서브플론

분자생물학에서 서브클로닝은 특정 DNA 배열을 부모 벡터에서 목적지 벡터로 이동시키기 위해 사용되는 기술이다.

서브클로닝은 관련된 기술인 분자 복제와 혼동해서는 안 된다.

절차.

제한 효소는 부모로부터 관심 유전자(삽입물)를 제거하기 위해 사용된다.삽입물은 다른 DNA 분자와 분리하기 위해 정제됩니다.일반적인 정제 방법은 겔 분리이다.유전자 복제의 수는 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭된다.

동시에 목적지를 소화(절단)하는 데 동일한 제한 효소가 사용됩니다.동일한 제한 효소를 사용하는 이면에 있는 아이디어는 나중에 결찰이 용이하도록 보완적인 끈적끈적한 끝을 만드는 것입니다.또한 목적 벡터의 자기 결속을 방지하기 위해 일반적으로 종아리-장알칼리성 포스파타아제(CIAP)를 첨가한다.소화된 행선지 벡터가 분리/정제됩니다.

삽입물과 대상 벡터는 DNA 연결효소와 함께 섞인다.인서트 유전자와 대상 벡터의 전형적인 몰비는 3:^[1]1이며, 인서트 농도를 높임으로써 자기 결속을 더욱 감소시킨다.반응 혼합물을 특정 온도에서 일정 시간 동안 방치한 후(연결되는 가닥의 크기에 따라 다릅니다. 자세한 내용은 DNA 연결효소 참조), 삽입물이 대상 플라스미드에 성공적으로 통합되어야 합니다.

제품 플라스미드의 증폭

플라스미드는 종종 대장균과 같은 박테리아로 변형된다.이상적으로는 박테리아가 플라스미드를 분열시킬 때 또한 복제되어야 한다.최선의 경우, 각 세균 세포는 플라스미드의 복사본을 여러 개 가지고 있어야 합니다.많은 수의 세균 집락이 성장한 후, 플라스미드 DNA를 채취하기 위해 그것들을 작게 할 수 있다.

선택.

원하는 플라스미드를 채취하는 형질전환세균만의 성장을 확보하기 위해 선택 목적 벡터에 마커 유전자를 사용한다.대표적인 마커 유전자는 항생제 내성 또는 영양소 생합성을 위한 것이다.예를 들어, "마커 유전자"는 항생제인 암피실린에 대한 내성이 될 수 있습니다.만약 원하는 플라스미드를 얻어야 하는 박테리아가 원하는 유전자를 얻었더라면, 그들은 또한 "마커 유전자"를 포함할 것이다.플라스미드를 얻은 박테리아는 암피실린에서 자랄 수 있지만, 원하는 플라스미드를 얻지 못한 박테리아는 여전히 암피실린에 의해 파괴되기 쉽습니다.따라서 성공적으로 변형된 박테리아가 선택될 것이다."

예: 세균성 플라스미드 서브클로닝

이 예에서 포유류의 유전자 라이브러리에서 나온 유전자는 박테리아 플라스미드(행선지 플랫폼)에 종속된다.박테리아 플라스미드는 원형 DNA의 한 조각으로, 플라스미드의 올바른 위치에 배치될 경우 박테리아가 유전자 생성물(유전자 발현)을 생산할 수 있도록 하는 조절 요소를 포함합니다.생산 현장의 측면에는 호환되지 않는 끈적끈적한 끝을 가진 두 개의 제한 효소 절단 부위 "A" 및 "B"가 있습니다.

포유류의 DNA에는 이러한 제한 부위가 포함되어 있지 않기 때문에 중복 확장 PCR에 의해 내장되어 있습니다.프라이머는 단백질의 코드화가 프레임에 들어가도록 제한 부위를 조심스럽게 배치하도록 설계되어 단백질의 양쪽에 최소의 여분의 아미노산이 주입됩니다.

새로운 제한 부위를 가진 포유동물 유전자를 포함한 PCR 생성물과 대상 플라스미드를 모두 제한 소화하여 겔 전기영동에 의해 소화물을 정제한다.

현재 서로 호환되는 스틱 엔드를 포함하고 있는 다이제스트 제품(단, 서로 호환되지 않는 스틱 엔드를 포함)은 결찰 처리되어 다른 삽입으로 원래 플라스미드의 배경 요소를 포함하는 새로운 플라스미드가 생성됩니다.

플라스미드는 박테리아로 변형되고 삽입물의 정체는 DNA 염기서열 분석을 통해 확인된다.

「 」를 참조해 주세요.

• 클로닝
• 분자 복제
• 중합효소 연쇄반응
• TA 클로닝

레퍼런스