단백질 정제

Protein purification

단백질 정화는 복잡한 혼합물(일반적으로 세포, 조직 또는 전체 유기체)에서 하나 또는 소수의 단백질을 분리하기 위한 일련의 과정이다.단백질 정화는 해당 단백질의 기능, 구조 및 상호작용을 규정하는 데 필수적이다.정제 과정은 혼합물의 단백질과 비단백질 부분을 분리할 수 있고, 마지막으로 원하는 단백질을 다른 모든 단백질로부터 분리할 수 있다.한 단백질을 다른 모든 단백질로부터 분리하는 것은 일반적으로 단백질 정화의 가장 힘든 측면이다.분리 단계는 보통 단백질 크기, 물리-화학적 특성, 결합 친화력 및 생물학적 활성의 차이를 이용한다.순수한 결과는 단백질 분리라고 할 수 있다.

목적

단백질 정화는 준비적이거나 분석적인 것이다.준비 정화는 후속 사용을 위해 비교적 많은 양의 정제 단백질을 생성하는 것을 목표로 한다.예를 들어 효소(예: 락타아제), 영양 단백질(예: 콩 단백질 분리), 특정 바이오 의약품(예: 인슐린)과 같은 상용 제품의 제조가 포함된다.환자의 [1]건강에 잠재적인 위협으로 제기되는 숙주 세포 단백질과 같은 이중 산물을 제거하기 위해 몇 가지 준비 정제 단계가 종종 배치된다.분석 정제에서는 단백질의 구조, 번역 후 변형 및 기능에 대한 확인, 정량화 및 연구를 포함한 다양한 연구 또는 분석 목적을 위해 비교적 적은 양의 단백질을 생산한다.펩신과 우레아제는 [2]결정화될 정도로 정제된 최초의 단백질이었다.

배지를 포함한 플라스크 내에서 재조합균을 배양할 수 있다.

예비 단계

추출.

유기체에 의해 관심 단백질이 주변 용액에 분비되지 않을 경우 각 정제 과정의 첫 번째 단계는 해당 단백질을 포함하는 세포를 파괴하는 것이다.단백질이 얼마나 취약하고 세포가 얼마나 안정적인지에 따라 예를 들어 i) 반복 동결 및 해동, ii) 소음, ii) 고압(프랑스 프레스), iv) 분쇄(비드 밀)에 의한 균질화, v) 세제(예: 트리톤 X-100) 및/또는 효소에 의한 투과성 중 하나의 방법을 사용할 수 있다.(리소자임 [3]등).마지막으로 단백질 및 기타 가용성 화합물이 상등액에 남도록 원심분리함으로써 세포 부스러기를 제거할 수 있다.

또한 단백질 분해 효소는 세포 용해 중에 방출되는데, 이것은 용액 속의 단백질을 소화하기 시작할 것이다.해당 단백질이 단백질 분해에 민감할 경우 신속하게 진행하여 추출물을 냉각시켜 소화를 늦출 수 있도록 하는 것이 좋습니다.또는 세포교란 직전에 하나 이상의 단백질분해효소억제제를 용해버퍼에 첨가할 수 있다.때때로 높은 DNA 함량에 의해 야기되는 세포 용해물의 점도를 낮추기 위해 DNAse를 첨가하는 것도 필요하다.

침전 및 미분 가용화

주요 기사:황산암모늄 침전

벌크 단백질 정제에서 단백질을 분리하는 일반적인 첫 번째 단계는 황산암모늄([4]NH4)2SO에4 의한 침전이다.이는 황산암모늄의 양을 증가시키고 침전 단백질의 다른 부분을 수집함으로써 수행됩니다.이어서 투석을 이용하여 황산암모늄을 제거할 수 있다.황산암모늄 침전 단계 동안 단백질에 존재하는 소수성 그룹은 대기에 노출되어 다른 소수성 그룹을 끌어들인다. 그 결과 소수성 성분의 집합체가 형성된다.이 경우 단백질 침전물은 일반적으로 육안으로 볼 수 있습니다.이 방법의 장점 중 하나는 매우 큰 볼륨을 사용하더라도 저렴하게 수행할 수 있다는 것입니다.

가장 먼저 정제되는 단백질은 수용성 단백질이다.일체형 막 단백질의 정화는 동일한 막 구획에 있는 다른 단백질로부터 특정 단백질을 분리하기 위해 세포막을 파괴하는 것을 필요로 한다.때로는 미토콘드리아 막에 위치한 단백질을 정제하기 전에 세포로부터 미토콘드리아를 분리하는 것과 같은 특정한 막 분획이 먼저 분리될 수 있다.세포막을 용해하고 정제 중에 막단백질을 용액에 유지하기 위해 도데실황산나트륨(SDS) 등의 세제를 사용할 수 있지만, SDS는 변성을 일으키기 때문에 완전한 정제 중에 단백질의 고유 배열을 유지하기 위해 트리톤 X-100이나 CHAPS 등의 순한 세제를 사용할 수 있다.

초원심화

주요 기사:초원심기

원심분리란 원심력을 사용하여 액체 속에 부유된 다양한 질량 또는 밀도의 입자의 혼합물을 분리하는 과정입니다.단백질 또는 박테리아 세포와 같은 다른 입자 물질의 혼합물을 포함하는 용기(일반적으로 튜브 또는 병)가 빠른 속도로 회전할 때, 각 입자의 관성은 질량에 비례하는 입자 속도 방향으로 힘을 생성합니다.이 힘 때문에 주어진 입자가 액체를 통과하는 경향은 액체가 입자에 가하는 저항으로 상쇄됩니다.원심분리기에서 샘플을 "회전"하는 순효과는 크고 작고 밀도가 높은 입자가 더 작은 입자나 액체 중에 더 많은 "끌림"이 있는 입자보다 더 빨리 바깥쪽으로 이동한다는 것입니다.원심분리기에서 입자의 현탁액을 "분사"하면 용기 바닥에 액체에서 가장 질량이 큰 입자를 위해 농축된 "펠릿"이 형성될 수 있습니다.

비압축 입자는 대부분 "상등액"이라고 불리는 액체에 남아 있으며 용기에서 제거되어 펠릿에서 상등액을 분리할 수 있습니다.원심분리 속도는 표본에 적용된 각 가속도에 의해 결정되며, 일반적으로 g와 비교하여 측정된다.시료를 충분히 원심분리하면 용기 내 입자가 원심력으로 부력밀도가 균형을 이루는 지점에서 특히 입자가 축적되는 평형에 도달한다.이러한 "균형" 원심 분리는 주어진 입자를 광범위하게 정화할 수 있습니다.

수크로스 구배 원심분리 - 설탕의 선형 농도 구배(일반적으로 수크로스, 글리세롤 또는 Percol과 같은 실리카 기반 밀도 구배 매체)가 튜브에서 생성되어 가장 높은 농도는 맨 아래, 맨 위에는 가장 낮다.Percol은 GE Healthcare 회사가 소유한 상표입니다.다음으로 구배 위에 단백질 시료를 적층하여 초원심분리기로 고속으로 회전시킨다.이것은 무거운 고분자가 가벼운 물질보다 튜브의 바닥을 향해 더 빨리 이동하도록 합니다.수크로스가 없는 상태에서 원심분리하는 동안 입자가 회전 중심에서 점점 더 멀리 이동함에 따라 점점 더 많은 원심력을 경험합니다(더 멀리 이동할수록 더 빠르게 이동).이와 관련된 문제는 혈관 내의 유용한 분리 범위가 관측 가능한 작은 창으로 제한된다는 것입니다.샘플을 2배 더 오래 회전한다고 해서 관심 입자가 2배 더 멀리 가는 것은 아닙니다. 실제로 훨씬 더 멀리 가게 됩니다.그러나 단백질이 수크로스 구배를 통과할 때, 그들은 밀도와 점도가 증가하는 액체와 마주친다.적절히 설계된 수크로스 구배는 증가하는 원심력을 상쇄하여 입자가 원심장에 있었던 시간에 비례하여 움직이도록 합니다.이러한 구배에 의해 분리된 샘플을 "속도 영역" 원심분리라고 합니다.단백질/입자를 분리한 후 구배를 분화하여 수집한다.

정화 전략

크로마토그래피 장비.여기서 크기 제외 크로마토그래피를 설정합니다.버퍼는 컴퓨터 제어 장치에 의해 컬럼(오른쪽)에 펌핑됩니다.

원료 선택은 정화 공정 설계의 핵심이다.식물이나 동물에서, 특정 단백질은 보통 몸 전체에 균일하게 분포되지 않는다; 다른 장기나 조직들은 단백질의 더 높거나 더 낮은 농도를 가지고 있다.농도가 가장 높은 조직이나 장기만을 사용하면 주어진 양의 정제 단백질을 생산하는 데 필요한 부피를 줄일 수 있다.만약 단백질이 낮은 풍부함으로 존재하거나, 높은 가치를 가지고 있다면, 과학자들은 원하는 단백질의 많은 양을 생산할 세포를 개발하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다.재조합 발현을 통해 단백질이 예를 들어[5] His-tag 또는[6] Strep-tag에 의해 태그되어 정화를 용이하게 하여 필요한 정제 단계 수를 줄일 수 있습니다.

분석 정제법은 일반적으로 단백질을 분리하기 위해 세 가지 특성을 이용한다.우선 단백질은 pH 등급의 겔 또는 이온 교환 컬럼을 통해 등전점에 따라 정제할 수 있다.둘째, 단백질은 크기 제외 크로마토그래피 또는 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide 겔 전기영동법) 분석을 통해 크기 또는 분자량에 따라 분리할 수 있다.단백질은 종종 2D-PAGE를 사용하여 정제된 후 펩타이드 질량 핑거프린트로 분석되어 단백질 동일성을 확립한다.이것은 과학적 목적에 매우 유용하고 단백질의 검출 한계는 오늘날 매우 낮으며 나노그램의 단백질 양은 그들의 분석에 충분합니다.셋째, 단백질은 고성능 액체 크로마토그래피 또는 역상 크로마토그래피를 통해 극성/수체성으로 분리될 수 있다.

보통 단백질 정제 프로토콜은 하나 이상의 크로마토그래피 단계를 포함합니다.크로마토그래피의 기본 절차는 단백질이 함유된 용액을 다양한 물질로 채워진 컬럼을 통해 흐르게 하는 것이다.서로 다른 단백질은 칼럼 재료와 다르게 상호작용하기 때문에 칼럼 통과에 필요한 시간 또는 칼럼에서 단백질을 용출하는 데 필요한 조건에 의해 분리될 수 있다.보통 단백질은 280 nm에서 흡수도에 의해 컬럼에서 분리될 때 검출됩니다.다양한 크로마토그래피 방법이 존재합니다.

크기 제외 크로마토그래피

주요 기사:겔투과크로마토그래피

크로마토그래피는 다공질겔을 사용하여 용액 또는 변성상태에서 단백질을 분리하는 데 사용할 수 있다.이 기술은 크기 제외 크로마토그래피로 알려져 있습니다.그 원리는 작은 분자가 다공질 매트릭스에서 더 큰 부피를 통과해야 한다는 것이다.따라서 특정 크기의 단백질은 겔 기둥의 다른 끝에서 수집되기 전에 가변 용리액(용매)을 필요로 한다.

단백질 정화의 맥락에서 용리액은 보통 다른 시험관에 고여 있다.정제할 단백질의 측정 가능한 미량이 들어 있지 않은 모든 시험관은 폐기된다.따라서 나머지 용액은 정제할 단백질과 비슷한 크기의 단백질로 만들어진다.

전하 또는 소수성에 따른 분리

소수성 상호작용 크로마토그래피

HIC 배지는 양친매성으로 소수성 및 친수성 영역을 모두 가지며 표면 소수성에 기초한 단백질 분리를 가능하게 한다.표적 단백질과 그 생성물 골재 종은 서로 다른 소수성 특성을 갖는 경향이 있으며, HIC를 통해 그것들을 제거하면 관심 [7]단백질이 더욱 정제된다.또한 사용된 환경은 일반적으로 다른 크로마토그래피 기술보다 덜 거친 변성 조건을 사용하므로, 해당 단백질이 본래의 상태 및 기능 상태로 보존되는 데 도움이 됩니다.순수한 물에서는 수지와 단백질의 소수성 영역 간의 상호작용이 매우 약하지만, 이 상호작용은 높은 이온 강도 완충제의 HIC 수지에 단백질 샘플을 적용함으로써 강화된다.완충제의 이온 강도는 소수성을 [8]감소시키기 위해 용출 단백질로 감소한다.

이온 교환 크로마토그래피

주요 기사:이온 교환 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피는 이온 전하의 성질과 정도에 따라 화합물을 분리한다.사용할 컬럼은 전하의 종류와 강도에 따라 선택됩니다.음이온 교환 수지는 양전하를 가지며 음전하 화합물(음이온)을 유지 및 분리하는 데 사용되는 반면 양이온 교환 수지는 음전하를 가지며 양전하 분자( 양이온)를 분리하는 데 사용됩니다.

분리가 시작되기 전에 버퍼를 컬럼을 통해 펌핑하여 마주보는 하전 이온을 평형화합니다.시료를 주입하면 용질 분자는 각각 수지상의 결합 부위를 놓고 경쟁할 때 완충 이온과 교환됩니다.각 용질의 유지 길이는 전하의 강도에 따라 달라집니다.가장 약하게 대전된 화합물이 먼저 용출되고, 이어서 강한 전하를 가진 화합물이 그 뒤를 이을 것이다.분리 메커니즘의 특성상 pH, 버퍼 유형, 버퍼 농도 및 온도 모두 분리를 제어하는 데 중요한 역할을 합니다.

이온 교환 크로마토그래피는 단백질 정화에 사용되는 매우 강력한 도구이며 분석 및 준비 분리에 자주 사용됩니다.

니켈 친화도 열.그 수지는 니켈을 결합했기 때문에 파란색이다.

자유류 전기영동

주요 기사:자유류 전기영동

자유유동전기영동(FFE)은 직교전장을 이용하여 층상버퍼스트림에서 준비단백질을 분리할 수 있는 무담체 전기영동 기술이다.예를 들어 양성고분자에 의해 유도될 수 있는 pH-gradient를 이용하여 단백질 아이소폼을 0.02 delta-pI 미만의 분해능까지 분리할 수 있다.

어피니티 크로마토그래피

주요 기사: 어피니티 크로마토그래피

어피니티 크로마토그래피(Affinity Chromotography)는 분자구조에 기초한 분리 기술로 응용특이수지를 자주 사용한다.이들 수지는 표면에 리간드가 부착되어 있어 분리되는 화합물에 특이적이다.가장 빈번하게, 이러한 리간드는 항체-항원 상호작용과 유사한 방식으로 기능한다.리간드와 대상 화합물 사이의 이러한 "잠금 및 열쇠"는 리간드를 매우 특이하게 만들고, 종종 단일 피크를 생성하는 반면 샘플의 다른 모든 것은 유지되지 않습니다.

많은 막 단백질은 당단백질이며 렉틴 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.세정제 가용화 단백질은 공유 결합 렉틴을 가지도록 변형된 크로마토그래피 수지에 결합할 수 있다.렉틴에 결합하지 않는 단백질을 씻어낸 후 렉틴 결합 부위에서 결합 당단백질과 경쟁하는 고농도의 당을 첨가함으로써 특이적으로 결합 당단백질을 용출할 수 있다.일부 렉틴은 당과 경쟁하기 어려운 당단백질의 올리고당에 높은 친화력을 가지며, 결합 당단백질은 렉틴을 변성시켜 방출해야 한다.

면역친화성 크로마토그래피

HPLC왼쪽에서 오른쪽으로: 두 가지 용제의 경사를 발생시키는 펌프 장치, 강철제 강제 기둥 및 흡광도 측정 장치.
주요 기사:면역친화성 크로마토그래피

면역친화성 크로마토그래피는 표적 단백질을 선택적으로 정제하기 위해 항체 항원의 특이적 결합을 이용한다.이 절차에는 단백질을 고체 기질(예: 다공질 구슬 또는 막)에 고정하는 작업이 포함되며, 이 기질은 다른 모든 것이 흐르는 동안 대상을 선택적으로 결합합니다.표적 단백질은 pH 또는 염도를 변화시킴으로써 용출될 수 있다.고정화된 배위자는 항체(예: 면역글로불린 G)일 수도 있고 단백질(예: 단백질 A)일 수도 있습니다.이 방법은 태그에 공학을 수반하지 않기 때문에, 자연 [9]소스의 단백질에 사용될 수 있다.

태그 부착 단백질 정제

단백질에 태그를 붙이는 또 다른 방법은 단백질에 항원펩타이드 태그를 조작한 후 고정화 항체로 코팅된 느슨한 수지로 단백질을 정제하는 것이다.이 특별한 절차는 면역침강으로 알려져 있다.면역침강은 보통 원하는 단백질만 결합시키는 매우 특정한 상호작용을 발생시킬 수 있다.정제된 태그된 단백질은 용액의 다른 단백질로부터 쉽게 분리될 수 있고 나중에 깨끗한 용액으로 다시 용출될 수 있습니다.

태그가 더 이상 필요하지 않을 때는 단백질 분해 효소에 의해 분리될 수 있습니다.이것은 종종 태그와 단백질 사이의 단백질 분해효소 분해 부위를 엔지니어링하는 것을 포함한다.

참고: 자체 클리어 태그는 정제 과정에서 단백질 분해 효소를 사용하여 대상 단백질로부터 태그를 분리할 필요가 없습니다(예: iCapTag™).[10][11]태그의 주요 구성요소는 pH 변화 후 간단히 분리되는 인테인입니다.이어서 태그리스 순수 표적 단백질이 용출 완충액에 방출된다.

HPLC

주요 기사:고성능 액체 크로마토그래피

고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피는 고압을 가하는 크로마토그래피의 한 형태로서 용질을 컬럼을 통해 더 빠르게 구동합니다.즉, 확산이 제한되고 분해능이 향상됩니다.가장 일반적인 형태는 "역상" HPLC로, 기둥 재료는 소수성이다.단백질은 아세토니트릴과 같은 유기 용제의 증가된 양에 의해 용출된다.단백질은 그들의 소수성에 따라 용출된다.HPLC에 의한 정제 후 휘발성 화합물만을 포함한 용액에 넣어 동결 [12]살균이 용이하다.HPLC 정제에는 정제 단백질이 변성되는 경우가 많으므로 자발적으로 리폴드되지 않는 단백질에는 적용되지 않는다.

정제단백질 농도

원심분리관 내에 선택적으로 투과 가능한 막을 장착할 수 있다.완충제는 원심분리에 의해 막을 통과하여 단백질을 상부 챔버에 남깁니다.

단백질 정화가 끝나면 단백질이 농축되는 경우가 많습니다.여러 가지 방법이 있습니다.

동결 처리

용액에 문제의 단백질 이외의 다른 가용성 성분이 포함되어 있지 않으면 단백질이 동결 살균(건조)될 수 있습니다.이것은 보통 HPLC 실행 후에 실행됩니다.이것은 단순히 모든 휘발성 성분을 제거하고 단백질을 남긴다.

초여과

초여과법은 선택적 투과막을 이용하여 단백질 용액을 농축한다.막의 기능은 물과 작은 분자들이 단백질을 유지한 채 통과하게 하는 것이다.용액은 기계 펌프, 가스 압력 또는 원심 분리에 의해 막에 강제됩니다.

정제수율평가

정화 프로세스를 감시하는 가장 일반적인 방법은 여러 단계의 SDS-PAGE를 실행하는 것입니다.이 방법은 혼합물의 다른 단백질의 양을 대략적으로 측정할 뿐이며, 유사한 겉보기 분자량을 가진 단백질을 구별할 수 없다.

단백질이 구별되는 분광학적 특징 또는 효소 활성을 갖는 경우, 이 특성은 특정 단백질을 검출 및 정량화함으로써 단백질을 포함하는 분리의 분리를 선택하는데 사용될 수 있다.단백질에 대한 항체를 이용할 수 있다면 웨스턴 블로팅과 ELISA는 원하는 단백질의 양을 특이적으로 검출하고 정량화할 수 있다.일부 단백질은 수용체로 기능하며 종종 방사성 배위자를 사용하는 배위자 결합 분석에 의해 정제 단계에서 검출될 수 있다.

다단계 정제 과정을 평가하기 위해서는 특정 단백질의 양을 총 단백질의 양과 비교해야 한다.하지만 약간의 시약에서 정제 과정 동안 사용된 수량화에 방해가 될지도 후자가 브래드퍼드 총 단백질 분석 또는 빛의 280nm에서 흡광도에 의해 결정될 수 있다.예를 들어, 이미다졸(일반적으로polyhistidine-tagged가 재조합형 단백질의 정화에 사용되)는 아미노산 아날로그와 낮은에서 농도 총 단백 계량의bicinchoninic 산성(BCA)분석에 방해가 될 것.저질의 imidazole 중의 불순물 또한 280nm에, 단백질 농도의 UV흡광도에서 부정확한 독서에 결과를 흡수할 것이다.

고려해야 할 또 다른 방법은 표면 플라스몬 공진(SPR)이다.SPR은 칩 표면에서 라벨이 없는 분자의 결합을 검출할 수 있다.원하는 단백질이 항체일 경우 단백질 활성에 직접 결합을 번역할 수 있다.단백질의 활성 농도를 전체 단백질의 백분율로 나타낼 수 있다.SPR은 단백질 활성과 전체 수율을 빠르게 결정하는 강력한 방법이 될 수 있습니다.그것은 연주하기 위해 악기가 필요한 강력한 기술이다.

분석적

변성 조건 전기영동

겔 전기영동은 준비 및 분석 방법으로 모두 사용할 수 있는 일반적인 실험실 기술입니다.전기영동의 원리는 전기장에서의 하전 이온의 움직임에 의존한다.실제로 단백질은 세제(SDS)를 포함한 용액에서 변성된다.이러한 조건에서 단백질은 펼쳐지고 음전하를 띤 세제 분자로 코팅된다.SDS-PAGE의 단백질은 크기에 따라 분리된다.

분석방법에서 단백질은 크기에 따라 띠 모양으로 이동한다.쿠마시 블루 염료나 은색 얼룩 등의 얼룩을 사용하여 각 밴드를 검출할 수 있습니다.많은 양의 단백질을 정제하기 위한 준비 방법은 전기영동겔에서 단백질을 추출해야 합니다.이 추출에는 밴드가 포함된 겔을 제거하거나 겔 끝에서 밴드를 직접 겔에서 배출하는 작업이 포함될 수 있습니다.

정제 전략의 맥락에서, 변성 조건 전기영동은 크기 제외 크로마토그래피보다 더 나은 분해능을 제공하지만, 후기 크로마토그래피 컬럼뿐만 아니라 샘플의 많은 양의 단백질까지 확장되지는 않는다.

비변성 전기영동

겔전기영동준비장치: 전기영동챔버, 연동펌프, 프랙션컬렉터, 완충재순환펌프 및 UV검출기(냉장고 내), 전원장치 및 기록장치(테이블 위)

복합단백질 혼합물 중 생물활성금속단백질을 분리하기 위한 비변성 전기영동방법은 준비용 네이티브 PAGE이다.분리된 단백질의 온전성 또는 구조적 무결성은 독립적인 [13]방법으로 확인되어야 한다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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외부 링크