서던 블롯

Southern blot
추, 종이 타월, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막, 젤, 소금 용액 및 유리 슬래브로 구성된 스택이 있는 트레이.
교배 및 헹굼 후 Southern Blot membrane.
자외선 조명 하의 서던 블롯 아가로스 겔.
Southern Blot 자동 방사선 촬영.

서던 블롯분자생물학에서 DNA 샘플에서 특정 DNA 서열을 검출하기 위해 사용되는 방법이다.서던 블로팅은 전기영동으로 분리된 DNA 조각의 필터막으로의 전달과 프로브 혼성화[1]의한 후속 단편 검출을 결합한다.

이 방법은 1975년에 [2]처음 발표한 영국생물학자인 에드윈 서던의 이름을 따서 붙여졌다.유사한 원리를 사용하지만 RNA 또는 단백질을 사용하는 다른 블롯 방법(예: 웨스턴 [3]블롯, 노던 블롯, 이스턴 블롯, 사우스웨스턴 블롯)은 나중에 에드윈 서던의 이름을 참조하여 명명되었다.라벨이 동명이기 때문에 Southern은 고유명사처럼 대문자로 표기된다.다른 블로킹 방법의 이름은 [4]유추에 따라 이 규칙을 따를 수 있습니다.

방법

  1. 제한핵산가수분해효소는 고분자량의 DNA 가닥을 더 작은 조각으로 자르는데 사용된다.
  2. DNA 조각들은 크기별로 분리하기 위해 아가로스 겔 위에 전기영동된다.
  3. 일부 DNA 조각이 15kb보다 클 경우 블롯 전에 겔을 묽은 HCl과 같은 산으로 처리할 수 있습니다.이것은 DNA 조각을 제거하여, DNA를 더 작은 조각으로 분해함으로써, 겔에서 막으로 더 효율적으로 전달할 수 있게 합니다.
  4. 알칼리 전이 방법을 사용하는 경우, DNA 겔은 이중 가닥 DNA를 변성시키기 위해 알칼리 용액(일반적으로 수산화 나트륨 포함)에 들어갑니다.알칼리 환경에서의 변성은 DNA의 음전하 티민 잔기의 양전하 아미노기와의 결합을 개선하여 나중에 프로브에 교배하기 위해 단일 DNA 가닥으로 분리할 수 있으며(아래 참조), DNA에 여전히 존재할 수 있는 모든 잔류 RNA를 파괴할 수 있다.그러나 중성 전달 방법보다 알칼리성 전달 방법을 선택하는 것은 종종 경험적이어서 동등한 [citation needed]결과를 초래할 수 있다.
  5. 니트로셀룰로오스(또는 나일론)의 시트를 겔의 위쪽(또는 이송 방향에 따라서는 아래)에 배치한다.겔에 균등하게 압력을 가하여(흡착을 사용하거나 종이 타월과 추를 멤브레인 및 젤 위에 올려놓음으로써), 젤과 멤브레인 사이의 접촉이 양호하고 균등하게 유지되도록 합니다.흡입으로 이송할 경우 20배 SSC buffer를 사용하여 밀봉이 확실하고 겔의 건조가 방지됩니다.높은 수전위 영역에서 낮은 수전위 영역(보통 여과지 및 종이 조직)으로의 모세관 작용에 의한 완충 이동은 겔에서 막으로 DNA를 이동시키기 위해 사용된다.이온 교환 상호작용은 DNA의 음전하와 막의 양전하로 인해 DNA를 막에 결합시킨다.
  6. 그런 다음 80°C의 진공 또는 일반 오븐에서 2시간 동안(표준 조건, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막) 구우거나 자외선(나일론 막)에 노출되어 전달된 DNA를 막에 영구적으로 부착합니다.
  7. 그 후 막은 표적 DNA에서 존재 여부가 결정되어야 하는 특정 배열을 가진 단일 DNA 조각인 하이브리드화 프로브에 노출된다.탐침 DNA는 검출될 수 있도록 라벨로 표시되며, 보통 방사능을 포함하거나 형광색소 또는 색소성 염료로 분자를 태그합니다.경우에 따라서는 교배 프로브가 DNA가 아닌 RNA로 만들어질 수 있다.시료 DNA에 대한 프로브 결합의 특이성을 보장하기 위해, 대부분의 일반적인 잡종화 방법은 막 표면 및 표적 DNA 차단에 연어 또는 청어 정자 DNA, 탈이온화된 포름아미드 및 프로브의 비특이적 결합을 줄이기 위해 SDS와 같은 세제를 사용한다.
  8. 하이브리드화 후 여분의 프로브를 막(일반적으로 SSC 버퍼를 사용하여)에서 세척하고, 방사성 또는 형광 프로브의 경우 오토라디오그래피X선 필름에 하이브리드화 패턴을 가시화하거나, 발색 검출 방법을 사용하는 경우 막에 발색한다.

결과

필터막의 특정 DNA 조각에 대한 프로브 교배는 이 조각이 프로브에 상보적인 DNA 배열을 포함하고 있음을 나타냅니다.전기영동겔에서 막으로 DNA의 이동 단계를 통해 라벨이 부착된 하이브리드화 프로브가 크기 분절된 DNA에 쉽게 결합할 수 있습니다.또한 자동 방사선 촬영 또는 기타 검출 방법에 의한 분석에 필요한 표적 프로브 하이브리드를 고정할 수 있습니다.제한 효소에 의해 소화된 게놈 DNA로 수행된 남부 블롯은 게놈의 배열 수(예를 들어 유전자 복사)를 결정하기 위해 사용될 수 있다.제한 효소에 의해 절단되지 않은 단일 DNA 세그먼트에만 교배되는 프로브는 Southern Blot에 단일 밴드를 생성하는 반면, 프로브가 여러 개의 매우 유사한 시퀀스(예: 배열 중복의 결과일 수 있는 시퀀스)로 교배될 때 다중 밴드가 관찰될 수 있습니다.하이브리드화 조건의 변경(하이브리제이션 온도 증가 또는 염분 농도 감소 등)은 프로브의 특이성을 높이고 100% 유사한 배열에 대한 하이브리드화를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

적용들

표적 유전자의 단백질 생성물의 아미노산 배열을 바탕으로 호몰로지 기반 복제를 위해 서던 블롯 전이를 사용할 수 있다.올리고뉴클레오티드는 표적배열을 보완하도록 설계된다.올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성되고, 방사성 라벨이 부착되며, DNA 라이브러리 또는 복제된 DNA 조각의 다른 집합을 스크리닝하는 데 사용됩니다.하이브리드화 프로브와 교배하는 배열을, 예를 들면 표적 유전자의 전장 배열을 얻기 위해서 한층 더 분석한다.

서던 블롯은 또한 특정 유전자의 메틸화 부위를 식별하는 데 사용될 수 있다.특히 유용한 것은 제한핵산가수분해효소 MspIHpa이다.II, 둘 다 같은 염기서열 내에서 인식되고 분열됩니다., Hpa는II는 해당 부위 내의 C를 메틸화해야 하는 반면 MspI는 해당 부위에서 메틸화되지 않은 DNA만 절단합니다.따라서 특정 프로브에 의해 분석된 배열 내의 메틸화 부위는 전자의 [5]효소가 아닌 전자의 효소에 의해 분해된다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ "Southern Blot".
  2. ^ Southern, Edwin Mellor (5 November 1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503–517. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0. ISSN 0022-2836. PMID 1195397.
  3. ^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". PNAS. 76 (9): 4350–4. Bibcode:1979PNAS...76.4350T. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. PMC 411572. PMID 388439.
  4. ^ Burnette, W. Neal (April 1981). "Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A". Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. ISSN 0003-2697. PMID 6266278.
  5. ^ 생화학 제3판, 매튜스, 밴 홀드 외, 애디슨 웨슬리 출판사, 977페이지

외부 링크