단백질 생산

Protein production
이 기사는 생명공학적인 방법에 관한 것이다.세포의 자연스러운 과정은 유전자 발현을 참조하십시오.
Central dogma depicting transcription from DNA code to RNA code to the proteins in the second step covering the production of protein.
단백질 생산을 다루는 두 번째 단계에서 DNA 코드에서 RNA 코드로의 전사를 묘사하는 중심 교의.

단백질 생산은 특정 단백질을 생성하는 생명공학적 과정이다.그것은 전형적으로 유기체의 유전자 발현을 조작하여 많은 양의 재조합 유전자를 발현함으로써 달성된다.이것은 메신저 RNA(mRNA)로의 재조합 DNA의 전사, 폴리펩타이드 사슬로의 mRNA의 변환을 포함한다. 폴리펩타이드 사슬은 궁극적으로 기능성 단백질로 접혀 특정 세포하 또는 세포외 [1]위치를 목표로 할 수 있다.

단백질 생산 시스템(발현 시스템이라고도 함)은 생명과학, 생명공학, 의학에 사용된다.분자생물학 연구는 많은 단백질과 효소를 사용하며, 특히 PCR을 위한 DNA 중합효소, RNA 분석을 위한 역전사효소, 복제를 위한 제한 핵산 분해효소, 그리고 생물학적 표적 또는 잠재적 약물로써 약물 발견에서 선별된 단백질을 만드는 데 사용됩니다.또한 산업 발효, 특히 당뇨병을 치료하기 위한 인간 인슐린과 같은 생약 생산 및 효소 제조에 있어 발현 시스템에 대한 중요한 응용이 있다.

단백질 생산 시스템

일반적으로 사용되는 단백질 생산 시스템은 박테리아,[2] 효모,[3][4] 바쿨로바이러스/곤충,[5] 포유동물 세포,[6][7] 그리고 보다 최근의 미셀리오프토라 테르모필라 [8]같은 필라멘트 균류에서 유래한 것을 포함한다.이러한 시스템 중 하나로 생약품이 생산될 때 숙주 세포 단백질이라고 불리는 프로세스 관련 불순물도 미량만큼 [9]최종 생산물에 도착합니다.

셀 기반 시스템

가장 오래되고 널리 사용되는 발현 시스템은 세포 기반이며 "발현 벡터, 그것의 복제 DNA, 그리고 숙주 세포에서 외래 유전자 기능을 허용하는 문맥을 제공하는 벡터의 결합, 즉 높은 수준에서 단백질을 생산"으로 정의될 수 있다.[10][11]과잉발현은 유전자 관련 표현형이 [12][13]뚜렷하게 나타나는 비정상적이고 지나치게 높은 수준의 유전자 발현이다.

발현을 위해 세포에 외부 DNA를 도입하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 발현을 위해 많은 다른 숙주 세포가 사용될 수 있습니다. 각 발현 시스템은 뚜렷한 장점과 책임감을 가지고 있습니다.발현 시스템은 보통 숙주 및 유전물질의 DNA 소스 또는 전달 메커니즘에 의해 참조된다.예를 들어, 일반적인 숙주는 박테리아(예: E.coli, B. subtilis), 효모(예: S. cerevisiae[4]) 또는 진핵 세포주이다.일반적인 DNA 소스와 전달 메커니즘은 바이러스(예: 바쿨로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 플라스미드, 인공 염색체 및 박테리오파지(예: 람다)입니다.가장 좋은 발현 시스템은 관련된 유전자에 따라 달라지는데, 예를 들어 사카로미세스 세레비시아이는 번역 후 상당한 수정을 필요로 하는 단백질에 종종 선호된다.곤충 또는 포유동물 세포주는 사람과 같은 mRNA 스플라이싱이 필요할 때 사용한다.그러나 세균발현은 구조판정을 위한 X선 결정학이나 핵자기공명실험에 필요한 많은 양의 단백질을 쉽게 생산할 수 있는 장점이 있다.

박테리아는 원핵생물이기 때문에 번역 후 필요한 수정이나 분자 접힘을 달성하기 위한 완전한 효소적 장치를 갖추지 못했습니다.따라서 박테리아에서 발현되는 다도메인 진핵생물 단백질은 기능하지 않는 경우가 많다.또한 많은 단백질은 가혹한 변성제와 그에 따른 번거로운 단백질 재형성 없이는 회복하기 어려운 봉입체로서 불용성화된다.

이러한 우려를 해결하기 위해 여러 진핵세포를 사용하는 발현 시스템이 진핵생물에 적합하거나 진핵생물에 더 근접해야 하는 애플리케이션을 위해 개발되었다. 즉, 식물(담배), 곤충이나 포유동물(즉, 소)의 세포는 유전자에 의해 트랜스펙트 되고 심지어 조직이나 조직 전체로도 배양된다.SMS, 완전히 접힌 단백질을 생산합니다.그러나 포유류의 생체 내 발현 시스템은 낮은 수율 및 기타 한계(시간 소모, 숙주 세포에 대한 독성 등)를 가지고 있다.박테리아와 효모의 높은 수율/생산성과 확장 가능한 단백질 특징과 식물, 곤충 및 포유류 시스템의 고급 후생유전학적 특징을 결합하기 위해, 다른 단백질 생산 시스템은 단세포 진핵생물(즉, 비병원성 '라이슈마니아' 세포)을 사용하여 개발된다.

세균계

대장균
대장균은 인공 유전자 발현에 가장 인기 있는 숙주 중 하나이다.

대장균은 가장 널리 사용되는 발현 숙주 중 하나이며, DNA는 일반적으로 플라스미드 발현 벡터에 도입된다.대장균의 과잉발현에 대한 기술은 잘 개발되었으며 유전자 복제 수를 증가시키거나 프로모터 영역의 결합 강도를 증가시켜 전사를 돕는다.

예를 들어, 관심 단백질의 DNA 배열을 복제하거나 Lac(종종 LacUV5) 프로모터를 포함하는 높은 복사 번호 플라스미드로 서브클론할 수 있으며, 그 후 대장균으로 변형된다.IPTG(유당 유사체)를 추가하면 락 프로모터가 활성화되고 박테리아가 관심 단백질을 발현하게 됩니다.

대장균주 BL21과 BL21(DE3)은 단백질 생산에 일반적으로 사용되는 두 가지 변종이다.B 계통의 구성원으로서, 그들은 Lon과 OmpT 단백질 분해 효소가 부족하여 생성된 단백질을 분해로부터 보호합니다.BL21(DE3)에서 발견되는 DE3 프로파지는 T7 RNA 중합효소(LacUV5 프로모터에 의해 구동됨)를 제공하여 T7 프로모터와의 벡터를 [14]대신 사용할 수 있도록 합니다.

코리네박테륨속

그램 양성 코리네박테륨의 비병원성 종은 다양한 아미노산의 상업적 제조에 사용된다.C. glutamicum 종은 글루탐산염과 리신,[15] 인간 음식, 동물 사료, 의약품의 성분들을 생산하는 데 널리 사용된다.

기능적으로 활성화된 인간 표피 성장 인자의 발현은 C. glutamicum에서 [16]이루어졌으며, 따라서 인간 단백질의 산업적 생산 가능성을 보여주었다.발현 단백질은 일반 분비 경로(Sec) 또는 트윈 아르기닌 전이 경로(Tat)[17]를 통해 분비를 목표로 할 수 있다.

그램 음성 박테리아와 달리, 그램 양성 코리네박테륨은 인간에서 항원성 엔도톡신 역할을 하는 리포다당류가 부족하다.

슈도모나스 형광체

비병원성 및 그램 음성 박테리아인 Pseudomonas 형광체는 재조합 단백질의 높은 수준의 생산에 사용됩니다. 일반적으로 생물 치료제와 백신을 개발하는 데 사용됩니다. P. 형광체는 높은 처리량 스크리닝과 복잡한 단백질의 빠른 개발을 가능하게 하는 대사적으로 다용도 유기체이다.P. 형광체는 활성,[18] 용해성 단백질의 높은 적정량을 신속하고 성공적으로 생산하는 능력으로 가장 잘 알려져 있습니다.

진핵생물계

효모

S. cerevisiae 또는 Pichia pastoris를 사용하는 발현 시스템은 화학적으로 정의된 단백질 매체에서 포유류의 세포와 유사하게 높은 수율로 처리되는 단백질의 안정적이고 지속적인 생산을 가능하게 합니다.

필라멘트균류

필라멘트 균류, 특히 아스페르길루스, 트리코데르마, 그리고[8] 최근에는 다양한 산업용 효소의 선별과 생산을 위한 발현 플랫폼으로 발전했다.발현계 C1은 수중배양에서의 저점도 형태학을 보여줌으로써 복잡한 성장 및 생산배지를 사용할 수 있다.

바쿨로바이러스감염세포
참고 항목: BacMam

바쿨로바이러스에 감염된 곤충[19] 세포(Sf9, Sf21, High Five 변종) 또는 포유동물[20] 세포(HeLa, HEK 293)는 곰팡이 또는 세균 [19]시스템을 사용하여 생성할 수 없는 글리코실화 또는 막 단백질의 생성을 가능하게 한다.그것은 많은 양의 단백질을 생산하는데 유용하다.감염된 숙주 세포가 결국 용해되고 각 감염 [21]주기 동안 죽기 때문에 유전자는 지속적으로 발현되지 않는다.

비용해성 곤충세포발현상

비용해성 곤충세포 발현은 용해성 바쿨로바이러스 발현계의 대안이다.비용해 발현에서 벡터는 후속 유전자 [22][23]발현을 위해 곤충세포의 염색체 DNA에 순간적으로 또는 안정적으로 감염된다.재조합 클론의 [24]선택과 선별이 뒤따른다.비용해계는 바쿨로바이러스 감염 세포 발현에 비해 단백질 [23]수율이 높고 재조합 유전자의 발현이 빨라졌다.본 시스템에 사용되는 세포주에는 Spodoptera frugiperda 세포로부터의 Sf9, Sf21, Trichoplusia ni 세포로부터의 Hi-5 및 Drosophila melanogaster [22][24]세포로부터의 Schneider 2 세포와 Schneider 3 세포가 포함된다.이 시스템을 사용하면 세포가 용해되지 않고 여러 배양 [22]모드를 사용할 수 있습니다.또한 단백질 생산도 재현할 [22][23]수 있습니다.이 시스템은 균일한 [23]제품을 제공한다.이 시스템의 단점은 실행 가능한 [24]클론을 선택하기 위한 추가 스크리닝 단계가 필요하다는 것이다.

엑스카바타

Leishmania tarentolae (포유류를 감염시킬 수 없음) 발현 시스템은 화학적으로 정의된 매체에서 높은 수율로 안정적이고 지속적인 단백질 생성을 가능하게 합니다.생성된 단백질은 글리코실화 및 디술피드 결합 [citation needed]형성을 포함한 완전한 진핵생물 번역 후 변형을 보인다.

포유류의 계통

가장 일반적인 포유류의 발현 체계는 중국 햄스터 난소와 인간 배아 신장 [25][26][27]세포이다.

셀프리 시스템

정제 RNA 중합효소, 리보솜, tRNA 및 리보뉴클레오티드를 사용하여 체외에서 단백질을 무세포로 생산한다.이러한 시약은 세포 또는 세포 기반 발현 시스템에서 추출하여 제조할 수 있습니다.셀 프리 시스템의 낮은 발현 수준과 높은 비용 때문에 셀 기반 시스템이 더 널리 사용됩니다.[28]

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Gräslund S, Nordlund P, Weigelt J, Hallberg BM, Bray J, Gileadi O, et al. (February 2008). "Protein production and purification". Nature Methods. 5 (2): 135–46. doi:10.1038/nmeth.f.202. PMC 3178102. PMID 18235434.
  2. ^ Baneyx F (October 1999). "Recombinant protein expression in Escherichia coli". Current Opinion in Biotechnology. 10 (5): 411–21. doi:10.1016/s0958-1669(99)00003-8. PMID 10508629.
  3. ^ Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (September 2000). "Recombinant protein expression in Pichia pastoris". Molecular Biotechnology. 16 (1): 23–52. doi:10.1385/MB:16:1:23. PMID 11098467. S2CID 35874864.
  4. ^ a b Malys N, Wishart JA, Oliver SG, McCarthy JE (2011). "Protein production in Saccharomyces cerevisiae for systems biology studies". Methods in Systems Biology. Methods in Enzymology. Vol. 500. pp. 197–212. doi:10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6. ISBN 9780123851185. PMID 21943899.
  5. ^ Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL (May 2005). "Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells". Nature Biotechnology. 23 (5): 567–75. doi:10.1038/nbt1095. PMC 3610534. PMID 15877075.
  6. ^ Rosser MP, Xia W, Hartsell S, McCaman M, Zhu Y, Wang S, Harvey S, Bringmann P, Cobb RR (April 2005). "Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system". Protein Expression and Purification. 40 (2): 237–43. doi:10.1016/j.pep.2004.07.015. PMID 15766864.
  7. ^ Lackner A, Genta K, Koppensteiner H, Herbacek I, Holzmann K, Spiegl-Kreinecker S, Berger W, Grusch M (September 2008). "A bicistronic baculovirus vector for transient and stable protein expression in mammalian cells". Analytical Biochemistry. 380 (1): 146–8. doi:10.1016/j.ab.2008.05.020. PMID 18541133.
  8. ^ a b Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R, et al. (June 2011). "Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1". Industrial Biotechnology. 7 (3): 214–223. doi:10.1089/ind.2011.7.214.
  9. ^ Wang, Xing; Hunter, Alan K.; Mozier, Ned M. (2009-06-15). "Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment". Biotechnology and Bioengineering. 103 (3): 446–458. doi:10.1002/bit.22304. ISSN 0006-3592. PMID 19388135. S2CID 22707536.
  10. ^ "Definition: expression system". Online Medical Dictionary. Centre for Cancer Education, University of Newcastle upon Tyne: Cancerweb. 1997-11-13. Retrieved 2008-06-10.
  11. ^ "Expression system - definition". Biology Online. Biology-Online.org. 2005-10-03. Retrieved 2008-06-10.
  12. ^ "overexpression". Oxford Living Dictionary. Oxford University Press. 2017. Retrieved 18 May 2017. The production of abnormally large amounts of a substance which is coded for by a particular gene or group of genes; the appearance in the phenotype to an abnormally high degree of a character or effect attributed to a particular gene.
  13. ^ "overexpress". NCI Dictionary of Cancer Terms. National Cancer Institute at the National Institutes of Health. 2011-02-02. Retrieved 18 May 2017. overexpress
    In biology, to make too many copies of a protein or other substance. Overexpression of certain proteins or other substances may play a role in cancer development.
  14. ^ Jeong, H; Barbe, V; Lee, CH; Vallenet, D; Yu, DS; Choi, SH; Couloux, A; Lee, SW; Yoon, SH; Cattolico, L; Hur, CG; Park, HS; Ségurens, B; Kim, SC; Oh, TK; Lenski, RE; Studier, FW; Daegelen, P; Kim, JF (11 December 2009). "Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3)". Journal of Molecular Biology. 394 (4): 644–52. doi:10.1016/j.jmb.2009.09.052. PMID 19786035.
  15. ^ Brinkrolf K, Schröder J, Pühler A, Tauch A (September 2010). "The transcriptional regulatory repertoire of Corynebacterium glutamicum: reconstruction of the network controlling pathways involved in lysine and glutamate production". Journal of Biotechnology. 149 (3): 173–82. doi:10.1016/j.jbiotec.2009.12.004. PMID 19963020.
  16. ^ Date M, Itaya H, Matsui H, Kikuchi Y (January 2006). "Secretion of human epidermal growth factor by Corynebacterium glutamicum". Letters in Applied Microbiology. 42 (1): 66–70. doi:10.1111/j.1472-765x.2005.01802.x. PMID 16411922.
  17. ^ Meissner D, Vollstedt A, van Dijl JM, Freudl R (September 2007). "Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria". Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (3): 633–42. doi:10.1007/s00253-007-0934-8. PMID 17453196. S2CID 6238466.
  18. ^ Retallack DM, Jin H, Chew L (February 2012). "Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system". Protein Expression and Purification. 81 (2): 157–65. doi:10.1016/j.pep.2011.09.010. PMID 21968453.
  19. ^ a b Altmann F, Staudacher E, Wilson IB, März L (February 1999). "Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins". Glycoconjugate Journal. 16 (2): 109–23. doi:10.1023/A:1026488408951. PMID 10612411. S2CID 34863069.
  20. ^ Kost TA, Condreay JP (October 1999). "Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells". Current Opinion in Biotechnology. 10 (5): 428–33. doi:10.1016/S0958-1669(99)00005-1. PMID 10508635.
  21. ^ Yin J, Li G, Ren X, Herrler G (January 2007). "Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes". Journal of Biotechnology. 127 (3): 335–47. doi:10.1016/j.jbiotec.2006.07.012. PMID 16959350.
  22. ^ a b c d Dyring, Charlotte (2011). "Optimising the drosophila S2 expression system for production of therapeutic vaccines". BioProcessing Journal. 10 (2): 28–35. doi:10.12665/j102.dyring.
  23. ^ a b c d Olczak M, Olczak T (December 2006). "Comparison of different signal peptides for protein secretion in nonlytic insect cell system". Analytical Biochemistry. 359 (1): 45–53. doi:10.1016/j.ab.2006.09.003. PMID 17046707.
  24. ^ a b c McCarroll L, King LA (October 1997). "Stable insect cell cultures for recombinant protein production". Current Opinion in Biotechnology. 8 (5): 590–4. doi:10.1016/s0958-1669(97)80034-1. PMID 9353223.
  25. ^ a b Zhu J (2012-09-01). "Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production". Biotechnology Advances. 30 (5): 1158–70. doi:10.1016/j.biotechadv.2011.08.022. PMID 21968146.
  26. ^ a b c d Almo SC, Love JD (June 2014). "Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production". Current Opinion in Structural Biology. New constructs and expression of proteins / Sequences and topology. 26: 39–43. doi:10.1016/j.sbi.2014.03.006. PMC 4766836. PMID 24721463.
  27. ^ Hacker DL, Balasubramanian S (June 2016). "Recombinant protein production from stable mammalian cell lines and pools". Current Opinion in Structural Biology. New constructs and expression of proteins • Sequences and topology. 38: 129–36. doi:10.1016/j.sbi.2016.06.005. PMID 27322762.
  28. ^ Rosenblum G, Cooperman BS (January 2014). "Engine out of the chassis: cell-free protein synthesis and its uses". FEBS Letters. 588 (2): 261–8. doi:10.1016/j.febslet.2013.10.016. PMC 4133780. PMID 24161673.

추가 정보

외부 링크

라이브러리 리소스 정보
단백질 생산