일렉트로포레이션

Electroporation
시험관내 일렉트로포레이션용 큐벳.알루미늄 전극과 파란색 뚜껑이 있는 플라스틱입니다.최대 400μl를 수용할 수 있습니다.

전기투과성 또는 전기투과성은 세포막의 투과성을 증가시키기 위해 세포에 전기장이 적용되는 미생물학 기술로, 화학 물질, 약물, 전극 배열 또는 DNA가 세포에 도입될 수 있도록 한다(전기전달이라고도 [1][2][3]불린다).미생물학에서 전기화 과정은 종종 새로운 코드 DNA를 도입함으로써 박테리아, 효모 또는 식물 원형체를 변형시키는데 사용된다.박테리아와 플라스미드가 함께 섞이면 플라스미드는 전기 분해 후 박테리아로 옮겨질 수 있지만, 무엇이 옮겨지는지에 따라 세포 투과성 펩타이드 또는 CellSqueze도 사용될 수 있다.일렉트로포메이션은 수천 볼트(약 8kV/cm)의 전압을 전기포메이션 큐벳의 [1]부유 세포에 전달함으로써 작동합니다.그 후 세포는 분열할 기회가 생길 때까지 조심스럽게 다루어져야 하며, 재생된 플라스미드를 포함한 새로운 세포를 생산해야 한다.이 과정은 화학적 [4][verification needed]변환보다 세포막의 투과성을 높이는 데 약 10배 더 효과적이다.

또한 전기는 조직 배양 세포, 특히 포유류 세포에 외래 유전자를 도입하는 데 매우 효율적입니다.예를 들어, 녹아웃 생쥐를 생산하는 과정뿐만 아니라 종양 치료, 유전자 치료, 세포 기반 치료에도 사용된다.진핵세포에 외래 DNA를 도입하는 과정은 트랜스펙션으로 알려져 있다.일렉트로포메이션은 일렉트로포메이션 큐벳을 사용하여 현탁 상태의 세포를 투과시키는 데 매우 효과적이다.일렉트로포레이션은 자궁 내 응용 분야뿐만 아니라 난소 전달에서도 생체 내 조직 사용에 효율적인 것으로 입증되었다.접착성 세포는 또한 전기 탐사를 사용하여 전염될 수 있으며, 이것은 연구자들에게 전염되기 전에 그들의 세포를 트립신화하는 것에 대한 대안을 제공한다.그러나 전기 생성의 한 가지 단점은 그 과정이 끝난 후 7,000개 이상의 유전자의 유전자 발현에 [5]영향을 줄 수 있다는 것이다.이것은 정확하고 정확한 결과를 보장하기 위해 유전자 발현을 통제해야 하는 연구에서 문제를 일으킬 수 있다.

비록 대량 전기는 미세 주입과 유전자 총과 같은 물리적 전달 방법보다 많은 이점을 가지고 있지만, 여전히 낮은 세포 생존 능력을 포함한 한계를 가지고 있다.전기화의 소형화가 연구되어 나노채널을 통한 미세전기화 및 조직의 나노트랜스펙션으로 이어져 세포에 [6]대한 화물의 침입을 최소화하였다.

전기 탐사는 또한 세포 융합을 촉발하는 메커니즘으로 사용되어 왔다.인공적으로 유도된 세포 융합은 [7][8][9]당뇨병과 같은 다른 질병을 조사하고 치료하고, 중추신경계의 [10]축삭을 재생하고, 암 면역 [11]치료를 위한 세포 백신과 같이 원하는 성질을 가진 세포를 생산하는데 사용될 수 있다.단, 세포융합의 최초 및 가장 알려진 응용은 하이브리드 도마 기술에 있어서의 모노클로널 항체의 생산이며, 하이브리드 세포주(하이브리도마)는 특정 항체를 생성하는 B 림프구와 골수종(B 림프구 암)[12] 세포주를 융합함으로써 형성된다.

검사실 업무

일렉트로포레이션은 셀 용액에 정전장을 생성하는 전용 기구인 일렉트로포메이터를 사용하여 수행됩니다.셀 서스펜션은 측면에 알루미늄 전극 2개가 있는 글라스 또는 플라스틱 큐벳에 파이프로 연결됩니다.세균 전기 절취의 경우 일반적으로 약 50마이크로리터의 현탁액이 사용됩니다.전기화 전에 이 세균의 현탁액을 플라스미드와 혼합하여 형질전환한다.혼합물은 큐벳에 파이프로 연결되고, 전압 및 정전 용량이 설정되며, 큐벳은 일렉트로포레이터에 삽입됩니다.이 프로세스를 수행하려면 전극과 서스펜션 사이에 직접 접촉해야 합니다.전기화 직후 균(큐벳 내 또는 에펜도르프 튜브 내)에 1밀리리터의 액상배지를 첨가하고 균의 최적온도로 1시간 이상 배양하여 세포의 회복과 플라스미드의 발현을 가능하게 한 후 한천판상의 세균배지를 배양한다.

일렉트로포레이션의 성공은 플라스미드 용액의 순도, 특히 염분 함량에 크게 좌우됩니다.염분 농도가 높은 용액은 방전(아크로 알려져 있음)을 일으킬 수 있으며, 이는 종종 박테리아의 생존력을 감소시킵니다.프로세스에 대한 자세한 조사를 위해 포레이터 장치의 출력 임피던스 및 셀 서스펜션의 입력 임피던스(염분 함유량 등)에 더욱 주의를 기울여야 합니다.

세포막은 (이온 채널을 제외하고) 전류를 통과할 수 없기 때문에 전기 캐패시터 역할을 합니다.막에 고전압 전장을 가하면 막이 일시적으로 파괴되고, 그 결과 고분자([13]DNA 등)가 세포로 들어가거나 나갈 수 있을 만큼 충분히 큰 모공이 생긴다.

또한 자궁주사 및 수술 시 세포 투과성을 높이기 위해 전기절단을 사용할 수 있습니다.특히 전기 형성은 DNA, RNA, shRNA 및 모든 핵산을 생쥐와 쥐의 세포에 보다 효율적으로 전달할 수 있도록 한다.생체내 일렉트로포레이션의 성공은 전압, 반복, 펄스 및 지속시간에 크게 좌우된다.핵산 주입을 위한 심실의 가시성뿐만 아니라 분열 세포의 투과성이 증가하기 때문에 중추신경계의 발달은 생체내 전기화에 가장 효과적이다.자궁배아에 주입된 전기절편은 자궁벽을 통해 이루어지며,[14] 종종 태아의 손상을 제한하기 위해 겸자형 전극을 사용한다.

체외 및 동물 연구

생체내 유전자 전기이식은 1991년에[15] 처음 설명되었고 오늘날 유전자 전기이식에 대한 많은 임상 연구가 있다.이 방법은 면역 체계 장애, 종양, 대사 장애, 단일 유전병, 심혈관 질환, 진통 등과 같은 여러 질병의 잠재적 치료를 위한 다양한 치료 유전자를 전달하기 위해 사용됩니다.[16][17][18]

돌이킬 수 없는 전기절제술에 관해서는 생쥐 13마리 중 12마리에서 완전한 종양 절제를 달성한 과학자 그룹에 의해 생쥐에 이식된 악성 피부종양의 첫 번째 치료가 2007년에 완료되었습니다.그들은 피부 [19]종양을 치료하기 위해 0.3Hz에서 2500V/cm의 전계 크기를 가진 100마이크로초의 80개의 펄스를 전송함으로써 이를 달성했다.현재 AngioDynamics, Inc. 및 VoltMed, Inc.를 포함한 많은 기업이 임상 환경 내에서 불가역 일렉트로포레이션 기반 기술을 지속적으로 개발하고 도입하고 있습니다.

의료 적용을 위한 전기 검사를 최초로 검토한 그룹은 구스타브 루시 연구소의 Lluis M Mir가 이끌었다.이 경우, 그들은 불침투성 고분자와 함께 가역 전기 분자의 사용을 검토했다.나노초 펄스가 인간의 세포에 어떻게 사용될 수 있는지를 연구한 최초의 연구는 이스턴 버지니아 의과대학과 올드 도미니언 대학의 연구자들에 의해 수행되었고 [20]2003년에 발표되었다.

의료 응용 프로그램

주요 기사:불가역 일렉트로포레이션

전기 투과성의 첫 번째 의학적 응용은 [21]종양 결절에 투과성이 낮은 항암제를 도입하기 위해 사용되었다.곧 유전자 전기이식은 저렴한 비용, 실현의 용이성, 안전성 때문에 특별한 관심사가 되었다.즉, 바이러스 벡터는 DNA [22]전이를 위해 사용될 때 면역원성 및 병원성 측면에서 심각한 한계를 가질 수 있다.

돼지에게서 더 높은 전압의 전기 분해가 발견되어 주변 세포는 영향을 받지 않으면서 좁은 범위 내에서 회복할 수 없는 표적 세포를 파괴하였다. 따라서 암,[23] 심장병 및 조직의 제거가 필요한 다른 질병 상태에 대한 유망한 새로운 치료법이 제시되었다.돌이킬 수 없는 전기절제술(IRE)은 그 이후로 인간 암 치료에 효과가 있는 것으로 입증되었으며, 존스 홉킨스와 다른 기관의 외과의사들은 이전에 절제할 [24]수 없는 것으로 여겨졌던 췌장암을 치료하기 위해 현재 이 기술을 사용하고 있다.

또한 전이성 흑색종 환자의 유전자 전기 전달 임상 1상이 보고되었다.[25][26]인터류킨-12(pIL-12)를 코드하는 플라스미드 유전자의 일렉트로포레이션 매개 분만을 실시하여 안전성, 내구성 및 치료 효과를 모니터링하였다.연구는 pIL-12에 의한 유전자 전기이식은 안전하고 잘 견뎌낸다는 결론을 내렸다.또한 원격 비치료 전이에서도 부분적 또는 완전한 반응이 관찰되어 전신 치료 효과를 시사했다.이러한 결과를 바탕으로 이미 2단계 임상 연구로 진행할 계획입니다.현재 유전자 전기 [27]전달에 대한 몇 가지 임상 연구가 진행 중이며, 여기서 전기 펄스에 의해 투여되는 DNA 백신을 통한 면역의 안전성, 내구성 및 효과가 모니터링된다.

비록 그 방법이 체계적이지는 않지만, 엄밀하게는 국부적인 방법이지만, 그것은 여전히 유전자 전달을 위한 가장 효율적인 비바이러스 전략이다.

N-타이어

N-TIRE라고 불리는 최근의 기술은 많은 다른 종류의 종양과 다른 원치 않는 조직을 성공적으로 치료하는 것으로 입증되었다.이 절차는 대상 조직 내부 또는 주위에 배치된 작은 전극(직경 약 1mm)을 사용하여 사전 설정된 전압 및 주파수로 짧고 반복적인 전기 버스트를 적용합니다.이러한 전기 버스트는 대기막 통과 전위(TMP)를 증가시켜 플라즈마 막에 나노포어가 형성되도록 합니다.조직에 인가되는 전류가 대상 조직의 전계 역치 이상일 때, 세포는 나노포어의 형성에 의해 영구적으로 투과할 수 있게 된다.그 결과 세포는 손상을 복구하지 못하고 항상성의 [28]상실로 죽는다.N-TIRE는 주변 조직에 열 손상을 일으키지 않는다는 점에서 다른 종양 절제 기술에 고유한 것입니다.

가역 일렉트로포레이션

반대로 가역전극은 전극에 인가된 전류가 대상 조직의 전계역치 이하일 때 발생한다.인가되는 전기가 세포의 한계치보다 낮기 때문에, 그것은 세포가 인지질 이중층을 복구하고 정상적인 세포 기능을 계속할 수 있게 해준다.가역 전기 절단은 전형적으로 약물이나 유전자 (또는 세포막에 정상적으로 투과되지 않는 다른 분자)를 세포에 주입하는 것과 관련된 치료로 이루어진다.모든 조직이 동일한 전계 임계값을 갖는 것은 아닙니다. 따라서 치료 전에 안전과 효과를 [29]보장하기 위해 신중한 계산이 필요합니다.

N-TIRE를 사용하는 한 가지 주요 장점은 신중한 계산에 따라 올바르게 수행될 경우 대상 조직에만 영향을 미친다는 것입니다.단백질, 세포외 매트릭스, 그리고 혈관이나 신경과 같은 중요한 구조들은 모두 이 치료법에 의해 영향을 받지 않고 건강하게 남는다.이것은 빠른 회복을 가능하게 하고, 죽은 종양 세포를 [30]건강한 세포로 더 빠르게 대체할 수 있게 해준다.

시술을 하기 전에, 과학자들은 정확히 무엇을 해야 하는지 계산하고 각각의 환자를 사례별로 치료해야 한다.이를 위해 CT 스캔과 MRI와 같은 영상 기술을 사용하여 종양의 3D 이미지를 만듭니다.이 정보로부터, 종양의 부피를 근사해, 소프트웨어 기술을 사용해 전극의 삽입 부위, 전극이 삽입되는 각도, 필요한 전압등을 포함한 최선의 행동 방침을 결정할 수 있습니다.종종, CT 기계는 시술 중에, 특히 [31]뇌에서 종양을 치료하기 위해 사용되는 전극의 배치를 돕기 위해 사용됩니다.

전체 절차는 매우 빠르며 일반적으로 5분 정도 소요됩니다.이러한 시술의 성공률은 높고[32] 인간의 향후 치료에 매우 유망하다.N-TIRE를 사용하는 것의 한 가지 단점은 전극으로부터 전달된 전기가 근육세포를 수축시킬 수 있고, 상황에 따라 치명적인 결과를 초래할 수 있다는 것이다.따라서 시술 시 반드시 마비제를 사용해야 합니다.이러한 연구에 사용된 마비제들은 성공적이지만[citation needed], 마취제를 사용할 때는 경미하지만 항상 위험이 있다.

고화질

보다 최근의 기술은 고주파 불가역 일렉트로포메이션(H-FIRE)이라고 불리는 것이 개발되었습니다.이 기술은 단극성 버스트의 저주파가 아닌 전극을 사용하여 고주파수의 양극성 버스트를 적용합니다.이런 유형의 시술은 N-TIRE와 동일한 종양 절제 성공입니다.그러나 H-FIRE는 환자의 근육수축을 유발하지 않기 때문에 마비제가 [33]필요하지 않다는 분명한 장점이 있다.또한,[34] H-FIRE는 더 높은 주파수에서 조직의 전기적 특성 차이가 작기 때문에 더 예측 가능한 애블레이션을 생성하는 것으로 입증되었다.

약물 및 유전자 전달

전기 탐사는 또한 세포막을 일시적으로 투과시키는 짧고 강한 전기 펄스를 적용하여 세포막을 통해 전달되지 않는 분자의 수송을 가능하게 함으로써 약물과 유전자를 세포로 전달하는데 도움을 줄 수 있다.운반할 분자가 화학요법제일 경우 전기화학요법, 운반할 분자가 DNA일 경우 유전자 전기이식을 말한다.카롤린스카 연구소와 옥스퍼드 대학의 과학자들은 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 화학요법제, 단백질을 계통적으로 주입한 후 뉴런에 전달하기 위해 엑소좀의 전기회로를 사용한다.이러한 엑소좀이 혈액 뇌 장벽을 넘을 수 있기 때문에, 이 프로토콜은 중추 신경계에 대한 약물의 불충분한 전달 문제를 해결할 수 있고,[35] 알츠하이머, 파킨슨병, 그리고 뇌암을 잠재적으로 치료할 수 있습니다.

세균의 변형은 일반적으로 생명공학이나 의학에 필요한 특정 단백질을 대량으로 만드는 가장 쉬운 방법이다.유전자 전기이식은 매우 간단하고, 빠르고, 매우 효과적인 기술이기 때문에, 그것은 처음에 다른 변형 [36]과정을 위한 매우 편리한 대체가 되었다.

최근의 연구는 충격파가 전기절제 [37][38]전에 세포막을 전처리하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.이 상승 전략은 외부 전압 요구량을 줄이고 더 큰 모공을 만드는 것으로 나타났습니다.또한 충격파를 적용하면 스코프가 원하는 멤브레인 부위를 목표로 할 수 있습니다.이 시술은 모공의 크기를 조절할 수 있습니다.

물리적 메커니즘

소수성 기공(위)과 친수성 기공(아래)에서의 지질 이론적인 배치를 보여주는 개략적인 단면.
상세 정보:지질 이중층 역학

전기 포영은 DNA와 같은 큰 고전하 분자를 세포에 도입할 수 있게 하는데, 이것은 결코 소수성 이중층 코어 [1]전체에 수동적으로 확산되지 않을 것입니다.이 현상은 이 메커니즘이 [39]막에 nm 크기의 물을 채운 구멍을 만드는 것임을 나타냅니다.전기포자는 액체[40] 계면 양층 및 거대 [41]단층 소포와 같은 지질 양층 모델에서 광학적으로 이미징되었으며, 거대 단층 소포에 액틴 네트워크와 같은 세포골격계 단백질을 추가하는 것은 눈에 보이는 전기포체의 [42]형성을 막는 것으로 보인다.세포막 투과성을 조절하는 액틴 네트워크의 실험적 증거도 나타났다.[43]전계 및 유전체 파괴는 모두 전계의 적용에 의해 발생하지만 관련된 메커니즘은 근본적으로 다릅니다.유전체 파괴 시 장벽 재료는 이온화되어 전도성 경로를 형성합니다.따라서 재료의 변화는 본질적으로 화학적인 것이다.이와는 대조적으로, 전기 탐사 중에 지질 분자는 화학적으로 변화하지 않고 단순히 위치를 바꾸며, 물로 채워질 때 이중층을 통과하는 전도 경로로 작용하는 모공을 연다.

일렉트로포레이션은 세포막의 각 지점에서 국소적인 막전압에 따라 달라지는 동적 현상이다.일반적으로 주어진 펄스 지속시간 및 형태에 대해 전기화 현상(0.5V~1V)의 발현을 위한 특정 막간전압 임계값이 존재하는 것으로 간주된다.이를 통해 전계 크기 임계값(Eth)이 정의된다.즉, EeE가th 전기 분해되는 영역 내의 세포만 해당됩니다.만약 두 번째 역치ir(E)에 도달하거나 초과한다면, 전기 분해는 세포의 생존력, 즉 불가역 전기 분해([44]IRE)를 손상시킬 것이다.

일렉트로포레이션은 여러 단계를 [45]거치는 다단계 프로세스입니다.먼저 짧은 전기 펄스를 인가해야 합니다.일반적인 매개변수는 < 1 ms의 멤브레인 전체에 대해 300 – 400 mV이다(참고- 셀 실험에 사용되는 전압은 일반적으로 벌크 용액에 먼 거리에 걸쳐 적용되기 때문에 실제 멤브레인 전체에 적용되는 자기장은 적용된 바이어스의 극히 일부에 불과하다).이 전위를 적용하면 막은 주변 용액에서 이온의 이동을 통해 콘덴서처럼 충전됩니다.일단 임계장이 달성되면 지질 형태학에서 빠른 국소적 재배치가 이루어진다.결과적으로 생기는 구조는 전기적으로 전도성이 없지만 전도성 [46]기공의 생성으로 빠르게 이어지기 때문에 "사전 포어"로 여겨진다.이러한 프리 포어의 존재에 대한 증거는 대부분 모공의 "점멸"에서 나오는데, 이것은 전도 상태와 절연 [47]상태 사이의 전환을 암시합니다.이러한 프리 포어는 소수성 결함(약 3Ω)이 작은 것으로 제안되었다.만약 이 이론이 맞다면, 전도성 상태로의 전환은 모공 가장자리에서 지질 헤드가 접혀 친수성 계면을 만드는 재배열로 설명될 수 있습니다.마지막으로, 이러한 전도성 모공은 치유되고, 이중층을 다시 봉합하거나 팽창하여 결국 파열시킬 수 있습니다.결과적으로 발생하는 운명은 임계 결함 크기가 초과되었는지[48] 여부에 따라 달라지며, 이는 다시 적용된 필드, 국부 기계적 응력 및 양층 가장자리 에너지에 따라 달라집니다.

유전자 일렉트로포레이션

Electrogenetransfer.JPG

셀에 충분한 강도의 전기 펄스를 가하면 막간 전위차가 증가하여 막의 불안정화를 일으킨다.세포막 투과성이 증가하며, 그렇지 않으면 비투과성 [49][50]분자가 세포로 들어간다.유전자 전기 전달의 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았지만, DNA의 도입은 음극과 마주보는 막의 일부에서만 일어나고 성공적인 전달을 위해 몇 가지 단계가 필요한 것으로 나타났다: DNA의 세포로의 전기영동 이동, 막으로의 DNA 삽입, thr를 가로지르는 위치.e막, 핵으로 향하는 DNA 이동, 핵 외피 전체에 걸친 DNA 이동, 그리고 마지막으로 유전자 발현.[51]온도, 전기 펄스의 매개 변수, DNA 농도, 사용된 전기 생성 완충제, 세포 크기 및 트랜스 [52]감염 유전자를 발현하는 세포의 능력과 같은 유전자 전기 전달의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인이 있습니다.생체 내 유전자 전기 전달에서는 세포 외 기질을 통한 DNA 확산, 조직의 특성 및 전체 조직 전도율도 중요하다.[53]

역사

1960년대에는 외부 전계를 적용하면 셀의 두 극에 큰 막 전위를 만들 수 있다고 알려져 있었다.1970년대에 막 전위가 위험 수준에 도달하면 막이 분해되어 [54]회복될 수 있다는 것이 발견되었다.1980년대까지 이 개구부는 다양한 물질/분자를 [55]세포에 도입하는 데 사용되었습니다.

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