크로마틴 면역소모증

Chromatin immunoprecipitation
Chip-sequencing 워크플로우

크로마틴 면역복제(ChIP)는 세포 내 단백질과 DNA의 상호작용을 조사하는 데 사용되는 면역복제 실험 기법의 일종이다. 그것은 특정 단백질이 촉진제나 다른 DNA 결합 부위의 전사 인자와 같은 특정 유전체 영역과 연관되어 있는지, 그리고 아마도 cistromes를 정의하는 것을 목적으로 한다. ChIP는 또한 다양한 히스톤 수식어가 연관되어 있는 게놈의 특정 위치를 결정하는 것을 목표로 하고 있는데, 이는 히스톤 수식어의 표적을 나타낸다.[1]

간단히 말해서, 재래식 방법은 다음과 같다.

  1. 살아있는 세포나 조직에서 염색질의 DNA와 관련 단백질은 교차 연결된다(이 단계는 Native ChIP에서 생략한다.
  2. 그리고 나서 DNA-단백질 복합체(크로마틴-단백질)는 소음이나 누클레스 소화에 의해 500bp의 DNA 조각으로 깎인다.
  3. 관심 단백질과 연관된 교차연계 DNA 조각은 적절한 단백질 고유 항체를 사용하여 세포 파편에서 선별적으로 면역억제된다.
  4. 관련 DNA 파편은 정제되고 그 염기서열이 결정된다. 특정 DNA 염기서열의 농축은 관심 단백질이 생체내와 연관되어 있는 게놈의 영역을 나타낸다.

일반적인 ChIP

Chip의 종류는 주로 두 가지가 있는데, 주로 시작 염색질 준비에서 차이가 난다. 첫 번째 방법은 XChIP(Cross-Linked Chip)라고 불리는 소음에 의해 깎인 역방향으로 연결된 크로마틴을 사용한다. Native ChIP (NChIP)는 마이크로코칼리 누클레스 소화에 의해 깎인 네이티브 크로마틴을 사용한다.[citation needed]

XCh(교차 연결 Chip)IP)

교차연계 ChIP는 주로 전사인자 또는 기타 염색질 관련 단백질의 DNA 표적을 매핑하는 데 적합하며, 역방향으로 교차연계된 염색질을 출발 물질로 사용한다. 가역성 교차 링크의 작용제는 포름알데히드[2] 또는 자외선일 수 있다.[3] 그 후 교차연계 염색질은 보통 소음에 의해 깎여지며, 300 - 1000 염기쌍(bp)의 파편을 길이로 제공한다. 순한 포름알데히드 교차 연동에 이어 누클레스 소화가 크롬틴을 전단하는 데 사용되어 왔다.[4] 400~500bp의 염색체 조각은 2~3개의 뉴클레오솜을 덮기 때문에 ChIP 분석에 적합한 것으로 입증되었다.

피복된 라이세이트의 세포 이물질은 침전물과 단백질에 의해 제거된다.DNA 복합체는 관심 단백질에 대한 특정 항체를 사용하여 선택적으로 면역억제된다. 항체는 일반적으로 아가로스, 세파로스 또는 자석 구슬과 결합된다. 대신에, 염색질-항체 복합체는 불활성 폴리머 디스크에 의해 선택적으로 보존되고 용출될 수 있다.[5][6] 그런 다음 면역억제 복합체(즉, 비드-항티보디-단백질-표적 DNA 염기서열 복합체)를 채취하여 세척하여 단백질인 비특이 결합 염색질을 제거한다.DNA 교차연결이 역전되고 단백질 분해효소 K로 소화에 의해 단백질이 제거된다. 관심 단백질 또는 생체내 비오티비닐화의 에피토프 태그 버전을 관심 있는 고유 단백질에 대한 항체 대신 사용할 수 있다.

그런 다음 복합체와 관련된 DNA는 정제되고 PCR(중합효소 체인 반응), 마이크로레이(Chip-on-chip), 분자 복제 및 염기서열 분석 또는 직접 고투과 염기서열 분석(Chip-Seq)으로 식별된다.[citation needed]

NCHIP(Native Chip)

Native ChIP는 히스톤 수식어의 DNA 표적을 매핑하는 데 주로 적합하다. 일반적으로 토종 염색체는 시작 염색체로 사용된다. 히스톤이 DNA를 감싸 핵소체를 형성하면서 자연스럽게 연결된다. 그리고 나서 염색질은 마이크로코크칼 누클레스 소화에 의해 깎이게 되는데, 이것은 링커 길이로 DNA를 잘라내 뉴클레오솜(200bp)을 온전하게 하고 길이로는 뉴클레오솜(1000bp) 1개에서 5개 뉴클레오솜(1000bp)의 DNA 조각을 제공한다. 이후 XCh와 유사한 방법IP는 세포 찌꺼기를 깨끗이 하고, 관심 단백질을 면역억제하며, 면역억제 복합체에서 단백질을 제거하고, 복잡하게 연관된 DNA를 정화하고 분석하는 데 사용된다.[citation needed]

XChIP와 NChIP의 비교

NChIP의 가장 큰 장점은 항체 특이성이다. 변형된 히스톤에 대한 대부분의 항체는 혼합되지 않은 합성 펩타이드 항원에 대해 제기되며 XCh에서 인식해야 하는 별자리도 유의해야 한다.IP는 포름알데히드 교차 링크에 의해 교란되거나 파괴될 수 있으며, 특히 교차 링크는 N-단자에 라이신 e-아미노 그룹을 포함시켜 상피를 교란시킬 가능성이 있기 때문이다. 이는 XCh의 지속적인 낮은 효율을 설명할 가능성이 높다.IP 프로토콜과 NChIP 비교.

그러나 XChIP와 NChIP는 서로 다른 목적과 장점을 가지고 있다. XChIP는 전사 인자 및 기타 염색질 관련 단백질의 표적 부위를 매핑하기 위한 것이며, NChIP는 히스톤 수식어의 표적 부위를 매핑하기 위한 것이다(표 1 참조).

표 1 NChIP 및 XCh의 장단점IP

XChIP NCHIP
이점 전사 인자 또는 다른 약한 결합 염색체 관련 단백질에 적합하다.
고유 단백질이 준비되기 어려운 유기체에 적용 가능 		검사 가능한 항체 특이성
표적 단백질이 자연적으로 손상되지 않아 항체 특이성 향상

항체 특이성 개선으로 염색질 및 단백질 회수 효율성 향상

단점들 항체 표적 단백질 에피포프 붕괴로 인한 비효율적인 염색질 회복
염색체에 과도 단백질이 고착되어 잘못된 양성 결과를 초래할 수 있음
소음에 의한 무작위 절단에 의한 광범위한 염색체 피복 크기. 		일반적으로 비사성 단백질에는 적합하지 않다.
소화가 진행되는 동안 뉴클레오솜이 재배열될 수 있음

History 및 New ChIP 방법

1984년에 존 T. Lis 연구소의 대학원생이었던 당시 Lis와 David Gilmour는 살아있는 박테리아 세포에서 DNA와 결합한 단백질을 균등하게 교차 연결하기 위해 제로 길이 단백질-핵산 교차 링크제인 UV 조사를 사용했다. 교차연계세포의 용해와 박테리아 RNA 중합효소의 면역복귀에 이어 농축 RNA 중합효소와 연관된 DNA를 혼합하여 알려진 유전자의 서로 다른 영역에 해당하는 탐사로 하여 이들 유전자에서 RNA 중합효소의 생체내 분포와 밀도를 결정하였다. 1년 후 그들은 과실파리 열충격 유전자에 대한 진핵 RNA 중합효소 II의 분포를 연구하기 위해 같은 방법론을 사용했다. 이들 보고서는 염색질 면역복제 분야의 선구적 연구로 평가된다.[8][9] XChIP는 포름알데히드 교차링크를 사용하여 열충격 유전자에 대한 히스톤 H4의 분포를 검사한 알렉산더 바르샤브스키와 동료들에 의해 추가적으로 수정 및 개발되었다.[10][11] 이 기술은 그 후 광범위하게 개발되고 다듬어졌다.[12] NCHIP 접근법은 Hebbes 외, 1988년에 처음 설명되었으며,[13] 또한 빠르게 개발 및 정제되었다.[14] 일반적인 Chip assay는 보통 4~5일이 걸리며, 적어도 106~10개의7 셀이 필요하다. 이제 Chip에 대한 새로운 기술은 100-1000개의 셀에 불과하고 하루 안에 완성될 수 있다.

  • 비드가 없는 ChIP: 이 새로운 방법은 ChIP가 스핀 기둥이나 마이크로플레이트에 단백질 A 또는 G로 기능한 불활성 다공성 고분자 디스크를 사용한다. 크로마틴-안티바디 콤플렉스는 디스크에 선택적으로 보존되고 용출되어 qPCR과 시퀀싱과 같은 다운스트림 어플리케이션에 대한 농축 DNA를 얻는다. 다공성 환경은 포획 효율을 극대화하고 비특정 결합을 줄이기 위해 특별히 설계되었다. 수동 처리가 적고 프로토콜이 최적화되었기 때문에 Chip은 5시간 내에 수행될 수 있다.[6]
  • 캐리어 ChIP(CCHIP): 이 접근방식은 대상 염색체의 손실을 줄이고 침수를 촉진하기 위해 Drosophila 세포를 운반용 색소로 첨가함으로써 100개 정도의 셀을 사용할 수 있다. 다만 외국 캐리어 염색체 배경에서 표적 세포 염색체를 검출하기 위해서는 매우 구체적인 프라이머를 요구하고 있으며, 2, 3일이 소요된다.[15]
  • 빠른 Chip(qCh)IP: 빠른 ChiP 측정은 일반적인 ChiP 측정에서 두 단계를 단축하여 시간을 단축시켰다: (i) 초음파 욕조는 표적 단백질에 대한 항체 결합 속도를 가속화하여 면역복귀 시간 (ii) 수지 기반 (Chelex-100) DNA 격리 절차로 교차 링크 역전과 DNA 격리의 시간을 단축시킨다. 그러나 빠른 프로토콜은 큰 세포 샘플(10~1067)에만 적합하다.[16][17] 5시간 안에 PCR 준비 DNA를 산출할 수 있도록 최대 24개의 표층 염색질 샘플을 처리할 수 있어 여러 염색질 인자를 동시에 검사하거나 여러 시점에 걸쳐 게놈 사건을 조사할 수 있다.[18]
  • 신속 및 정량적 Chip(QCHIP):2 분석은 10만개의 셀을 시작 재료로 사용하며 히스톤 ChIP 또는 100개의 전사 계수 ChIP에 적합하다. 따라서 많은 염색질 샘플은 병렬로 준비하여 저장할 수 있으며 QCh2IP는 하루 만에 수행할 수 있다.[19]
  • 마이크로칩(µChIP): 염색질은 보통 1,000개의 세포에서 준비되며 최대 8개의 Chips를 캐리어 없이 병렬로 할 수 있다. 검사는 또한 100개의 세포로 시작할 수 있지만 하나의 Chip에만 적합하다. 작은(1mm3) 조직 생체모양과 마이크로칩도 사용할 수 있다.IP는 하루 안에 할 수 있다.[20][21]
  • Matrix ChIP: 처리량이 증가하고 절차가 단순화된 마이크로플레이트 기반 Chip Assay 입니다. 모든 단계는 샘플 전송 없이 마이크로플레이트 웰에서 수행되므로 자동화가 가능하다. 히스톤과 다양한 DNA 결합 단백질에 대한 96개의 ChIP 검사를 하루 만에 가능하게 한다.[22]
  • 병리학-치IP(PAT-ChIP): 이 기법은 병리학적 포르말린 고정 조직과 파라핀 내장 조직으로부터 ChIP를 허용하며, 따라서 후생유전학적 분석과 후생유전 바이오마커 후보 식별을 위한 병리학적 기록물(수년 된 기록물도 포함)을 사용할 수 있다.[23]

Chip은 마이크로 어레이 기술(Chip-on-chip)이나 2세대 DNA 시퀀싱 기술(Chip-Sequencing)과 결합해 게놈 와이드 분석에도 적용됐다. ChIP는 또한 고차 염색체 구조의 대규모 디노보 분석을 위해 개발된 기술인 Pairled End Tag 시퀀싱(ChIA-PET)을 사용하여 Chromatin Interaction Analysis에서 페어링 엔드 태그 시퀀싱과 결합할 수 있다.[24][25][26]

제한 사항

  • Chip을 이용한 대규모 측정은 온전한 모델 유기체를 사용하는 것이 어렵다. 각 TF에 대해 항체가 생성되어야 하고, 또는 그 대신에 에피토프 태그 TF를 발현하는 유전자 변형 모델 유기체가 생성되어야 하기 때문이다.
  • 작은 유기체의 미분 유전자 발현 패턴을 연구하는 연구자들 또한 좁은 시간대에 적은 수의 세포에서 낮은 수준으로 표현되는 유전자로써 문제에 직면해 있다.
  • ChIP 실험은 서로 다른 TF 등소형(단백질 등소형)을 구별할 수 없다.

참고 항목

  • Chip-exo, Chip 프로세스에 exonuclease 처리를 추가하여 바인딩 사이트의 단일 기본 쌍 분해능까지 획득하는 기술
  • Chip-on-chip, 마이크로 어레이 기술과 Chip 결합
  • DamID, 특정 항체가 필요 없는 대체 위치 매핑 기법
  • RIP-칩, RNA-단백질 상호작용을 분석하는 유사한 기술

참조

  1. ^ Collas, Philippe. (January 2010). "The Current State of Chromatin Immunoprecipitation". Molecular Biotechnology. 45 (1): 87–100. doi:10.1007/s12033-009-9239-8. PMID 20077036. S2CID 24225210.
  2. ^ Jackson, Vaughn (November 1978). "Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent". Cell. 15 (3): 945–54. doi:10.1016/0092-8674(78)90278-7. PMID 569554. S2CID 25169609.
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외부 링크