으며, 인플루엔자 헤마글루틴에 대한 보호반응의 평생정비는 유전자총 전달 후 생쥐에서 입증됐다.[51]항체정류세포(ASC)는 장기항체생산을 위해 골수와 비장으로 이동하며, 1년 후에는 일반적으로 그곳에서 국소화된다.[51]

자연(바이러스)감염에 의해 생성된 항체 반응의 비교, 재조합 단백질에 대한 면역, pDNA에 의한 면역은 표 4에 요약되어 있다. DNA에 의한 항체 반응은 자연감염이나 재조합 단백질 면역이 발생할 때보다 훨씬 느리게 상승한다.비록 부스팅이 그 간격을 줄일 수 있지만, 생쥐의 최대 십이십자에 도달하기 위해서는 12주가 필요할 수 있다.이러한 반응은 아마도 항체 반응의 1차 및 2차 단계를 모두 지원하는 몇 주 동안 표현된 항원의 낮은 수준 때문일 것이다.[clarification needed]성인에게 HBV의 작은 봉투와 중간 봉투 단백질을 발현한 DNA 백신이 만성 간염으로 주입됐다.그 백신은 특정한 중간 감마선 감마선 생산을 낳았다.또한 중간 봉합 단백질 항원을 위한 구체적인 T세포가 개발되었다.환자의 면역 반응은 HBV 감염을[52] 통제할 만큼 충분히 강하지 않았다.

표 4.
면역법
DNA 백신 재조합단백질 자연감염
유도항원량 ng μg ? (ng-μg)
항원발현기간 몇 주 < 1주일 몇 주
항체 반응의 운동학 느린 상승 급상승 급상승
높은 탐욕 IgG 획득을 위한 접종 횟수 및 골수로의 이동 하나 두 개 하나
Ab isotype(살인 모델) C의존적 또는 C의존재 C' 종속 C'독립

또한, DNA 예방접종에 의해 제기된 특정 항체의 십일조는 재조합 단백질로 예방접종을 한 후 얻은 것보다 낮다.그러나 DNA 면역 유도 항체는 단백질 유도 재조합 항체보다 고유 상피에 더 큰 친화력을 보인다.즉, DNA 면역은 질적으로 우월한 반응을 유도한다.DNA로 한 번 접종한 후에 항체가 유도될 수 있는 반면, 재조합 단백질 접종에는 일반적으로 부양이 필요하다.DNA 면역은 면역 반응의 TH 프로파일에 편향되어 항체가 이형인 데 사용될 수 있는데, 이는 자연 감염이나 재조합 단백질 면역으로는 가능하지 않다.DNA에 의해 생성된 항체 반응은 준비 도구로서 유용하다.예를 들어 시약으로 사용하기 위해 다면체 및 단면체 항체가 생성될 수 있다.[citation needed]

DNA증식 면역반응을 위한 기계론적 근거

DNA 흡수 메커니즘

DNA 흡수 및 이후 발현이 근육 세포에서 처음으로 체내로 증명되었을 때,[53] 이 세포들은 T관망의 광범위한 네트워크 때문에 독특하다고 생각되었다.전자 현미경 검사를 사용하여, DNA 흡수를 주의사항(또는 비클라트린 코팅 구덩이)에 의해 촉진할 것을 제안했다.[54]그러나 후속 연구에서는 다른 세포(각질세포, 섬유모세포, 상피 랑게르한스 세포 등)도 DNA를 내재화할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.[45][55]DNA 흡수 메커니즘은 알려져 있지 않다.

두 가지 이론이 지배적이다. 즉 DNA의 체내 흡수는 비특이적으로 발생하거나,[20] 파이고나 피노시토스와 유사한 방법 또는 특정 수용체를 통해 발생한다.[56]여기에는 30kDa 표면 수용체 또는 대식세포 스캐빈저 수용체가 포함될 수 있다.[clarification needed]30kDa 표면 수용체는 특별히 4500bp DNA 조각에 결합되며(그 후 내장이 된다) 전문 APC와 T세포에서 발견된다.대식세포 스캐빈저 수용기는 폴리보뉴클레오티드를 포함한 다양한 고분자에 결합되어 있으며 따라서 DNA 흡수 대상이다.[56][57]수용체 매개 DNA 흡수는 다구아닐레이트 시퀀스의 존재에 의해 촉진될 수 있다.[clarification needed][citation needed]유전자 총 전달 시스템, 양이온 지방질 포장 및 기타 전달 방법은 이 입력 방법을 우회하지만, 이를 이해하는 것이 동물 사육에서 중요할 수 있는 비용 절감(예를 들어 사이토피신의 요구 조건을 줄임으로써)에 유용할 수 있다.

골수유래세포별 항원발현

덴드리트 세포.

치메릭 생쥐를 이용한 연구는 항원이 골수에서 파생된 세포에 의해 제시된다는 것을 보여주었는데, 여기에는 덴드리트리틱 세포, 대식세포, 전문 항원 제시 세포(APC)라고 불리는 전문 B세포가 포함된다.[48][58]유전자 총이 피부에 접종된 후, 전치된 랑게르한스 세포는 배수 림프절로 이동하여 항원을 제시한다.[7]IM과 ID주사 후 배수림프절에서[55] 덴드리트 세포가 항원을 가지고 있고, 말초혈액에서 전이된 대식세포가 발견되었다.[59]

덴드리트 세포나 대식세포의 직접적인 전염 외에도, 교차 프라이밍은 IM, ID, 유전자 총 DNA 전달에 따라 발생한다.크로스 프라이밍은 골수에서 유래된 세포가 MHC 등급 1의 맥락에서 다른 세포에 합성된 단백질로부터 펩타이드를 제시할 때 발생한다.이것은 세포독성 T세포 반응을 유발할 수 있으며 완전한 1차 면역 반응에 중요한 것으로 보인다.[7][60]

대상 사이트 역할

IM과 ID DNA 전달은 면역 반응을 다르게 시작한다.피부에서는 각질세포, 섬유질, 랑게르한스 세포가 항원을 차지하고 표현하며 1차 항체 반응을 유도하는 역할을 한다.전염된 랑게르한스 세포는 피부 바깥(12시간 이내)에서 배출 림프절로 이동하며 2차 B-세포와 T-세포 반응을 일으킨다.골격근에서, 줄무늬근육세포는 가장 자주 전이되지만, 면역반응에서는 중요하지 않은 것처럼 보인다.대신, IM은 DNA를 몇 분 안에 배수 림프절에 "세척"을 접종했는데, 이 때 원위 dendritic 세포가 전치되어 면역 반응을 일으킨다.전염된 균세포는 전문 APC를 밀매하기 위한 항원의 "저수지" 역할을 하는 것으로 보인다.[20][53][60]

면역반응 유지

참고 항목:엽록체 세포 § 항원 포획, 기억 B 세포 지지; 그리고 엽록체 세포 § B 세포와의 상호작용

DNA 예방접종은 강력한 B세포 자극제인 모낭당첨가세포(FDC)에 항원항체항체 복합체 표시를 통해 효과적인 면역기억을 생성한다.T세포는 유사한 생식 중심 수지상세포에 의해 자극을 받을 수 있다.FDC는 항체가 장기간 항원표현을 "오버랩"하여 항원-항원-항원-항원-항원 면역복합체가 형성되어 FDC에 의해 표시될 수 있기 때문에 면역기억을 생성할 수 있다.[7]

인터페론

도우미와 세포독성 T세포 모두 인터페론을 분비해 바이러스 감염을 조절할 수 있다.세포독성 T세포는 보통 바이러스 감염 세포를 죽인다.그러나 IFN-γ, TNF-α와 같은 항바이러스 사이토카인을 분비하는 것도 자극할 수 있는데, 이 항바이러스성분들의 발현을 하향 조절하여 바이러스 감염을 제한한다.[61]DNA 예방접종은 비파괴 IFN 매개 통제에 의해 바이러스 감염을 억제하는 데 사용될 수 있다.이것은 B형 간염에 대해 증명되었다.[62]IFN 바이러스는 말라리아 감염을[63] 억제하는 데 매우 중요하며 말라리아 예방 DNA 백신에 대한 고려사항이다.

면역반응 변조

사이토카인 변조

효과적인 백신은 반드시 주어진 병원체에 대해 적절한 면역 반응을 유도해야 한다.DNA 백신은 T-세포의 도움을 TH1 또는 TH2 프로파일에 편중시킬 수 있으며 필요할 때 CTL 및/또는 항체를 생성할 수 있다.이는 표현된 항원 형태(즉, 세포내 대 분비), 전달 방법 및 경로 또는 선량을 수정하여 달성할 수 있다.[40][41][64][65][66]그것은 또한 면역 규제 분자, 즉 사이토카인, 림포카인 또는 공동 자극 분자를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 공동 관리에 의해서도 이루어질 수 있다.이러한 "유전적 보조제"는 다음과 같이 관리될 수 있다.

  • 두 플라스미드의 혼합물, 하나는 면역겐을 인코딩하고 다른 하나는 사이토카인을 인코딩한다.
  • 스페이서 영역으로 분리된 단일 바이 또는 폴리시스트로닉 벡터
  • 플라스미드를 함유한 키메라, 또는 융합 단백질

일반적으로 프로염증제(다양한 인터루킨, 종양 괴사인자, GM-CSF 등)와 TH2 유도 사이토카인이 항체반응을 증가시키는 반면, 프로염증제와 TH1 유도 사이토카인은 유머반응을 감소시키고 세포독성반응을 증가시킨다(바이러스 보호에 더 중요하다).B7-1, B7-2, CD40L와 같은 공동 자극 분자가 사용되기도 한다.

이 개념은 pDNA 인코딩 IL-10의 주제 관리에 적용되었다.[32]플라스미드 인코딩 B7-1(APC에 리간드)은 종양 모델에서 면역 반응을 성공적으로 강화했다.GM-CSF를 부호화하는 플라스미드와 P. 요엘리(PyCSP)의 원주 단백질 혼합은 이후의 도전에 대한 보호를 강화했다(플라스미드-인코딩 PyCSP만 그렇지 않았다).GM-CSF는 덴드리트 세포가 보다 효율적으로 항원을 제시하도록 하고 IL-2 생산과 TH 세포 활성화를 강화하여 면역반응을 증가시킬 것을 제안했다.[49]이것은 pPyCSP와 pGM-CSF 혼합물로 먼저 프라이밍한 후 PyCSP를 표현하는 재조합형 pox 바이러스로 부스팅함으로써 더욱 강화될 수 있다.[67]However, co-injection of plasmids encoding GM-CSF (or IFN-γ, or IL-2) and a fusion protein of P. chabaudi merozoite surface protein 1 (C-terminus)-hepatitis B virus surface protein (PcMSP1-HBs) abolished protection against challenge, compared to protection acquired by delivery of pPcMSP1-HBs alone.[29]

유전자 보조제의 장점은 저비용과 단순한 투여뿐 아니라 불안정한 재조합 사이토카인 및 잠재적으로 독성이 있는 "기존" 보조제(알룸, 칼슘 인산염, 모노스포릴 지질 A, 콜레라 독소, 양이온 및 만난 코팅된 지질, QS21, 카복시메틸 셀룰로오스, 우베니믹스 등)를 피하는 것이다.[7][20]그러나, 장기화된 사이토카인 표현의 잠재적인 독성은 확립되어 있지 않다.상업적으로 중요한 많은 동물 종에서 사이토카인 유전자는 식별되지 않고 격리되어 있다.또 다양한 플라스미드 인코딩 사이토카인은 분만시간에 따라 면역체계를 다르게 변형시킨다.예를 들어, 일부 사이토카인 플라스미드 DNA는 면역체 pDNA 후에 가장 잘 전달된다. 왜냐하면 사전 또는 공동 전달은 특정 반응을 감소시키고 비특정 반응을 증가시킬 수 있기 때문이다.[68]

면역억제 CpG 모티브

플라스미드 DNA 자체는 면역체계에 부수적인 영향을 미치는 것으로 보인다.[6][7]박테리아에서 파생된 DNA는 선천적인 면역 방어 메커니즘, 덴드리트 세포의 활성화 및 TH1 사이토카인의 생성을 유발할 수 있다.[44][69]이는 면역억제성이 있는 특정 CpG 디뉴클레오티드 시퀀스를 인식했기 때문이다.[65][70]CpG 자극(CpG-S) 시퀀스는 eukaryotes보다 박테리아에서 파생된 DNA에서 20배 더 자주 발생한다.이는 eukaryotes가 "CpG 억제"를 나타내기 때문이다. 즉, CpG 디뉴클레오티드 쌍은 예상보다 훨씬 덜 빈번하게 발생한다.또한 CpG-S 시퀀스는 저메틸화된다.이는 박테리아 DNA에서 자주 발생하는 반면 진핵에서 발생하는 CpG 모티브는 세포신 뉴클레오티드에서 메틸화된다.대조적으로, 면역 반응의 활성화를 억제하는 뉴클레오티드 시퀀스(단어 CpG 중화 또는 CpG-N)는 진핵 게놈에서 과잉 표현된다.[71]최적의 면역자극 시퀀스는 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드(dinucleotide)이며, 옆면에는 2개의 5'의 청개와 2개의 3'의 피리미딘이 있다.[65][69]또한 이 면역자극성 헥사머 외부의 측면 부위는 구아닌이 풍부해야 대상 세포에 결합하고 흡수할 수 있다.

선천적 시스템은 적응 면역 시스템과 함께 작용하여 DNA로 인코딩된 단백질에 대한 반응을 일으킨다.CpG-S 시퀀스는 다면 B세포 활성화와 사이토카인 발현 및 분비물의 상향 조절을 유도한다.[72]자극된 대식세포는 IL-12, IL-18, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-α를 분비하는 반면 자극된 B세포는 IL-6와 일부 IL-12를 분비한다.[20][72][73]

DNA 백신의 플라스미드 백본에서 CpG-S와 CpG-N 시퀀스를 조작하면 인코딩된 항원에 대한 면역 반응의 성공을 보장할 수 있으며 면역 반응을 TH1 표현형으로 유도할 수 있다.이것은 병원체가 보호를 위해 TH 응답을 요구하는 경우에 유용하다.CpG-S 시퀀스는 또한 DNA와 재조합 단백질 백신 접종을 위한 외부 보조제로 사용되었고, 성공률이 가변적이다.저산염 CpG 모티브를 가진 다른 유기체들은 다면 B세포 팽창의 자극을 입증했다.[74]이 이면의 메커니즘은 단순한 메틸화보다 더 복잡할 수 있다 – 저메틸화 된 머린 DNA는 면역 반응을 일으키는 것으로 발견되지 않았다.

면역억제 CpG 시퀀스에 대한 대부분의 증거는 어두운 연구에서 나온다.이 데이터를 다른 종에 대한 외삽은 주의를 요한다 – 스캐빈저 수용체의 결합 특수성은 종마다 다르기 때문에 개별 종은 다른 측면 시퀀스를 요구할 수 있다.또한, 반추동물과 같은 종은 위장하중이 크기 때문에 면역자극에 둔감할 수 있다.

대체 부스트

DNA 주기의 면역반응은 재조합 단백질이나 재조합된 독소 바이러스의 투여에 의해 촉진될 수 있다.재조합 단백질을 사용한 "Prime-boost" 전략은 HIV-1 봉투 단백질과 같은 약한 면역체에 대해 중화 항체 티트르와 항체 탐욕과 지속성을 모두 증가시키는 데 성공했다.[7][75]재조합형 바이러스 부스트는 DNA 주기의 CTL 반응을 증가시키는데 매우 효율적인 것으로 밝혀졌다.DNA를 이용한 프라이밍은 면역반응을 필수 면역겐에 집중시키는 반면, 재조합 바이러스로 부스팅하면 더 많은 양의 표현된 항원이 제공되어 특정 CTL 반응이 크게 증가하게 된다.

프라임-부스트 전략은 여러 연구에서 말라리아 도전에 대한 보호를 유도하는 데 성공했다.플라스미드 DNA 인코딩 플라모듐 요엘리 원단백질(PyCSP)을 가진 영장류 생쥐는 동일한 단백질을 발현하는 재조합형 백신 바이러스로 부스팅되었으며, 항체, CTL 활성도, IFN-감염의 수치가 상당히 높았으며, 따라서 플라스미드 DNA만으로 면역되고 부스팅된 생쥐보다 보호 수준이 더 높았다.[76]이것은 재조합형 백신 바이러스로 부스팅하기 전에 PyCSP와 뮤린 GM-CSF를 인코딩하는 플라스미드가 혼합된 프라이밍을 통해 더욱 강화될 수 있다.[67]시미안 말라리아 모델 P. knowlesi의 효과적인 프라임-부스트 전략도 입증되었다.[77]Rhesus monkeys were primed with a multicomponent, multistage DNA vaccine encoding two liver-stage antigens – the circumsporozoite surface protein (PkCSP) and sporozoite surface protein 2 (PkSSP2) – and two blood stage antigens – the apical merozoite surface protein 1 (PkAMA1) and merozoite surface protein 1 (PkMSP1p42).그리고 나서 그들은 4개의 항원을 모두 인코딩하는 재조합형 카나리아산두 바이러스로 증가되었다(ALVAC-4면역된 원숭이들은 포로조아이트와 감염된 적혈구에 대한 항체를 개발했고 IFN은 PkCSP의 펩타이드에 대한 T세포 반응을 개발했다.포로조아이트 도전에 대한 부분적인 보호가 이루어졌으며 평균 기생충은 대조 원숭이에 비해 현저하게 감소하였다.이러한 모델들은 인간에서 P. 팔시파룸에 대한 외삽에는 적합하지 않지만 임상 전 실험에서는 중요할 것이다.

면역반응 강화

DNA

DNA가 분해되지 않도록 안정화시키고, 항원 발현 세포로 DNA 전달의 효율성을 높임으로써 DNA 면역의 효율을 향상시킬 수 있다.[7]이는 DNA로 Cetyltrimethylammonium Bromide로 제조된 poly(lactide-co-glycolide)와 같은 생분해성 cationic microparticles를 코팅하여 입증되었다.그러한 DNA 코팅된 미세입자는 재조합 바이러스처럼 CTL을 올리는 데 효과적일 수 있으며, 특히 알룸과 혼합된 경우 더욱 그러하다.직경 300nm의 입자는 항원이 세포를 제시하는 데 가장 효율적인 것으로 보인다.[7]

알파바이러스 벡터

재조합형 알파바이러스 기반 벡터는 DNA 예방접종 효율을 높이기 위해 사용되어 왔다.[7]관심 항원을 인코딩하는 유전자가 알파바이러스 리디콘에 삽입돼 구조 유전자는 대신 비구조적 복제효소 유전자는 그대로 남는다.신드비스 바이러스와 셈리키 포레스트 바이러스는 재조합 알파바이러스 복제체를 만드는 데 사용되었다.기존의 DNA 예방접종과 달리 알파바이러스 벡터는 전염된 세포를 죽이고 일시적으로만 발현된다.알파바이러스 복제효소 유전자는 백신 삽입 외에 추가로 발현된다.알파바이러스 복제체가 면역반응을 어떻게 증가시키는지는 분명하지 않지만, 이 벡터에 의해 발현되는 단백질의 높은 수준, 즉 리티콘에 의한 사이토카인 반응, 리티콘에 의한 세포사멸 등으로 인해 덴드리트 세포에 의한 항원 흡수가 강화되었기 때문일 수 있다.

참고 항목

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