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Epigenomics
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후생유전학은 후생유전자로 알려진 세포의 유전물질에 대한 완전한 후생유전학적 변형에 대한 연구이다.이 분야는 [1][2]세포의 게놈과 프로테옴을 연구하는 유전체학 및 프로테오믹스와 유사하다.후생유전학적 변형은 DNA [3]서열을 바꾸지 않고 유전자 발현에 영향을 미치는 세포의 DNA나 히스톤에 대한 가역적 변형이다.후생유전체 유지는 지속적인 과정이며 DNA [4][5]수복과 같은 중요한 생물학적 메커니즘에 참여함으로써 진핵생물 게놈의 안정성에 중요한 역할을 한다.식물성 플라본은 [6]암을 유발하는 후생유전학적 표시를 억제한다고 알려져 있다.가장 특징적인 후생유전학적 변형 중 두 가지는 DNA 메틸화와 히스톤 변형이다.후생유전학적 변형은 유전자 발현과 조절에 중요한 역할을 하며 분화/발달과[7] 종양유전 [8]등 수많은 세포과정에 관여한다.전지구적 수준의 후생유전학 연구는 최근에야 게놈의 높은 처리량 [9][7]분석을 통해 가능해졌다.

후생유전학개론

표현형 가소성 또는 자극에 반응하여 세포의 상태를 변화시키는 능력을 지배하는 메커니즘은 오랫동안 연구 대상이 되어 왔다(Phenotype 가소성 1)생물학의 전통적인 중심 교의는 세포의 DNA가 세포의 과정과 [10]기능을 수행하는 단백질로 번역되는 RNA로 전사된다고 말한다.그러나 역설은 세포가 다양한 자극에 대해 다양한 반응을 보이고 다세포 유기체와 같이 동일한 DNA 세트를 공유하는 세포가 다양한 기능과 표현형을 [11]가질 수 있다는 점에서 존재한다.고전적인 관점에서는 표현형 변이가 이상 돌연변이나 유전 염기서열 대립 유전자에 [12]의한 1차 DNA 구조의 차이 때문인 것으로 보고 있다.그러나 이것이 변동의 일부 측면을 설명하기는 했지만, 분화와 같은 세포 반응이 얼마나 긴밀하게 조정되고 조절되는지는 설명하지 못한다.

세포 가소성의 보다 가능성이 높은 원천은 유전자 발현 조절을 통해서, 두 세포가 거의 동일한 DNA를 가질 수 있지만, 특정 유전자의 차이적 발현에 의해 변이가 발생한다.연구는 세포가 단백질 번역, 번역 후 처리 및 분해뿐만 아니라 mRNA 전사, 처리 및 운반의 여러 단계에서 유전자 발현을 조절할 수 있다는 것을 보여주었다.DNA, RNA 및/또는 단백질에 결합하는 조절 단백질은 이러한 과정의 핵심 효과인자이며,[13] 세포 내에서 특정 단백질 수준과 기능을 긍정 또는 부정적으로 조절함으로써 기능한다.또한 DNA결합전사인자가 세포반응의 특정 제어를 위한 메커니즘을 제공하지만, DNA결합전사인자가 유전자활동의 유일한 조절자인 모델도 가능성이 낮다.예를 들어, 체세포 핵이식에 대한 연구에서, 핵이 새로운 세포 환경으로 옮겨진 후에도 분화의 안정적인 특징이 남아있다는 것이 입증되었고, 이는 유전자 조절의 안정적이고 상속 가능한 메커니즘이 DNA 결합이 없는 상태에서 분화 상태를 유지하는 데 관여했음을 시사한다.전사인자를 [11]입력한다.

DNA 1차 구조를 변경하지 않고 유전자 발현에 영향을 미치는 DNA 메틸화 및 히스톤 변형이 안정적이고 유전가능하며 가역적인 과정이라는 발견과 함께 세포 유전자 발현에서 관찰된 가변성을 위한 메커니즘이 [12]제공되었다.이러한 변형은 후생유전학이라고 불리며, 후생유전학 1은 후생유전학이라는 유전물질 "DNA" 위에 있는 후생유전학이다.후생유전학적 수정을 지배하는 메커니즘은 복잡하지만, 높은 처리량 시퀀싱 기술의 등장을 통해 이제 이러한 메커니즘에 [12]대한 이해가 더욱 깊어지고 있습니다.

후생유전학

1차 DNA 배열의 수정에 기인할 수 없는 유전자 발현을 변화시키는 유전체 변형은 후생유전학적 변형으로 분류된다.DNA 메틸화와 히스톤 수식은 가장 잘 특징지어지는 후생유전 과정 [3]중 하나이다.

DNA메틸화

심층적으로 특징지을 수 있는 최초의 후생유전학적 변형은 DNA 메틸화였다.이름에서 알 수 있듯이, DNA 메틸화는 메틸기가 DNA에 첨가되는 과정이다.이 반응을 촉매하는 효소는 DNA메틸전달효소(DNMT)이다.DNA 메틸화는 안정적이고 유전성이 있는 반면, DNA 탈메틸라아제라고 알려진 효소들의 길항제 그룹에 의해 역전될 수 있다.진핵생물에서 메틸화는 CpG 디뉴클레오티드라고 불리는 구아닌에 인접한 시토신 [9][14]잔기(5mC)의 탄소 5 위치에서 가장 일반적으로 발견된다.

DNA 메틸화 패턴은 종마다 그리고 심지어 같은 유기체 내에서 매우 다양하다.동물들 사이에서 메틸화의 사용은 상당히 다르다. 척추동물은 최고 수준인 5mC를 보이고 무척추동물은 중간 수준인 5mC를 보인다.Caenorhabditis Elegans와 같은 몇몇 유기체는 5mC 또는 기존의 DNA 메틸전달효소를 가지고 있는 것으로 증명되지 않았다; 이것은 DNA 메틸화 이외의 다른 메커니즘도 [11]포함됨을 암시할 것이다.

유기체 내에서 DNA 메틸화 수준은 발달 과정과 지역에 따라 달라질 수 있습니다.예를 들어 생쥐 원시배아세포에서는 게놈 폭의 탈메틸화가 일어나기도 하며, 착상단계에 의해 메틸화 수치가 이전의 [11]체질값으로 되돌아간다.프로모터 영역인 전사 개시 부위에서 DNA 메틸화가 일어나면 유전자 발현을 억제하는 효과가 있다.이것은 활발하게 발현되는 [9]유전자와 연관된 비메틸화 프로모터 영역과는 대조적이다.

DNA 메틸화가 유전자 발현을 억제하는 메커니즘은 다단계 과정이다.메틸화 시토신 잔기와 비메틸화 시토신 잔기의 구별은 특정 DNA 결합 단백질에 의해 수행된다.이들 단백질의 결합은 RNA 중합효소 등의 전사기계에 대한 DNA의 접근이 어려워져 유전자 [15]발현을 효과적으로 억제하도록 염색질 리모델링을 개시하는 히스톤탈아세틸라아제(HDAC) 효소를 모집한다.

히스톤 수식

진핵생물에서, 게놈 DNA는 크로마틴이라고 불리는 단백질-DNA 복합체로 감겨진다.염색질에서 발견되는 단백질의 가장 일반적인 종류인 히스톤은 DNA를 응축하는 기능을 합니다; 히스톤의 순 양전하는 음전하를 띤 DNA와의 결합을 촉진합니다.염색질의 기본 단위이자 반복 단위인 뉴클레오솜은 히스톤 단백질(H2A, H2B, H3, H4)의 옥타머와 그것을 둘러싼 146bp 길이의 DNA로 구성됩니다.뉴클레오솜과 DNA는 직경 10nm의 크로마틴 섬유를 형성하며, 이는 더욱 [16][17]응축될 수 있다.

DNA의 염색질 포장은 세포 주기 단계와 국소 DNA [18]영역에 따라 다르다.염색질이 응축되는 정도는 특정 전사 상태와 관련이 있다.포장되지 않았거나 느슨한 크로마틴은 단단히 포장된 크로마틴보다 더 전사적으로 활성화되는데, 이는 전사 기계에 더 쉽게 접근할 수 있기 때문입니다.염색질 구조를 개조하여 DNA 패키징의 밀도를 변화시킴으로써 유전자 발현을 [17]변조할 수 있다.

염색질 리모델링은 핵심 히스톤 [19]단백질의 N 말단 꼬리의 번역 후 수정을 통해 일어난다.주어진 세포에서 히스톤 수정의 집합 집합을 히스톤 코드라고 합니다.아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴티네이션, SMOylation, ADP-리보실화, 탈아미네이션 및 프롤린 이성질화, 아세틸화, 메틸화, 인산화 및 유비퀴티네이션은 유전자 활성화에 관여하는 반면, 메틸화, 유비퀴티네이션, SMOY, 탈산화를 포함한 많은 다른 유형의 히스톤 수정이 알려져 있다.이미네이션과 프롤린 이성질화는 유전자 억제에 관련되었다.메틸화, 인산화 및 유비퀴티화를 포함한 여러 변형 유형은 수정되는 히스톤의 특정 아미노산에 따라 다른 전사 상태와 연관될 수 있습니다.또한 히스톤 수식이 일어나는 DNA 영역도 다른 효과를 이끌어낼 수 있다.예를 들어 리신 잔기 36(H3K36)에서 제3코어 히스톤의 메틸화이다.H3K36이 유전자의 코딩 부분에서 발생할 때, 그것은 유전자 활성화와 관련이 있지만, 프로모터 영역 [17]내에 있을 때는 그 반대이다.

히스톤 변형은 두 가지 메커니즘에 의해 유전자 발현을 조절한다: 뉴클레오솜 사이의 접촉의 파괴와 ATPase를 개조하는 염색질 모집.첫 번째 메커니즘의 예는 히스톤 아세틸전달효소(HATs)에 의해 촉매되는 리신 말단 꼬리 아미노산의 아세틸화 중에 발생한다.HAT는 활성제가 DNA 결합 부위에 결합할 때 염색질에 모집되는 다단백질 복합체의 일부이다.아세틸화는 음전하 DNA에 대한 친화력을 통해 염색질을 안정화시키는 데 관여한 리신의 염기성 전하를 효과적으로 중화시킨다.따라서 아세틸화 히스톤은 뉴클레오솜의 해리를 선호하며 따라서 염색질이 풀릴 수 있다.느슨한 염색질 상태에서는 DNA가 전사기계에 접근하기 쉬워 발현이 활성화된다.이 과정은 탈아세틸화효소에 [17][19]의한 히스톤 아세틸기 제거를 통해 역전될 수 있다.

두 번째 과정은 활성제 분자가 대응하는 강화제 영역에 결합함으로써 염색질 리모델링 복합체를 모집하는 것을 포함한다.뉴클레오솜 리모델링은 여러 메커니즘에 의해 뉴클레오솜의 위치를 바꾸면서 DNA에 대한 전사 기계의 접근을 가능하게 하거나 비활성화합니다.효모의 SWI/SNF 단백질 복합체는 크로마틴 리모델링을 [17][20]통해 많은 유전자의 발현을 조절하는 크로마틴 리모델링 복합체의 한 예이다.

다른 게놈 분야와의 관계

후생유전체학은 방법론과 추상적 목적 모두에서 다른 유전체학 분야와 많은 공통점을 가지고 있다.후생유전학은 유전체학에서 완전한 DNA 집합 또는 단백질학에서 [1][2]세포에서 완전한 단백질 집합의 연구와 유사하게 후생유전학적 변화를 확인하고 특징짓기 위해 노력합니다.전지구적 차원에서 후생유전학적 분석을 수행하는 이면의 논리는 후생유전학적 수정에 대해 추론할 수 있다는 것이다.[16][1] 후생유전학적 수정은 그렇지 않으면 특정 위치 분석을 통해 가능하지 않을 수 있다.다른 유전체학 분야와 마찬가지로 후생유전학은 생물학, 수학, 컴퓨터 [21]과학의 분야를 결합한 생물정보학에 크게 의존하고 있다.그러나 후생유전학적 변형은 수십 년 동안 알려져 연구되어 왔지만, 전 세계적으로 분석을 가능하게 한 것은 생물정보학 기술의 이러한 발전을 통해서이다.현재 많은 기법은 여전히 오래된 방법을 사용하고 있으며, 종종 다음 절에서 설명하는 게놈 분석에 적응한다.

방법들

히스톤 수정 분석

전사, DNA 복제, DNA 수복의 세포 과정은 게놈 DNA와 핵단백질 사이의 상호작용을 포함한다.염색질 내의 특정 부위는 낮은 배열 특이성 방식으로 DNA를 분해하는 DNAe I 소화에 매우 취약한 것으로 알려져 있었다.이러한 과민성 부위는 RNA 중합효소 및 토포이소머라아제 I 및 [22]II와의 연관성에 의해 입증되는 전사 활성 영역인 것으로 생각되었다.

현재 DNAse I 영역에 대한 민감도는 느슨한 DNA-히스톤 연관성을 가진 염색질 영역에 해당한다고 알려져 있다.과민성 부위는 대부분 촉진제 영역을 나타내는데, 이는 DNA 결합 전사 장치가 [23]작동하기 위해 DNA에 접근할 수 있어야 합니다.

ChIP 칩 및 ChIP-Seq

히스톤 변형은 ChIP-Chip이라고 불리는 DNA 마이크로어레이와 크로마틴 면역침강(ChIP)[16] 기술의 결합을 통해 게놈 전체 수준에서 처음 검출되었다.그러나 염색질 면역 침강을 통해 DNA 결합 전사 인자 또는 강화 단백질을 분리하는 대신, 관심 단백질은 변형된 히스톤 그 자체이다.첫째, 히스톤은 경화학적 처리(예: 포름알데히드)를 통해 생체 내 DNA와 가교된다.세포는 다음으로 용해되어 초음파 처리 또는 비특이적 제한 효소(예: 마이크로콕칼 뉴클레아제)에 의한 치료에 의해 염색질이 추출되고 조각화된다.변형 특이 항체는 차례로 DNA-히스톤 [17]복합체를 면역 침강시키는데 사용된다.면역 침강 후, DNA는 히스톤에서 정제되어 PCR을 통해 증폭되고 형광 태그(예: Cy5, Cy3)로 라벨링된다.마지막 단계는 고정화된 gDNA를 포함하는 마이크로 어레이에 면역침입된 DNA와 비면역침입된 DNA의 교배를 포함한다.상대 신호 강도를 분석함으로써 히스톤 수식 부위를 결정할 수 있다.[24][25]

ChIP-칩은 효모의 글로벌 히스톤 변형 패턴을 특징짓기 위해 광범위하게 사용되었습니다.이러한 연구로부터 히스톤 수정의 기능에 대한 추론이 이루어졌다. 즉, 전사 활성화 또는 억제는 특정 히스톤 수정 및 영역별과 관련이 있었다.이 방법은 효모 후생유전자의 거의 완전한 커버리지를 제공하는 데 효과적이었지만, 인간과 같은 더 큰 게놈에서의 사용은 [16][17]제한적이다.

진정한 게놈 수준에서 히스톤 변형을 연구하기 위해 다른 높은 처리량 방법들이 크로마틴 면역 침강과 결합되었다. 즉, SAGE: 유전자 발현의 직렬 분석(ChIP-SAGE), PET: 페어 엔드 디타그 배열 분석(ChIP-PET), 그리고 최근에는 차세대 배열 분석(ChIP-Seq)이다.ChIP-seq는 염색질 면역 침강에 대해 동일한 프로토콜을 따르지만 정제된 DNA의 증폭과 마이크로 어레이로의 교배 대신 차세대 병렬 재서열을 사용하여 DNA 단편을 직접 배열한다.기존 [16][24]방법보다 높은 분해능을 제공하여 글로벌 히스톤 변형 패턴 및 단백질 표적 부위를 분석하는 데 효과적인 방법임이 입증되었습니다.

DNA메틸화측정

1차 DNA 염기서열을 특징짓는 기술은 메틸화 분석에 직접 적용할 수 없었다.예를 들어 PCR이나 세균 복제 기술로 DNA가 증폭되면 메틸화 패턴이 복사되지 않아 정보가 손실되었다.방사성 탐침이 DNA 서열을 매핑하고 식별하기 위해 사용된 DNA 분석에 사용된 DNA 교배 기술은 메틸화 [26][9]DNA와 비메틸화 DNA를 구별하는 데 사용될 수 없었다.

제한핵산가수분해효소 기반 방법

비게놈 전체 접근법

최초의 메틸화 검출 분석은 메틸화 수식 민감 제한 엔도핵산가수분해효소를 사용했다.게놈 DNA는 동일한 제한 부위를 인식하는 메틸화 민감성 및 둔감성 제한 효소로 소화되었다.메틸화 부위가 메틸화 될 때마다 메틸화 무감각 효소만이 그 위치에서 분해될 수 있다는 생각이다.메틸화 감수성 효소에서 생성된 제한 단편 치수와 메틸화 감수성 효소의 크기를 비교하여 해당 영역의 메틸화 패턴을 결정할 수 있었다.이 분석 단계는 PCR을 통해 제한 단편을 증폭하고 [26][9]겔 전기영동을 통해 분리한 후 관심 영역에 대한 탐침을 사용하여 Southern Blot을 통해 분석하였다.

이 기술은 인간 성인과 헤모글로빈 유전자 자리의 DNA 메틸화 변형 패턴을 비교하기 위해 사용되었다.유전자의 다른 영역(감마 델타 베타 글로빈)은 다른 [27]발달 단계에서 발현되는 것으로 알려졌다.유전자 억제에서 DNA 메틸화의 역할과 일관되게, 높은 수준의 DNA 메틸화와 관련된 영역은 활발하게 [28]발현되지 않았다.

이 방법은 글로벌 메틸화 패턴, 즉 '메틸롬'에 대한 연구에는 적합하지 않습니다.특정 장소 내에서도 메틸화에 민감하고 무감각한 제한 분석을 가진 제한 사이트만이 유용한 정보를 제공할 수 있기 때문에 진정한 메틸화 패턴을 완전히 나타내지 못했다.제한 효소에 의한 DNA의 불완전한 소화가 잘못된 음성 [9]결과를 생성하면 추가적인 합병증이 발생할 수 있다.

게놈 전체 접근법

대규모 DNA 메틸화 프로파일링은 처음에 RLGS(Restriction Landmark Genome Scanning) 기술을 통해 가능해졌다.궤적 특이적 DNA 메틸화 분석과 마찬가지로, 이 기술은 소화 메틸화 민감 효소를 통해 메틸화 DNA를 식별했다.그러나 2차원 겔 전기영동을 사용하여 더 넓은 [9]규모로 특성을 파악할 수 있었습니다.

하지만 마이크로 어레이와 차세대 배열 기술이 등장하고 나서야 진정으로 고해상도와 게놈 전체의 DNA 메틸화가 [12]가능해졌다.RLGS와 마찬가지로 엔도핵산가수분해효소 성분은 방법에서 유지되지만 새로운 기술과 결합된다.그러한 접근법 중 하나가 미분메틸화하이브리제이션(DMH)이며, 여기서 1세트의 게놈 DNA는 메틸화 감수성 제한 효소에 의해 소화되며, DNA의 병렬 세트는 소화되지 않는다.두 세트의 DNA는 그 후 증폭되어 각각 형광염료로 라벨링되어 2색 어레이 하이브리드화에 사용된다.주어진 위치에서의 DNA 메틸화 수준은 두 염료의 상대적 강도 비율에 의해 결정된다.차세대 시퀀싱을 DNA 메틸화 분석에 적용하면 어레이 하이브리드화에 비해 몇 가지 이점이 있습니다.염기서열 기반 기술은 특정 DNA 메틸화를 대립시키는 높은 분해능을 제공하며, 더 큰 게놈에서 수행될 수 있으며, 적절하게 [9]기능하기 위해 CpG 밀도에 기초한 조정이 필요한 DNA 마이크로어레이를 생성할 필요가 없습니다.

아황산수소염 배열법

비황산염 배열은 표준 DNA 배열 기술을 통해 식별될 수 있도록 비메틸화 사이토신의 화학적 변환에만 의존합니다.중황산나트륨과 알칼리성 처리는 메틸화 시토신을 변경하지 않고 그대로 두고 미메틸화 시토신 잔기를 우라실로 변환함으로써 이를 실현한다.처리되지 않은 DNA 및 나트륨 비술파이트 처리 DNA의 후속 증폭 및 염기서열 분석을 통해 메틸화 부위를 식별할 수 있다.전통적인 제한 기반 방법과 마찬가지로, 비황산염 배열은 전체 게놈 배열 기술을 사용할 수 있을 때까지 역사적으로 특정 유전자 위치의 메틸화 패턴으로 제한되었습니다.그러나 기존의 제한 기반 방법과는 달리, 중황산염 염기서열처리는 [26][9]뉴클레오티드 수준에서 분해능을 제공했다.

중황산염 기술의 한계에는 잘못된 양의 원천인 우라실로의 시토신의 불완전한 변환이 포함된다.또, 아황산염 처리도 DNA 분해를 일으키기 때문에,[9] 아황산나트륨을 제거하기 위한 추가 정제 공정을 필요로 한다.

차세대 배열 배열은 게놈 전체 메틸화 분석에서 중황산염 배열을 보완하는 데 매우 적합하다.이제 메틸화 패턴이 가능한 한 높은 분해능에서 결정될 수 있지만, 단일 뉴클레오티드 수준에서, 비술파이트 처리 DNA의 배열 복잡성 감소로 인해 여전히 조립 단계에서 문제가 남아 있다.읽기 길이의 증가는 이 과제에 대처하기 위해 전체 게놈 샷건 비술파이트 시퀀싱(WGBS)을 수행할 수 있도록 한다.Illumina Genome Analyzer 플랫폼을 사용하는 WGBS 접근방식은 Arabidopsis Thaliana에서 [9]이미 구현되었습니다.아황산수소염 염기서열처리에 기초한 환원표현유전체법도 [29][30]존재하며, 특히 게놈 [31]사이즈가 큰 종에 적합하다.

Chromatin 접근성 평가

염색질 접근성은 게놈 영역이 전사 인자의 전사 또는 결합에 얼마나 "접근성" 또는 "개방성"을 나타내는 척도이다.접근할 수 없는 영역(즉, 뉴클레오솜에 의해 결합되어 있기 때문에)은 개방적이고 접근할 수 있는 영역이 활발하게 [32]전사되는 동안 세포에 의해 활발하게 전사되지 않습니다.염색질 접근성의 변화는 세포나 유전자의 [33]문맥 특이적 발현을 지배하는 중요한 후생유전학적 조절 과정이다.MNase-seq, DNase-seq, ATAC-seq 또는 FAIR-seq와 같은 측정법은 세포의 접근 가능한 크로마틴 경관을 이해하기 위해 일상적으로 사용된다.이 모든 방법의 가장 큰 특징은 히스톤과 결합되어 있는 DNA 배열과 결합되어 있지 않은 DNA 배열을 선택적으로 분리할 수 있다는 것입니다.그런 다음 이 염기서열들을 상대적인 [34]위치를 확인할 수 있는 참조 게놈과 비교합니다.

MNase-seq 및 DNase-seq는 둘 다 동일한 원리를 따르며, 핵산을 표적으로 하는 용해 효소를 사용하여 뉴클레오솜 또는 다른 단백질 인자에 의해 결합되지 않은 DNA 가닥을 절단하고, 경계 조각은 보호되며, 검색 및 분석이 가능하다.활성 바인딩되지 않은 영역은 파괴되므로 차세대 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱을 수행하고 참조와 비교함으로써 간접적으로만 검출할 수 있습니다.MNase-seq는 표적 [35]배열의 반대쪽 가닥에서 단일 가닥의 분열을 생성하는 마이크로코칼 핵산가수분해효소를 이용한다.DNase-seq는 비특이적인 이중 가닥 절단 엔도핵산가수분해효소인 DNase I을 사용한다.이 기술은 뉴클레오솜이 없는 영역이 DHS, DNase I 과민성 [36]부위로 라벨링될 정도로 사용되었으며, 게놈 전체 크로마틴 접근성 [37]분석을 위한 ENCODE 컨소시엄의 선택 방법이 되었다.이 기술의 주요 이슈는 균열 분포가 [38]편중되어 결과의 품질이 저하될 수 있다는 것이다.

FAIR-seq(Formalde-Assisted Isolation of Regulatory Elements)는 DNA와 뉴클레오솜의 첫 번째 가교, 그 후 음파에 의한 DNA 전단화를 요구한다.단백질 분율은 중간상(interphase)에 고착되고 비연결 DNA는 수상으로 이동하며 다양한 [39]방법으로 분석할 수 있기 때문에 유리 및 연결 단편을 전통적인 페놀-클로로포름 추출로 분리한다.음파는 랜덤한 파괴를 일으키기 때문에 어떤 종류의 편견도 받지 않으며, 또한 단편의 길이가 크기 때문에(200-700nt) 이 기술은 단일 뉴클레오솜을 [34]분해할 수 없는 반면 더 넓은 영역에 적합하다.핵산가수분해효소 기반 방법과는 달리 FAIR-seq는 전사 활성 부위의 직접 식별과 덜 힘든 샘플 [40]준비를 가능하게 한다.

ATAC-seq는 Tn5 트랜스포사아제 활성에 기초한다.트랜스포자아제는 게놈에 태그를 삽입하는 데 사용되며 단백질 인자에 의해 덮이지 않는 부위에서 더 높은 빈도로 사용됩니다.그런 다음 태그는 PRC 또는 기타 분석 [41]도구의 어댑터로 사용됩니다.

직접 검출

단일분자 실시간 염기서열 분석에서 중합효소 감수성은 과학자들이 염기서열 [42]분석 중인 DNA 분자를 따라 중합효소가 이동할 때 메틸화와 같은 후생유전학적 표시를 직접적으로 검출할 수 있게 했다.몇몇 프로젝트들은 박테리아에서 [43][44][45][46]게놈 전체의 후생유전학적 데이터를 수집할 수 있는 능력을 입증했다.

나노포어 시퀀싱은 염기 수정(예: 메틸화)에 따른 전해 전류 신호의 변화를 기반으로 합니다.중합효소는 모공 중 ssDNA의 입구를 매개하여 이온전류변화를 모공의 일부에 의해 변조하고 그 결과 발생한 차이를 CpG의 위치를 밝혀 기록한다.모공의 고전계 영역을 통과하는 전류가 [47]약간 영향을 받는 경우에도 고체 나노포어에 의해 히드록시메틸화와 메틸화의 판별이 가능해진다.참조 증폭된 DNA는 PCR [48]프로세스 후 복사된 메틸화 부위를 나타내지 않습니다.옥스포드 나노포어 테크놀로지스 미니온 시퀀서는 숨겨진 마르코프 모델에 따르면 그 변형 신호를 강화하는 화학처리가 없어도 메틸화되지 않은 시토신을 구별할 수 있는 기술입니다.데이터는 일반적으로 설정된 시간에 피코암페어로 등록됩니다.다른 장치로는 Nanopolish와 SignaAlign이 있습니다.전자는 판독치에 메틸화의 빈도를 나타내는 반면, 후자는 [49]모든 판독치의 합계에서 도출된 메틸화의 확률을 나타냅니다.

단일분자 실시간 염기서열결정(SMRT)은 단일분자 DNA 염기서열결정법이다.단일 분자 실시간 시퀀싱은 제로 모드 도파관(ZMW)을 사용합니다.단일 DNA 중합효소 효소가 단일 DNA 분자를 템플릿으로 ZMW 바닥에 결합되어 있다.4개의 DNA 염기는 각각 4개의 다른 형광 염료 중 하나에 부착되어 있다.DNA 중합효소에 의해 뉴클레오티드가 혼입되면 형광태그가 분리되고 검출기가 뉴클레오티드 혼입의 형광신호를 검출한다.배열이 일어나면서 중합효소 효소 동기는 메틸화 영역 또는 다른 염기 변형 영역을 만나면 변화한다.효소가 화학적으로 변형된 염기를 만나면, 독특하게 식별할 수 있는 방식으로 속도가 느려지거나 빨라집니다.SMRT 시퀀싱에서 형광 펄스는 발광 스펙트럼뿐만 아니라 지속 시간 및 연속 펄스 간 간격에 의해 특징지어진다.펄스 폭 및 인터펄스 지속시간(IPD)으로 정의되는 이러한 메트릭은 DNA 중합효소 역학에 대한 귀중한 정보를 추가합니다.펄스 폭은 뉴클레오티드 결합 후 불소 방출까지의 모든 운동 단계의 함수이며, IPD는 뉴클레오티드 결합 및 중합효소 전위 동태에 의해 결정된다.

2010년 과학자 팀은 N6-메틸아데노신, 5-메틸시토신 및 5-히드록실시토신을 포함한 DNA 템플릿에서 변형된 뉴클레오티드를 직접 검출하기 위해 단일 분자 실시간 염기서열 분석을 사용하는 것을 시연했다.이러한 다양한 변형은 중합효소 역학에 다르게 영향을 미치며,[50] 이러한 변화를 구별합니다.

2017년 또 다른 팀은 3세대 단일 분자 실시간 염기서열 분석(SMRT-BS)을 이용한 2황산염 복합 변환을 제안했는데, 이는 PC가 필요 없이 높은 수준의 곱셈과 긴 읽기 길이(1.5KB)가 가능한 정확한 표적 CpG 메틸화 분석 방법이다.R 엠프리콘 [51]서브클론

이론적 모델링 접근법

유전자 발현에 영향을 미치는 서로 다른 뉴클레오솜 상태에 대한 최초의 수학적 모델은 1980년대에 도입되었다[ref].나중에, 실험 증거가 후생유전학적 [52]코드로서 공유 히스톤 수정의 가능한 역할을 나타낼 때까지, 이 생각은 거의 잊혀졌다.향후 몇 년 동안 높은 처리량 데이터는 후생유전학적 수정의 풍부함과 이러한 [53][54]패턴을 유지하고 변화시키는 새로운 이론적 모델에 동기를 부여한 염색질 기능과의 관계를 밝혀냈다.이러한 모델은 보통 1차원 격자 [55]접근의 프레임으로 공식화된다.

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메모들

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