클로스트리듐디피실독소B

Clostridium difficile toxin B
독소 B
C Diff ToxB 2BVM.png
PDB 엔트리 2BVM에서 [1]UDP 및 글루소스를 나타내는 C. 디피실글루코실전달효소 Toxin B의 구조.
식별자
유기체클로스트리듐 디피실
기호.톡스B
Alt.tcdB
엔트레즈4914074
PDB2 BVM
RefSeq(프로트)YP_001087135.1
유니프로트P18177
기타 데이터
EC 번호2.4.1.-
염색체게놈: 0.79~0.8Mb
TcdB독소N말단나선도메인
식별자
기호.TcdB_N
팜PF12918
TcdA/TcdB 촉매 글리코실전달효소 도메인
식별자
기호.TcdA_TcdB
팜PF12919
펩티드가수분해효소 C80 패밀리
식별자
기호.펩티드가수분해효소_C80
팜PF11713
인터프로IPR020974
TcdA/TcdB 모공 형성 도메인
식별자
기호.TcdA_TcdB_pore
팜PF12920
TCDB1. C.57
OPM 슈퍼 패밀리199
OPM단백질6분기

클로스트리듐 디피실 독소 B는 클로스트리듐 디피실이라고 알려진 클로스트리디오이데스 디피실 박테리아에 의해 생성된 세포독소이다.C. 디피실(difficile)에 의해 생성되는 두 가지 주요 독소 중 하나이며, 다른 하나는 관련된 장독소(Toxin A)입니다.둘 다 매우 강력하고 [2][3]치명적이다.

구조.

독소 B(TcdB)는 분자량이 270 kDa이고 등전점 pl이 4.[4]1인 세포독소이다.독소 B는 촉매, 시스테인 단백질 분해효소, 전위 및 수용체 [5]결합의 네 가지 다른 구조적 도메인을 가지고 있습니다.N 말단 글루코실전달효소 촉매 도메인은 아미노산 잔류물 1~544를 포함하고, 시스테인 단백질 분해효소 도메인은 잔류물 545~801을 포함한다.또한 전위 영역은 802~1664의 아미노산 잔기를 포함하고 수용체 결합 영역은 C 말단 영역의 일부이며 1665~[5]2366의 아미노산 잔기를 포함한다.

TcdB 단백질 배열의 개략도 이미지.파란색으로 표시된 촉매 영역은 잔류물 1~543개, 검은색으로 표시된 시스테인 단백질 분해효소 영역은 잔류물 544~801개, 빨간색으로 표시된 전위 영역은 잔류물 802~1664개, 녹색으로 표시된 수용체 결합 영역은 잔류물 1665~2366개를 포함한다.

독소 B의 글리코실화 활성은 N 말단 촉매 영역(잔류 1~544)에서 발생한다.이 영역은 세포독성 [6]활성과는 무관하게 기질을 글리코실화한다.단, 수용체 결합 영역의 작은 결실은 독소 B [6]활성의 감쇠를 일으킨다.전위 영역은 소수성 줄기와 같은 구조를 포함하고 있으며, 이는 [5]모공을 가로지르는 막 형성에 잔류물 958–1130을 도울 수 있다.C 말단 반복 영역(CRR)을 포함하는 수용체 결합 영역은 TcdB 막 상호작용을 증가시키지만 모공 형성에 [7]참여하지 않습니다.또한 시스테인 단백질 분해효소 및 전위 영역은 모두 전위 및 수용체 [8]결합에 중요한 기능적 역할을 하는 복잡한 구조를 가지고 있다.그러나 아미노산의 전위 영역을 삭제하면 세포독성 활성이 4배 감소한다.시스테인 단백질 분해효소 및 대부분의 전위 부위는 TcdB 및 세포막을 [8]가로지르는 다른 독소에 대한 접근을 보여주는 소수성 단백질을 가지고 있습니다.

수용체 결합 도메인

TcdB의 C 말단(그림 2의 녹색 영역)에는 아미노산 잔기 1831–2366을 [9]포함하는 복합 반복 올리고펩타이드(CROPs)로 알려진 영역이 포함되어 있다.이러한 CROP는 아미노산의 19~24회, 아미노산, 독소 A 및 독소 [9][10]B의 약 31회(LRs)의 짧은 반복을 구성합니다.TcdB CROPS 영역은 19개의 SR과 4개의 LR로 구성됩니다.이 SRs 및 LRs 영역은 세포 [9]표면의 설탕 부분을 결합하는 데 도움이 되는 세포벽 결합 모티브의 형성을 가능하게 합니다.

정화

C. 디피실 세포배양에서 독소 B를 정제하기 위해 뇌심장 주입 육수를 사용하는 것은 독소 [11]B의 합성을 촉진하기 때문이다.여과방법은 C. difficile의 상등액에서 독소 B의 정화를 용이하게 한다.상등액의 독소 농도는 생물 세포 수에 비례한다.많은 연구에서 대부분의 독소는 후기 로그 단계 또는 초기 정지 단계에서 방출되므로 독소 B는 [2]세포에 의해 지속적으로 분비된다.독소 B를 정제하는 데는 여러 가지 방법이 있지만, 대부분의 연구는 겔 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피 대신 초여과된 황산암모늄 농도 또는 침전을 포함하는 방법을 사용한다.또, 이온 교환 크로마토그래피법의 효과는, TcdA와 TcdB의 구별에 도움이 된다.

기능.

글루코실전달효소(glucosyl transferase)의 촉매 트레오닌 잔기가 표적 세포 내부의 Rho 패밀리, Rac 및 Cdc42와 같은 작은 GTPas군을 비활성화하면 신호 전달 메커니즘이 교란되어 액틴 세포골격, 세포 접합부 및 아포토시스(apotosis)의 기능 부전으로 이어진다.[12][13][14]Rho는 액틴 응력 섬유의 활성을 유도한다.라크 단백질은 막 러플링과 NADPH-옥시다아제 호중구의 활동을 조절한다.Cdc42는 필로포디아의 F액틴 필라멘트 형성을 조절한다.

세포독성

그림 3: 독소 B는 세포 구조의 동력을 변화시킨다.SEM: a) 제어 세포 및 b) TcdB로 18시간 동안 처리된 세포 이미지.검은색 화살표는 셀 표면 블리딩 위치를 나타냅니다.

포유동물 세포에서 TcdB의 존재가 세포 형태학과 세포 신호 전달에 빠른 변화를 가져온다는 것이 여러 연구에서 입증되었다.짧은 시간 내에, 세포는 TcdB와 TcdA의 작은 용량으로 플라크의 모습을 보인다.게다가 세포의 죽음은 세포가 중독된 후 이러한 독소의 주요 영향이다.Donta 등에 의한 연구는 TcdB가 중국 햄스터 난소 세포, 인간 자궁경부 상피 세포, 쥐 부신 세포, 쥐 간 세포 및 쥐 성상 세포와 같은 다른 포유동물 세포에 심각한 영향을 미친다는 것을 전달하였다(그림3).[15][16]

세포독성 활성은 세포유형에 기초하며, 세포유형은 4배에서 200배까지 다양할 수 있다.일반적으로 세포가 TcdB에 감염되면, 그들은 구조적인 건전성뿐만 아니라 F-actin 필라멘트의 [17]감소도 잃는다.TcdB에 의한 세포 반올림은 2시간 이내(그림4), 세포 사멸에 관한 한 약 24시간이 [15]소요될 수 있다.클로스트리듐 디피실 관련 설사(CDAD)와 관련하여 세포는 일단 세포골격 액틴 필라멘트의 무결성을 잃으면 정상적인 기능도 상실하기 때문에 세포병성 효과는 실제 세포사보다 더 중요하다.

그림 4: 쥐 성세포에 대한 독소 B의 영향.이는 37°C에서 2시간 동안 100ng/ml의 독소 B로 배양된 쥐 성상세포의 가능한 예이다.

소규모 GTPas에 대한 영향

숙주 세포 내에서 TcdB에 의한 세포독성 활성의 원인은 주로 수용체[citation needed] 엔도사이토시스를 통해 매개된다.산성 엔도솜은 독소 B가 세포로 들어갈 수 있게 한다.이 현상은 독소가 숙주[citation needed] 세포로 들어갈 수 있도록 하는 결합 수용체 영역에 의해 일어난다.TcdB는 숙주세포의 세포질 접근성을 통해 예를 들어 Rho 패밀리 멤버 Rac 및 Cdc42의 트레오닌 35 및 Rho의 [18][19]트레오닌 37의 글리코실화 과정에 의해 소량의 GTPase(그림 5)를 비활성화한다.이러한 Rho GTPases는 액틴 세포골격의 구성을 담당하는 진핵세포의 세포골격에서 널리 발견되는데, 이는 세포 반올림 및 막 블리딩의 결과로 액틴 필라멘트의 축합을 유발하기 때문이다(그림 3). 이는 궁극적으로 아포토시스(apoptosisis)[20][21]로 이어진다.TcdB는 세포 역학과 형태학에 중요한 변화를 일으킨다.그림 3은 세포 표면에 대한 독소 B의 영향을 나타낸다; 막 블리핑(검은 화살표).[22]또한 TcdB는 Rho GTPases를 비활성화한다.그 결과 세포 접합이 파괴되어 독소 B의 상피 투과성과 내강 내 유체 축적이 향상된다.클로스트리듐 디피실 관련 설사(CDAD)에 걸리는 주요 원인물질 중 하나이다(그림 5).[23][24]

그림 5: TcdB에 의한 세포내 변형먼저 Toxin B는 세포 표면에 결합하고 수용체 매개성 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 내부화된다.둘째, 엔도솜의 산성화는 GTD가 전위되는 모공의 형성을 유발한다.셋째, UDP-포도당에 의한 흡수는 GTPases에 결합하고 세포로 방출하는 것을 돕는다.마지막으로 GTD 글루코실화 Rho족 GTPases를 세포막으로 하여 전사조절 및 최종적으로는 세포의 아포토시스를 제어한다.

또한 UDP-포도당의 TcdB에 의한 가수분해 속도는 TcdA의 [25]약 5배이다.언제 TcdB 화법과 다른 작은 GTPases에 묶어 여러 연구에 의하면, 화법은 플라스마 막의 세포질 쪽에서 발생한다 prenylation과 carboxymethylation를 통해 번역 후 변형을 표시했습니다, 따라서, GTP의 GDP.[26]에 교환, 화장실에 가야 해 GDPGTP-bound(적극적인)에 GDP-bound(inactiv 것 hydrolyzes.e)(그림 5).또한 이 교환 활성은 세포의 [27]세포질에서 구아닌 인자에 의해 조절된다.

신호 경로 장애

Rho, Rac 및 Cdc42의 세포조절은 세포골격의 액틴 필라멘트 부근에 영향을 미치며(그림 4),[17] 이러한 작은 GTPases는 mitogen-activated protein kinase(MAPKs)[28]를 통해 신호를 조절하는 세포주기에 통합된다.액틴 필라멘트에 관여하지 않는 세포의 일부 생리적인 부분은 당장 세포 반올림이나 세포 사멸을 일으키지 않을 수 있지만, 하류 경로 활동에서는 액틴 필라멘트의 악화와 마지막으로 세포 [17]사멸을 초래할 수 있다.

1993년 쇼산 등에 의해 수행된 연구는 TcdB를 가진 세포가 포스포리파아제 A2 활성을 변화시켰다는 것을 보여주었다.이것은 액틴 세포 [29]골격의 교란으로부터 독립된 사건이었다.쇼산 외 연구진은 또한 TcdB가 포스포리파아제 [29]D를 통해 Rho 단백질을 비활성화함으로써 수용체 신호 전달 활성을 억제했음을 보여주었다.

모공 형성

TcdB는 클로트린 매개 엔도사이토시스([30]Clathrin-mediated endocytosis)를 통해 세포 내부에 접근하며, 독소 B가 세포체의 일부일 때 글루코실전달효소는 내막을 통과하여 pH를 감소시키고 전이를 유도하며, 최종적으로 전위영역 잔기의 형태학적 변화를 초래한다(958~1130).[31]소수성 영역은 숙주막에 내장되어 글루코실전달효소 도메인이 [31]통과할 수 있는 모공을 형성합니다.세포가 산성 환경에서 TcdB에 감염되면 독소를 감소시켜 형태 재배열을 일으킨다(그림 6).[31]산성 pH의 결과로 TcdB는 트립토판의 원래 형광, 단백질 분해효소 감수성 및 소수성 [31]표면에서 명확한 차이를 보인다.또 다른 그룹은 산성화가 독소의 구조 변화를 가져오고, 더 중요한 것은 [7]모공을 형성하는데 도움을 준다는 것을 보여주었다.추정 전위 영역(그림 2)은 약 801~1400개의 아미노산을 구성하며, 이 중 잔류물 958~1130은 소수성으로 막 통과 [20]기공을 형성한다.대부분의 연구는 C. 디피실 [31]독소의 모공 형성 활성을 나타내기 위해 TcdB 균주 630을 사용했다.

pH에 의해 유발됨

TcdB의 단백질 분해 분해 효과가 세포 표면에서 일어나는지 산성 엔도솜에서 일어나는지 알아보기 위해 연구는 엔도솜의 v형 H-ATPases를 차단하는 것으로 알려진 바필로마이신 A1을 사용했다.이것은 엔도솜의 [31]산도를 감소시킨다.TcdB의 생리학적 흡수 경로는 TcdB에 [31]의한 세포변성 활성을 방지한다.37℃에서 TcdB를 세포 표면에 결합시킨 후 5분간 세포들이 산성 상태(pH 4.0)일 때 형상 재배열과 반올림 현상이 관찰되었다.그러나 유사한 매개 변수를 사용하여 중성 pH(7.0)에서 추가로 1시간 동안 둥근 세포를 배양한 경우에는 반올림이 [15][31]관찰되지 않았다.두 연구 모두 독소 B가 단백질 분해 분열 특성을 가지고 있다는 것을 보여주었는데,[7][15][31] 이것은 세포에 접근하는 데 매우 중요하다.산성 엔도솜 pH가 있으면 TcdB의 위상변화가 일어난다(그림 6).[7]

그림 6: TcdB의 조직 도메인중성 pH와 산성 pH의 차이를 나타낸다(4).

유전학

TcdB 단백질을 코드하는 유전자 tcdB는 염색체 영역인 19.6kb 내에 위치한다.이는 병원성 또는 PaLoc의 궤적으로 알려져 있습니다(그림 2).[32][33]tcdB의 ORF(Open Reading Frame) 길이는 7,[17]098 뉴클레오티드입니다.PaLoc 영역의 주요 독소 유전자 외에 PaLoc 영역에는 tcdR(L), tcdC(R) 및 tcdE의 세 가지 부가 유전자가 있다는 것을 언급하는 것이 중요하다.이 유전자들은 TcdA와 TcdB 발현을 조절하는데 도움을 준다.그들은 또한 [17]세포에서 독소를 분비하거나 배출하는 것을 돕는다.tcdB와 tcdA 사이에 위치한 코드 유전자 tcdE는 홀린 단백질과 유사하므로 TcdE는 TcdA의 방출 또는 분비를 촉진하는 촉진제 유전자로 작용하여 숙주 세포막의 [17]투과성을 증가시킨다.

그림 2: C. 디피실 감염 CDI에 관여하는 대형 클로스트리디얼 독소(LCT)를 암호화하는 전형적인 병원성 궤적(PaLoc)

독소 검출

C. 디피실에는 다양한 플라스미드의 크기가 있습니다.검출된 분자량은 2.7x106~100x10이지만6 플라스미드 크기는 독성과 상관관계가 없다.C. 디피시일의 독소 B를 검출하기 위해 임상의는 PMC [2][3]환자의 대변 시료에서 유래한 세포 배양 어세이(cell culture assay)를 광범위하게 사용한다.세포배양측정법은 소량의 독소 B가 세포 라운딩을 일으킬 수 있기 때문에 C. 디피실 독성을 검출하기 위한 "골드 스탠다드"로 간주되며(그림 4), TCDB에 [2][3]의한 CDAD와 상관관계를 갖는 것이 임상실험실의 큰 장점이다.PMC 환자 대변 검체에서 대형 클로스트리디얼 독소(LCTs)의 세포독성 활성이 발견되었지만, 독소 B의 활성은 독소 [2]A에 비해 더 해로운 세포독성 효과가 있었다.따라서 독소 A는 독소 [2][3]B에서 분리되지 않을 때 활성이 감쇠된다.C. 디피실 독성의 검출은 매우 민감하지만, 세포 배양 분석을 사용하면 임상 실험실에서 이 문제를 극복할 수 있습니다. 즉, 독소 B를 1pg/mL만큼 적게 사용하면 세포 [2][3]반올림을 일으키기에 충분합니다.이는 배양 조직 분석을 사용하여 PMC [2]환자의 독성을 검출하는 데 있어 가장 큰 장점입니다.임상 실험실에서 PMC 환자의 대변에서 독소 B의 세포독성 활성을 검출하기 위해 검사 마이크로미터 플레이트 효소 연결 면역흡수제(ELISA) 및 기타 기술을 사용하려고 시도했지만 결과는 세포 배양 측정이 사용된 [2][3][34]것만큼 정확하지 않습니다.

생산 요인

연구 결과에 따르면 배양 배지에 항균제(예: 클린다마이신)를 첨가함으로써 C. 디피실 배양에서 세포독성 활성이 4~[35][36]8배 증가하였다.게다가, PMC의 원인에 대한 항생제의 역할을 알고 있기 때문에, 많은 초기 연구들은 독소의 항균제 생산 효과에 초점을 맞췄다.그 결과, 연구는 반코마이신과 페니실린의 억제되지 않는 성질이 C.[37] 디피실린의 배양에서 독소 생성을 증가시키고 있다는 결론을 내릴 수 있었다.독소 생성량은 유기체의 배지 사용과 관련이 있었다.또 다른 연구는 TcdB의 높은 수준의 독소 생산이 뇌와 심장 주입 [38][39]육수와 같은 복합 매체에서 관찰되었음을 보여주었다.고독성 독소를 분리하여 높은 수준의 독소가 생성되었다.반대로, 약한 독성의 분리를 통해 낮은 수준의 독소가 생성되었다.따라서 독소의 생산이 공동 조절되었음을 알 수 있다.독소를 발현하는 신호를 조절하는 데 환경이 관여하는 메커니즘은 이해되지 않지만, 시험관내 연구에 따르면 독소의 발현은 이화물 억제와 스트레스(예:[40][41][42] 항생제)에 의해 강화된다.또 다른 연구는 잘 특징지어지는 배지에서 비오틴을 제한하면 TcdB의 생산량이 64배, TcdA의 생산량이 35배 증가한다는 것을 보여주었다.이것은 C. 디피실 및 0.05nM의 [41]작은 비오틴 용량으로 수행되었다.몇몇 다른 초기 연구들은 독소의 생산이 TcdA나 TcdB의 [42]스트레스나 이화물 억제와 관련이 있다는 이론을 반대해왔다.또한, 많은 연구들이 다른 연구들과 다른 주요 이유는 C. 디피실 분리주에서는 독소 생산이 발생하지 않기 때문이라고 말한다.

임상적 의의

많은 초기 연구들은 독소 A가 항생제 관련 설사(AAD)를 일으키는 주요 독소 단백질이라고 제안해 왔다. 하지만 지난 10여 년 동안의 연구 과학자들은 독소 B 또는 TcdB가 어느 누가 예상했던 것보다 질병에서 더 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다.이를 통해 독소 B는 혈관 투과성을 높이고 출혈을 유도하는 장상피세포의 단단한 접합부를 여는 주요 독성 인자로 밝혀졌다.따라서 종양괴사인자α(TNFα)와 염증성 인터류킨이 가성대장염(PMC)과 항생제 관련 설사(AAD)[2][3][43]의 주요 원인물질로 확립된다.

독소 A와 독신 B의 관여는 C. 디피실(difficile)에 의해 야기되는 질병을 결정하는 핵심 요소이다.임상 실험실은 항체와 세포독성 [44]검사를 바탕으로 환자의 대변에서 이러한 독소를 확인했다.이러한 박테리아 독소는 Clostridium sordelii 출혈 독소(TcsH), 치사 독소(TcsL) 및 Clostridium novi 알파 독소(Tcnα)와 관련이 있는 것으로 나타나므로 이 코호트는 독소 클로스트리디알의 큰 패밀리이다.[17]이러한 독소의 유사성 때문에, 연구원들은 그것들을 대형 클로스트리디얼 독소(LCTs)[9]의 과로 분류했다.

TcdB를 가진 베즐로톡수맵의 메커니즘

베즐로톡수맵은 클로스트리듐 디피실 감염의 재발 방지를 위해 설계된 인간 모노클로널 항체이다.TcdB의 N말단의 X선 결정화 구조에 의해 독소는 글루코실전달효소 도메인(GTD), 시스테인단백질가수분해효소(CROP) 도메인의 3개 도메인으로 구성된다.베즐로톡수맵은 TcdB의 CROP 도메인 내의 2개의 상동성 부위에 특이적으로 결합한다.X선 결정학에 의한 구조 분석 결과, 항체 결합이 부분적으로 추정 탄수화물 결합 포켓을 막는 것으로 나타났다.베즐로톡수맵은 포유동물 [45]세포에 대한 TcdB의 결합을 차단한다.

가성 대장염의 역할

PMC 질환의 초기 단계에서, 많은 연구들은 TcdA가 TcdB보다 더 강력하다고 추측해왔다.이는 TcdA의 독소 생산이 항생제 맹장염을 [38][46]가진 TcdB보다 더 심각했던 생체 내 실험에서 추론되었다.나중에, 몇몇 연구들은 TcdB가 PMC와 ADD의 질병에서 주요한 역할을 한다는 것을 보여주었다.이 연구는 C. 디피실(C. difficile)이 TcdA를 생성하지 않았음에도 불구하고 여전히 [47]TcdA의 증상을 보인다는 것을 증명했다.또한 TcdB의 정제된 형태는 TcdA에 비해 더 치명적인 장독소이며, 장상피가 심각하게 손상되어 급성 [48]염증 반응을 일으킨다는 것이 이후 연구에서 밝혀졌다.독소에 대한 더 나은 이해로, 연구원들은 TcdB가 TcdA보다 CDI를 유발하는 주요 독성 인자라고 말할 수 있었다.그러나 TcdA가 장에 존재하면 TcdB의 활동이 보다 광범위한 영향을 미치도록 촉진하여 결과적으로 여러 장기 [49]시스템에 영향을 미칩니다.게다가, 햄스터들이 TcdA에 대한 예방접종을 받았을 때, 그것은 햄스터들이 C. 디피실 질병으로부터 완전히 보호되지 않았다는 것을 보여주었고, TcdB가 매우 치명적이고 [50]강력하다는 결론을 내리기 위한 이 리드 연구들이 있었다.또한 소량의 TcdA와 치사량의 TcdB를 정맥 내 또는 복강 내 주입하는 것은 동물의 죽음을 초래하는 데 충분한 것으로 입증되었다.따라서 TcdA는 [50]장에서 나오는 TcdB의 촉진제 역할을 합니다.

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레퍼런스

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