효소 분석

Enzyme assay
Beckman DU640 UV/Vis 분광 광도계

효소 분석법은 효소 활성을 측정하는 실험실 방법이다.그것들은 효소 동태와 효소 억제의 연구에 필수적이다.

효소 단위

효소의 양 또는 농도는 다른 화학 물질과 마찬가지로 몰 양 또는 효소 단위의 활성으로 표시될 수 있습니다.

효소 활성

효소 활성은 존재하는 활성 효소의 양에 대한 측정값이며, 따라서 다양한 물리적 조건에 따라 달라지며, 이는 명시되어야 한다.

다음 공식을 사용하여 계산됩니다.

어디에

{\ =} 효소 활성
{\ =} 단위 시간당 변환된 기판의 몰
{\ =} 반응 속도
{\ =} 반응량

SI 단위는 카탈이며, 1카탈 = 1mol−1 s(초당 1mol s)이지만, 지나치게 큰 단위입니다.보다 실용적이고 일반적으로 사용되는 값은 효소 단위(U) = 1μmol−1 min(초당 마이크로몰)이다.1U는 16.67나노카탈에 [1]해당합니다.

카탈에서 주어진 효소 활성은 일반적으로 추정된 효소의 자연 표적 기질 활성이다.효소 활성은 또한 젤라틴과 같은 특정 표준화 기질의 활성으로 주어질 수 있으며, 젤라틴 소화 단위(GDU) 또는 우유 단백질로 측정되고, 우유 응고 단위(MCU)로 측정됩니다.GDU와 MCU는 각각 1그램의 효소가 젤라틴과 우유 단백질을 얼마나 빨리 소화시키는지에 기초한다. 1GDU는 대략 1.5MCU와 [2]같다.

기질의 양이 증가하면 효소에 대한 반응 속도가 증가하지만, 특정 지점을 지나면 사용 가능한 활성 부위의 양이 일정하게 유지되기 때문에 반응 속도가 균일해집니다.

특정 액티비티

효소의 특이적 활성은 또 다른 일반적인 단위이다.이것은 총 단백질의 밀리그램 당 효소의 활성이다(μmol−1 min−1 mg으로 표시).특정 활성은 혼합물의 효소 순도를 측정합니다.이것은 총 단백질의 밀리그램 당 주어진 조건에서 주어진 시간(분) 내에 효소에 의해 형성되는 제품의 마이크로 몰입니다.비방사능은 반응속도를 반응량을 총 단백질의 질량으로 나눈 값과 같다.SI 단위는 katal/kg이지만 보다 실용적인 단위는 μmol/mgmin입니다.

특정 활성은 특정(보통 포화) 기질 농도에서 효소 처리 능력(처리되는 효소의 능력)의 측정값이며, 일반적으로 순수한 효소에 대해 일정하다.

활성부위 적정처리는 배양배치 및/또는 잘못 접힌 효소 및 유사한 문제에서 발생하는 오류를 제거하기 위해 이루어질 수 있다.이는 활성효소의 양을 측정하는 것으로, 예를 들어 비가역 억제제를 사용하여 활성부위의 양을 적정화함으로써 계산된다.특정 활성은 μmol−1 min−1 mg 활성 효소로 표현되어야 한다.효소의 분자량을 알면 해당 활성효소의 μmol당 회전수, 즉 초당 μmol 생성물을 특정 활성도에서 산출할 수 있다.회전수는 각 효소 분자가 초당 촉매 사이클을 수행하는 횟수로 시각화할 수 있습니다.

관련 용어

반응속도는 단위시간(mol−1 Ls−1)당 기질이 소실(또는 생산물)되는 농도이다.

순도 %는 100% ×(효소 샘플의 특이 활성/순수 효소의 특이 활성)이다.불순물 샘플은 일부 덩어리가 실제로 효소가 아니기 때문에 비방사능이 낮습니다.100% 순수 효소의 특이 활성이 알려진 경우, 불순물 샘플은 더 낮은 특이 활성을 가지므로 순도를 계산하고 명확한 결과를 얻을 수 있습니다.

검사의 종류

모든 효소 분석은 기질의 소비량 또는 시간의 [3]경과에 따른 제품 생산을 측정합니다.기질 및 생성물의 농도를 측정하는 다수의 다른 방법이 존재하며, 여러 가지 다른 방법으로 많은 효소를 측정할 수 있다.생화학자는 보통 네 가지 유형의 [4]실험을 사용하여 효소 촉매 반응을 연구합니다.

  • 초기 속도 실험효소가 많은 양의 기질과 혼합되면 효소-기질 중간체가 빠른 초기 과도 상태로 [3]축적된다.그런 다음, 반응은 효소 기질 중간체가 시간이 지남에 따라 거의 일정하게 유지되고 반응 속도가 상대적으로 느리게 변하는 정상 상태 역동학을 달성한다.요율은 준안정 상태에 도달한 후 단기간 동안 측정되며, 일반적으로 시간에 따른 제품 축적을 모니터링하여 측정된다.측정은 매우 단기간에 이루어지기 때문에 기판의 과잉이 크기 때문에 프리기판의 양이 초기기판의 양과 거의 같다는 근사치를 [5][3]얻을 수 있다.초기 속도 실험은 역반응 및 효소 분해와 같은 합병증으로부터 상대적으로 자유롭고 수행 및 분석하기에 가장 간단하다.그러므로 그것은 효소 동역학에서 단연코 가장 일반적으로 사용되는 실험 유형이다.
  • 진행 곡선 실험.이러한 실험에서, 운동 매개변수는 시간의 함수로서 종 농도에 대한 표현으로부터 결정된다.기질 또는 생성물의 농도는 반응이 평형에 가까워질 수 있도록 초기 급속 과도 후 및 충분히 긴 시간 동안 기록된다.진행 곡선 실험은 효소 동역학 초기에 널리 사용되었지만 현재는 덜 일반적이다.
  • 일시적인 동력학 실험입니다.이러한 실험에서, 중간체가 정상 상태 동역학 기간에 도달하는 초기 고속 과도 기간 동안 반응 거동을 추적한다.이러한 실험은 전문 기술(예: 케이지된 화합물의 플래시 광분해) 또는 신속한 혼합(예: 정지 흐름, 급랭 흐름 또는 연속 흐름)이 필요하기 때문에 위의 두 가지 클래스 중 어느 쪽보다 수행하기가 더 어렵습니다.
  • 릴렉스 실험.이들 실험에서 효소, 기질 및 생성물의 평형 혼합물은 예를 들어 온도, 압력 또는 pH 점프로 교란되어 평형으로의 복귀가 감시된다.이러한 실험의 분석은 완전히 가역적인 반응을 고려해야 한다.또한 완화 실험은 기계적 세부 사항에 상대적으로 둔감하며, 따라서 적절한 조건에 있을 수 있지만 일반적으로 메커니즘 식별에 사용되지 않는다.

효소측정법은 샘플링 방법에 따라 연속측정법과 시료를 채취한 불연속측정법으로 나눌 수 있다.

분광 광도계의 온도 조절 큐벳 홀더.

연속 검사

연속 측정이 가장 편리하며, 한 번의 측정으로 더 이상의 작업 없이 반응 속도를 얻을 수 있습니다.연속측정에는 많은 다른 종류가 있다.

분광 광도 측정

분광 광도 측정에서는 분석 용액이 흡수하는 빛의 양을 측정하여 반응 과정을 따릅니다.이 빛이 가시 영역에 있으면 실제로 검사 색상의 변화를 볼 수 있으며, 이를 측색 검사라고 합니다.테트라졸륨 염료를 기질로 사용하는 산화 환원 분석인 MTT 분석은 측색 분석의 한 예입니다.

일반적인 코엔자임 NADH와 NADPH는 환원된 형태로 자외선을 흡수하지만 산화되는 형태로는 흡수하지 않기 때문에 자외선이 자주 사용됩니다.따라서 NADH를 기질로 하는 산화환원효소는 코엔자임을 [6]소비할 때 340nm의 파장에서 자외선 흡수율의 감소를 추적함으로써 측정될 수 있다.

직접 측정과 결합 측정

포도당 6-인산탈수소효소를 이용한 헥소키나아제 결합분석.

효소 반응이 빛의 흡광도에 변화를 일으키지 않는 경우에도 조합된 어세이(assigned assay)를 이용하여 효소를 분광광도 어세이(spectrophotometric assay)를 사용할 수 있다.여기서 한 반응의 생성물을 검출하기 쉬운 다른 반응의 기질로 사용한다.예를 들어 그림 1은 포도당 6-인산 탈수소효소를 이용하여 포도당 6-인산 생성과 NADPH 생성을 결합함으로써 측정될 수 있는 헥소키나아제에 대한 결합 분석을 나타낸다.

형광 투시

형광은 분자가 다른 파장의 빛을 흡수해 한 파장의 빛을 내는 것이다.형광측정법은 효소 반응을 측정하기 위해 기질에서 생성물의 형광 차이를 이용한다.이러한 측정법은 일반적으로 분광광도 측정법보다 훨씬 더 민감하지만, 불순물에 의한 간섭과 빛에 노출될 때 많은 형광성 화합물의 불안정성에 시달릴 수 있습니다.

이러한 분석의 예는 다시 뉴클레오티드 조효소 NADH와 NADPH의 사용이다.여기서 환원된 형태는 형광체이며 산화물은 비형광체이다.따라서 산화반응은 형광의 감소와 환원반응의 [7]증가로 이어질 수 있다.β-갈락토시다아제 측정용 4-메틸리페릴-β-D-갈락토시드, 칸디다 루고사 리파아제 [8]측정용 4-메틸리페릴-부티레이트 등 효소 촉매 반응으로 형광색소를 방출하는 합성 기질도 이용할 수 있다.

열량 측정

루미놀의 화학 발광

열량 측정은 화학 반응에 의해 방출되거나 흡수되는 열을 측정하는 것입니다.이러한 분석은 매우 일반적이며, 많은 반응들이 열의 변화를 수반하고 마이크로 열량계를 사용하면 많은 효소나 기질이 필요하지 않습니다.이러한 측정법은 다른 방법으로 [9]측정이 불가능한 반응을 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

화학 발광

화학발광은 화학반응에 의한 빛의 방출이다.일부 효소 반응은 빛을 생성하며 이것은 생성물의 형성을 감지하기 위해 측정될 수 있다.생성된 빛은 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 사진 필름에 포착될 수 있기 때문에 이러한 유형의 분석은 매우 민감할 수 있지만 반응에 의해 방출되는 모든 빛이 감지되는 것은 아니기 때문에 정량화하기 어려울 수 있습니다.

효소화학발광(ECL)에 의한 고추냉이 과산화효소 검출은 웨스턴 블롯의 항체를 검출하는 일반적인 방법이다.또 다른 예로는 루시페라아제라는 효소가 있는데, 이것은 반딧불에서 발견되고 자연적으로 기질 루시페린으로부터 빛을 생성합니다.

광산란

정적 광산란 중량의 평균 몰 질량과 용액 중의 고분자 농도의 곱을 측정한다.측정 시간 동안 1종 이상의 총 농도가 고정될 경우, 산란 신호는 용액의 무게 평균 몰 질량의 직접적인 측정값으로, 복합체가 형성되거나 분리됨에 따라 변화합니다.따라서 측정은 복합체의 화학량 측정과 속도론을 정량화한다.단백질 동력학의 빛 산란 분석은 효소가 필요 없는 매우 일반적인 기술이다.

마이크로스케일 열영동

마이크로스케일 열영동(MST)[10]은 [11]평형상태에서 분자/기체의 크기, 전하 및 수화 엔트로피를 측정합니다.형광표지 기질의 열영동 움직임은 효소에 의해 변형됨에 따라 크게 변화한다.이 효소 활성은 실시간으로 [12]높은 시간 분해능으로 측정할 수 있습니다.전체 광학 MST 방법의 재료 소모량은 매우 낮으며, 활성 및 억제에 대한 효소 속도 상수를 측정하기 위해 5μl 시료 부피와 10nM 효소 농도만 있으면 됩니다.MST를 사용하면 분석가는 두 기판에 서로 다른 형광체로 라벨이 붙어 있는 경우 두 기판의 수정을 동시에 측정할 수 있습니다(멀티플렉싱).따라서 기판경쟁실험을 할 수 있다.

불연속 측정

불연속측정이란 효소 반응에서 일정 간격으로 샘플을 채취하여 이들 샘플에서 제품 생산량 또는 기질 소비량을 측정하는 것을 말한다.

방사선 측정

방사선측정법은 기판으로의 방사능 도입 또는 기판으로부터의 방사능 방출을 측정한다.이러한 분석에 가장 많이 사용되는 방사성 동위원소는 C, P, S, I이다.방사성 동위원소는 기질의 단일 원자에 특정 라벨을 붙일 수 있기 때문에 이러한 분석은 매우 민감하고 특이하다.그것들은 생화학에 자주 사용되며 종종 조생 추출물의 특정 반응을 측정하는 유일한 방법입니다.

방사능은 일반적으로 섬광 카운터를 사용하여 이러한 절차에서 측정된다.

크로마토그래피

크로마토그래피 검사는 크로마토그래피로 반응 혼합물을 성분으로 분리하여 생성물의 형성을 측정한다.이것은 보통 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 수행되지만, 박층 크로마토그래피라는 간단한 기술을 사용할 수도 있습니다.이 접근법은 많은 재료가 필요할 수 있지만, 기판/제품에 방사성 또는 형광 태그를 부착하여 민감도를 높일 수 있다.또한 HPLC 기기보다 몇 배 높은 펌프 압력에서 작동하는 개선된 크로마토그래피 기기(예: 초고압 액체 크로마토그래피)로 프로토콜을 전환함으로써 분석 민감도가 향상되었습니다(고성능 액체 크로마토그래피#펌프 [13]압력 참조).

평가에 영향을 미치는 요인

효소 활성을 고압으로 측정하는 압력실.

여러 요인이 검사 결과에 영향을 미치며,[14] 최근 검토에서는 검사를 계속 진행하기 위해 모니터링해야 하는 다양한 파라미터가 요약되어 있습니다.

염분 농도

대부분의 효소는 극도로 높은 염분 농도를 견디지 못한다.이온은 단백질의 약한 이온 결합을 방해한다.대표적인 효소는 소금 농도 1~500 mM에서 활성된다.평소처럼 호염조류나 박테리아와 같은 예외는 있다.

온도의 영향

모든 효소는 유기체에 특정한 온도 범위 내에서 작용한다.온도 상승은 일반적으로 반응 속도의 증가로 이어집니다.온도가 높아지면 반응 속도가 급격히 떨어지기 때문에 증가에는 한계가 있다.이는 효소 활성 [15]부위의 3차원 구조를 안정화시키는 수소 결합과 약한 이온 분해로 인한 단백질 구조의 변성(변성)에 기인한다.인간 효소의 "최적" 온도는 보통 35 - 40 °C이다.인간의 평균 온도는 37 °C입니다.인간의 효소는 40°C 이상의 온도에서 빠르게 변성되기 시작합니다.온천에서 발견되는 호열성 고세균의 효소는 100°[16]C까지 안정적입니다.그러나 효소 반응의 "최적" 속도에 대한 생각은 오해를 불러일으킨다. 왜냐하면 어떤 온도에서도 관찰되는 속도는 반응 속도와 변성 속도라는 두 가지 속도의 산물이기 때문이다.1초간 검사 측정 활성을 사용하면 고온에서 높은 활성을 제공하지만, 1시간 이상 검사 측정 제품 형성을 사용하면 이 온도에서 낮은 활성을 제공합니다.

pH의 영향

대부분의 효소는 pH에 민감하고 특정한 활동 범위를 가지고 있다.모두 최적의 pH를 가집니다.pH는 이온 결합과 수소 결합을 끊음으로써 효소의 3차원 형태를 변성(변성)시킴으로써 효소 활동을 멈출 수 있다.대부분의 효소는 6과 8의 pH 사이에서 기능하지만, 위 속의 펩신은 2의 pH에서, 트립신은 8의 pH에서 가장 잘 작동합니다.

기판 포화도

기질 농도를 높이면 반응 속도(효소 활성)가 증가한다.그러나 효소 포화도는 반응 속도를 제한한다.효소는 모든 분자의 활성 부위가 대부분 점유될 때 포화된다.포화점에서는 기판이 아무리 추가되어도 반응이 빨라지지 않습니다.반응 속도의 그래프는 안정될 것이다.

혼잡도

용액에 있는 많은 양의 고분자는 고분자 [17]밀집이라고 불리는 효과를 통해 효소 반응의 속도와 평형 상수를 바꿀 것입니다.

효소 분석 목록

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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외부 링크