웨스턴 블롯

Western blot
서부 블록과 혼동하지 말 것.
지방산으로 변형된 단백질을 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯

웨스턴 블롯 또는 웨스턴 블롯은 균질화 또는 [1]추출물의 샘플에서 특정 단백질을 검출하기 위해 분자 생물학 및 면역 유전학에서 널리 사용되는 분석 기술입니다.

웨스턴 블롯 기술은 복합체에서 특정 단백질을 분리하는 작업을 달성하기 위해 크기별 분리, 단백질의 고체 지지체로의 전달, 1차 및 2차 항체를 사용하여 표적 단백질을 [1]표시하여 시각화하는 세 가지 요소를 사용한다.특정 표적 단백질을 인식하고 결합하는 합성 또는 동물 유래 항체(1차 항체로 알려져 있음)가 생성된다.전기영동막은 1차 항체를 포함한 용액에서 세척한 후 여분의 항체를 씻어냅니다.1차 항체를 인식하고 결합하는 2차 항체를 첨가한다.2차 항체는 염색, 면역형광, 방사능 등 다양한 방법으로 시각화되어 특정 표적단백질을 간접 검출할 수 있다.

다른 관련 기술로는 닷 블롯 분석, 정량적 닷 블롯, 면역 조직 화학 및 면역 세포 화학이 있으며, 항체는 면역 유지에 의해 조직과 세포 내의 단백질을 검출하기 위해 사용된다. 그리고 효소 연결 면역 흡수 분석(ELISA)이 있다.

웨스턴 블롯이라는 이름은 서던 블롯의 발명가인 영국 생물학자인 에드윈 서던의 이름을 딴 DNA 검출 기술인 서던 블롯에 대한 놀이이다.마찬가지로 RNA의 검출을 노던 [2]블롯이라고 한다."웨스턴 블롯"이라는 용어는 1981년 [3]W. 닐 버넷에 의해 만들어졌지만, 이 방법 자체는 1979년 스위스 [4]바젤에 있는 프리드리히 미셰르 연구소의 해리 토빈의 연구실에서 시작되었다.1979년과 2019년 사이에 "40만 개 이상의 PubMed 목록에 있는 출판물의 제목, 추상 및 키워드에 언급되었으며, 여전히 가장 많이 사용되는 단백질 분석 [5]기법일 수 있다."

적용들

한 연구자가 단백질이 항체에 결합하는지 여부를 판단하기 위해 서부 블롯을 검사한다.

웨스턴 블롯은 단일 단백질의 정성적 검출과 단백질 변형(번역 후 변형 등)을 위해 생화학에서 광범위하게 사용된다.모든 단백질 관련 출판물의 최소 8-9%가 웨스턴 [5]블롯을 적용하는 것으로 추정된다.이것은 단백질의 복잡한 혼합물 내에서 특정 단일 단백질의 존재를 식별하는 일반적인 방법으로 사용된다.블롯막상의 단백질 밴드의 크기 및 색강도로부터 단백질의 반정량적 추정을 도출할 수 있다.또한 알려진 농도의 정제 단백질 희석 시리즈를 사용하여 단백질 농도를 보다 정확하게 추정할 수 있다.웨스턴 블롯은 복제 후 단백질 생성을 검증하기 위해 일상적으로 사용된다.또한 HIV 테스트 또는 BSE-테스트와 같은 의료 진단에도 사용됩니다.

확인 HIV 테스트는 사람 혈청 샘플에서 항HIV 항체를 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 사용합니다.기존의 HIV 감염 세포로부터의 단백질을 위와 같이 분리하여 막에 얼룩지게 한다.다음으로 1차 항체 배양공정에서 피시험 혈청을 도포하고 유리항체를 씻어내고 효소신호에 연결된 2차 항인간항체를 첨가한다.얼룩진 띠는 환자의 혈청이 [6]항체를 포함하는 단백질을 나타냅니다.또한 웨스턴 블롯은 광우병(BSE, 흔히 광우병이라고 함)[7]에 걸린 소의 오염된 쇠고기 소비와 관련된 프리온 질환의 일종인 변종 크로이츠펠트-야콥병에 대한 최종 테스트로 사용된다.

또 다른 적용은 툴라레미아 진단이다.F. tularensis에 대한 Western Blot의 항체 검출 능력 평가 결과 민감도는 거의 100%이고 특이성은 99.6%[8]인 것으로 밝혀졌다.

라임병 테스트의 일부 형태는 웨스턴 [9]블롯을 사용한다.웨스턴 블롯은 B형 간염 및 HSV-2([10][11]헤르페스 타입 2) 감염에 대한 확인 테스트로도 사용될 수 있습니다.수의학에서는 고양이의 [12]FIV+ 상태를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 사용하기도 한다.

웨스턴 블롯 기술의 추가 적용에는 세계반도핑기구(WADA)의 사용이 포함된다.혈액 도핑은 적혈구 양을 증가시키기 위해 특정 기술 및/또는 물질을 오용하는 것으로, 신체가 근육으로 더 많은 산소를 운반할 수 있게 하여 스태미나와 성과를 증가시킨다.혈액 도핑에는 에리트로포이에틴(EPO), 합성산소 운반체 및 수혈 등 세 가지 물질 또는 방법이 사용됩니다.WADA의 금지 물질 및 방법 목록에서는 모두 사용이 금지되어 있습니다.웨스턴 블롯 기법은 2014 FIFA 월드컵 [13]당시 도핑 반대 캠페인에 사용되었다.총 1000개 이상의 샘플이 스위스 로잔의 WADA 공인 연구소에서 [14]Reichel 등에 의해 수집 및 분석되었습니다.웨스턴 블롯 기법을 이용한 최근 연구에서는 일상적인 [15]분석에 최적화된 새로운 Velum SAR 프리캐스트 수평겔을 기반으로 혈액과 소변에서 EPO의 개선된 검출을 보여주었다.수평 SAR-PAGE를 프리캐스트 필름 지원 Velum SAR 겔과 함께 채택함에 따라, rEPO의 마이크로 선량 적용의 식별 능력이 크게 향상되었다.

절차.

웨스턴블로트법은 3차원 구조로 토종단백질을 분리하는 겔 전기영동법 또는 폴리펩타이드 길이로 변성단백질을 분리하는 변성단백질, 이어서 막(주로 PVDF 또는 니트로셀룰로오스)으로의 전기영동전달과 블롯막의 특정단백질을 시각화하는 면역유지법으로 구성된다.SDS-PAGE는 일반적으로 단백질의 변성 전기영동 분리에 사용된다.단백질은 양전하, 음전하 또는 중성전하가 될 수 있기 때문에, SDS는 일반적으로 모든 단백질에 균일한 음전하를 주기 위해 완충제로 사용됩니다.이러한 유형의 전기영동은 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide 겔 전기영동)로 알려져 있습니다.전기영동 전에 단백질 샘플은 종종 존재하는 단백질을 변성시키기 위해 끓여진다.이것은 단백질이 크기에 따라 분리되도록 하고 단백질 분해효소(단백질을 분해하는 효소)가 샘플을 분해하는 것을 막는다.전기영동분리 후 단백질은 막(일반적으로 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 이동된다.블롯의 단백질을 시각화하고 적절한 전달이 이루어지도록 하기 위해 막은 종종 폰소 S로 염색된다.다음으로 단백질은 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 우유(또는 다른 차단제)로 차단되고, 다음으로 표적 [4][16]단백질에 특정한 항체로 염색된다.마지막으로, 막은 첫 번째 항체 얼룩을 인식하는 2차 항체로 염색될 것이며, 이는 다양한 방법으로 검출에 사용될 수 있다.겔 전기영동 단계는 항체의 교차반응성 문제를 해결하기 위해 웨스턴 블롯 분석에 포함됩니다.

겔 전기영동

주요 기사:겔 전기영동

샘플의 단백질은 겔 전기영동을 사용하여 분리된다.단백질의 분리는 등전점(pI), 분자량, 전하 또는 이들 요소의 조합에 의해 이루어질 수 있다.분리의 성질은 검체의 처리와 젤의 성질에 따라 달라집니다.

지금까지 가장 일반적인 유형의 겔 전기영동은 폴리아크릴아미드겔 및 도데실황산나트륨(SDS)을 탑재한 버퍼를 사용한다.SDS-PAGE(SDS polyacrylamide 겔 전기영동)는 폴리펩타이드가 강력한 환원제로 처리된 후 변성상태로 유지되어 2차 및 3차 구조(예를 들어 디술피드 결합)를 제거한다.-S]에서 술프하이드릴기 [SH, SH])까지 단백질 분리를 가능하게 한다.샘플 단백질은 음전하를 띤 SDS로 덮여 음이온이 되고, 겔의 아크릴아미드 메쉬를 통해 양전하를 띤(대개 높은 전압의) 양극으로 이동한다.더 작은 단백질은 이 망사를 통해 더 빨리 이동하며, 따라서 단백질은 크기에 따라 분리된다(일반적으로 킬로달톤, kDa로 측정).아크릴아미드의 농도는 겔의 분해능을 결정합니다. 아크릴아미드 농도가 클수록 저분자량 단백질의 분해능이 향상됩니다.아크릴아미드 농도가 낮을수록 고분자량 단백질의 분해능이 향상됩니다.단백질은 대부분의 블롯에서 젤을 따라 한 차원만 이동한다.

샘플이 겔의 웰에 로드됩니다.한 레인은 일반적으로 알려진 분자량의 단백질의 상업적인 혼합물인 표지 또는 사다리를 위해 남겨져 있으며, 일반적으로 눈에 보이는 색 띠를 형성하기 위해 착색된다.겔을 따라 전압이 가해지면 단백질은 크기에 따라 다른 속도로 겔을 통해 이동한다.이러한 다른 진행 속도(다른 전기영동 이동 장치)는 각 차선 내에서 대역으로 분리됩니다.단백질 띠는 사다리 띠와 비교될 수 있으며, 단백질의 분자량을 추정할 수 있다.

SDS-PAGE 전기영동

또한 단일 샘플의 단백질을 2차원으로 확산시키는 2차원 겔을 사용할 수도 있습니다.단백질은 첫 번째 차원에서는 등전점(중성 순전하를 갖는 pH)과 두 번째 차원에서는 분자량에 따라 분리된다.

갈아타다

항체 검출에 접근 가능한 단백질을 만들기 위해, 그들은 겔 내에서 막으로 이동하는데, 이것은 과정의 필수적인 부분이다.막에는 니트로셀룰로오스(NC) 또는 폴리비닐리덴디플루오르화물(PVDF)의 두 종류가 있다.NC막은 단백질 친화력과 유지능력이 높다.그러나 NC는 부서지기 쉬우며 블롯을 재프로브에 사용할 수 없는 반면 PVDF 막은 블롯을 [17]재프로브할 수 있다.단백질을 전달하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 일렉트로블롯팅이라고 불립니다.일렉트로블롯팅은 전류를 사용하여 음전하 단백질을 겔에서 양전하 양극으로 끌어당기고 PVDF 또는 NC 막으로 끌어당깁니다.단백질은 겔 내의 조직을 유지하면서 겔 내부에서 막으로 이동한다.이전 방법은 겔 위에 막을 올리고 그 위에 여과지를 쌓는 것이다.전체 스택은 모세관 작용에 의해 종이를 위로 이동시키는 완충 용액에 놓이고 단백질도 함께 가져옵니다.실제로 이 방법은 시술 시간이 길기 때문에 일반적으로 사용되지 않습니다.

어느 하나의 전사 공정의 결과, 단백질은 검출을 위해서 박막층에 노광된다.두 종류의 막은 비특이적 단백질 결합 특성(즉, 모든 단백질을 동등하게 결합)으로 선택된다.단백질 결합은 막과 단백질 사이의 하전 상호작용뿐만 아니라 소수성 상호작용에 기초한다.니트로셀룰로오스 막은 PVDF보다 저렴하지만 훨씬 취약하고 반복적인 프로빙을 견딜 수 없습니다.

웨스턴 블롯 전이

총단백질염색

토탈 단백질 염색은 세포막에 성공적으로 전달된 총 단백질을 시각화할 수 있도록 하여 사용자가 단백질 전달의 균일성을 확인하고 레인당 실제 단백질 양과 함께 표적 단백질의 후속 정규화를 수행할 수 있도록 한다.소위 "부하 제어"로 불리는 정상화는 전통적인 절차에서 하우스키핑 단백질의 면역 유지에 기초했지만, 여러 가지 [18]이점 때문에 최근에는 총 단백질 염색으로 치닫고 있다.웨스턴 블롯 정규화를 위해 총 단백질 염색에 대한 최소 7가지 접근법이 설명되었다.폰소S, 얼룩 없는 기술, Sypro Ruby, 에피코논, 쿠마시 R-350, 아미도 블랙, Cy5.[18]신호의 노이즈를 피하기 위해 막을 차단하기 전에 총 단백질 염색을 수행해야 합니다.그럼에도 불구하고, 항체 후 염색도 [19]기술되었다.

막는

세포막은 단백질 결합 능력으로 선택되었으며 항체와 표적 모두 단백질이므로 표적 단백질 검출에 사용되는 세포막과 항체 간의 상호작용을 방지하기 위한 조치를 취해야 한다.비특이적 결합의 차단은 Tween 또는 Triton X100과 같은 세제의 1분 백분율(0.1%)을 포함한 단백질 희석 용액(일반적으로 3~5% 소 혈청 알부민(BSA) 또는 무지방 건조 우유(둘 다 저렴)에 막을 넣어 달성한다.무지방 건조 우유는 사용 가능하기 때문에 선호되지만 우유의 모든 단백질이 모든 검출 [20]대역에 적합한 것은 아니기 때문에 적절한 차단제가 필요하다.묽은 용액 속의 단백질은 표적 단백질이 부착되지 않은 모든 장소에서 막에 부착됩니다.따라서 항체가 첨가되면 세포막과 결합할 수 없으며, 따라서 사용할 수 있는 결합 부위는 특정 표적 단백질뿐이다.이렇게 하면 웨스턴 블롯의 최종 제품 배경이 감소하여 더 명확한 결과를 얻을 수 있으며 잘못된 긍정을 제거할 수 있습니다.

배양

검출 프로세스 중에 리포터 효소에 연결된 변형 항체로 관심 단백질을 막에 "프로브"한다.이 효소는 적절한 기질에 노출되면 측색 반응을 일으켜 색을 생성한다.여러 가지 이유로 인해 이 작업은 일반적으로 2단계 프로세스로 진행되지만, 현재는 특정 애플리케이션에 대해 1단계 탐지 방법이 있습니다.

일차항체

1차 항체는 숙주 종이나 면역 세포 배양물이 관심 단백질(또는 그 일부)에 노출될 때 생성됩니다.보통, 이것은 면역 반응의 일부인 반면, 여기서는 그것들은 수확되어 단백질을 직접 결합시키는 민감하고 특정한 검출 도구로 사용됩니다.

차단 후 PBS 또는 TBST 세척 버퍼에 희석된 1차 항체(일반적으로 0.5~5마이크로그램/mL) 용액을 상온에서 보통 1시간 또는 4℃에서 밤새도록 약한 교반으로 막과 함께 배양한다.또한 다른 온도에서 배양될 수 있으며, 낮은 온도는 표적 단백질에 대한 특이성(신호)과 비특이성(노이즈) 모두와 더 많은 결합과 관련이 있다.배양 후 워시 버퍼로 여러 번 세척하여 결합되지 않은 1차 항체를 제거함으로써 [20]배경을 최소화한다.일반적으로 세척 완충액은 완충 식염수 용액과 소량의 세제로 구성되며, 때로는 분유나 BSA로 구성됩니다.

이차항체

결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 막을 헹군 후, 이 막은 2차 항체로 알려진 다른 항체에 노출된다.항체는 동물원(또는 동물원 하이브리드마 배양)에서 나온다.2차 항체는 1차 항체의 종 특이적인 부분을 인식하고 결합한다.따라서 항마우스 2차 항체는 거의 모든 마우스 소스의 1차 항체에 결합하며, '항종' 항체(예: 항마우스, 항구아제 등)라고 할 수 있다.표적 단백질의 검출을 가능하게 하기 위해 2차 항체는 일반적으로 비오틴 또는 알칼리성 포스파타아제 또는 고추라디시 과산화효소 등의 리포터 효소와 결합된다.이는 여러 2차 항체가 하나의 1차 항체에 결합하고 신호를 강화하여 SDS-PAGE만으로 볼 수 있는 것보다 훨씬 낮은 농도의 단백질을 검출할 수 있음을 의미한다.

고추냉이 과산화효소는 화학발광에 의한 표적단백질 검출을 가능하게 하기 위해 일반적으로 2차 항체와 연결되어 있다.화학 발광 기질은 고추냉이 과산화효소에 의해 분해되어 발광의 생성을 일으킨다.따라서 발광의 생성은 고추냉이 페르옥시다아제 결합 2차 항체의 양에 비례하므로 간접적으로 표적 단백질의 존재를 측정한다.감광성 필름 시트를 막에 대고, 반응으로부터의 빛에의 노광에 의해서, 블롯에 결합된 항체의 화상을 생성한다.저렴하지만 덜 민감한 접근법은 과산화수소가 1%인 4-클로로나프톨 착색을 사용합니다. 과산화수소와 4-클로로나프톨의 반응으로 짙은 보라색 착색이 생성되어 특수 사진 필름을 사용하지 않고도 사진을 찍을 수 있습니다.

웨스턴 블롯 결합

ELISPOT 및 ELISA 절차와 마찬가지로 효소에 의해 막에서 볼 수 있는 착색 반응 생성물로 변환되는 기질 분자를 제공할 수 있습니다(아래 파란색 띠 그림 참조).

또 다른 2차 항체 검출 방법은 근적외선 불소포자 결합 항체를 이용한다.형광 색소의 들뜸에서 생성된 빛은 정전기이므로, 형광 검출은 웨스턴 블롯의 단백질에 결합된 라벨 부착 항체에 의해 생성된 신호의 차이를 보다 정확하고 정확하게 측정할 수 있습니다.빛을 동적 상태로 [21]측정하는 화학발광에 비해 세포막상의 단백질의 다른 양에 의해 발생하는 신호를 정적 상태로 측정하기 때문에 단백질을 정확하게 정량할 수 있다.

세 번째 대안은 2차 항체에 결합된 효소가 아닌 방사성 라벨을 사용하는 것이다. 예를 들어 스타필로코커스 단백질 A나 스트렙타비딘과 같은 항체 결합 단백질을 요오드 방사성 동위원소로 라벨링하는 것이다.다른 방법이 더 안전하고 빠르고 저렴하기 때문에 이 방법은 현재 거의 사용되지 않습니다. 그러나 이 접근법의 장점은 광학 소프트웨어(예: 옵티칸트)와 결합할 때 매우 정확한 단백질 정량화를 가능하게 하는 자동 방사선 촬영 기반 이미징의 감도입니다.

원스텝

역사적으로 프로빙 프로세스는 별도의 프로세스에서 1차 및 2차 항체를 비교적 쉽게 생산할 수 있기 때문에 두 단계로 수행되었다.이를 통해 연구자와 기업은 유연성과 비용 절감 측면에서 큰 이점을 얻을 수 있으며 검출 프로세스에 증폭 단계를 추가할 수 있습니다.그러나 높은 처리량 단백질 분석과 낮은 검출 한계의 출현을 고려할 때, 공정을 더 빠르고 더 적은 소모품으로 수행할 수 있는 원스텝 프로브 시스템을 개발하는 데 관심이 있었습니다.여기에는 관심 단백질을 인식하고 검출 가능한 라벨을 포함하는 프로브 항체가 필요하며, 이는 종종 알려진 단백질 태그에 사용할 수 있는 프로브입니다.1차 프로브는 2단계 공정에서 1차 항체와 유사한 방식으로 막과 함께 배양된 후 일련의 세척 단계를 거쳐 직접 검출할 수 있습니다.

방사성 검출 시스템을 이용한 웨스턴 블롯

검출 및 시각화

결합되지 않은 프로브를 씻어낸 후, 웨스턴 블롯은 라벨이 부착되어 해당 단백질에 결합되어 있는 프로브를 검출할 준비가 됩니다.현실적으로 모든 서양인들이 세포막의 한 밴드에서만 단백질을 드러내는 것은 아니다.사이즈 근사치는 전기영동 중에 로드된 마커 또는 래더의 것과 착색 밴드를 비교하여 구한다.이 과정은 일반적으로 샘플 간에 변화해서는 안 되는 액틴 또는 튜불린과 같은 구조 단백질에 대해 반복됩니다.표적 단백질의 양은 구조 단백질로 정규화되어 그룹 간 조절이 이루어집니다.우수한 전략은[22][23] 트리클로로에탄올 또는 에피코논으로 [24]시각화된 총 단백질에 대한 정규화이다.이 방법은 오류 또는 불완전한 전달 시 막에 있는 총 단백질의 양을 보정합니다(웨스턴 블롯 정규화 참조).

측색 검출

비색검출방법은 2차 항체에 결합된 리포터 효소(페옥시다아제 등)와 반응하는 기질과의 웨스턴 블롯 배양에 따라 달라진다.이것은 용해성 염료를 효소 옆에 침전되어 막이 더러워지는 다른 색상의 불용성 형태로 변환합니다.다음으로 수용성 염료를 씻어냄으로써 블롯의 발달을 정지한다.단백질 수치는 농도 측정(얼굴의 강도) 또는 분광 광도 측정을 통해 평가됩니다.

화학 발광 검출

화학발광검출방법은 2차 항체 리포터에 노출되었을 때 발광하는 기질을 가진 웨스턴 블롯의 배양에 의존한다.그런 다음 CCD 카메라에 의해 빛이 감지되며, CCD 카메라는 웨스턴 블롯 또는 사진 필름의 디지털 이미지를 캡처합니다.영상의 비선형성(정확하지 않은 정량화)으로 인해 Western Blot(웨스턴 블롯) 감지를 위한 필름 사용이 서서히 사라지고 있습니다.이미지는 단백질 염색의 상대적 양을 평가하고 광학 밀도의 관점에서 결과를 정량화하는 농도 측정법으로 분석됩니다.최신 소프트웨어에서는 적절한 표준이 사용될 경우 분자량 분석과 같은 추가 데이터 분석이 가능합니다.

웨스턴 블롯 화학 발광 검출

방사성 검출

방사성 라벨은 효소 기질을 필요로 하지 않으며, 오히려 의료용 X선 필름을 웨스턴 블롯에 직접 배치할 수 있다. 웨스턴 블롯은 라벨에 노출될 때 발생하며 관심 있는 단백질 밴드에 해당하는 어두운 영역을 생성한다(위 이미지 참조).방사성 검출 방법은 비용이 많이 들고, 건강과 안전 위험이 높으며, ECL(향상 화학발광)이 유용한 대안을 제공하기[citation needed] 때문에 위험 방사선으로 인해 중요성이 감소하고 있다.

형광 검출

형광 라벨이 부착된 프로브는 빛에 의해 들뜨고, 들뜸의 방출은 웨스턴 블롯의 디지털 이미지를 캡처하여 분자량 분석 및 정량 웨스턴 블롯 분석과 같은 추가 데이터 분석을 가능하게 하는 적절한 방출 필터가 장착된 CCD 카메라와 같은 광센서에 의해 감지됩니다.형광은 정량화의 가장 좋은 방법 중 하나로 간주되지만 화학 [25]발광보다는 덜 민감하다.

세컨더리 프로브

니트로셀룰로오스 막과 PVDF 막의 한 가지 주요 차이점은 각각이 항체를 "제거"하고 후속 항체 탐침을 위해 막을 재사용하는 능력과 관련이 있습니다.니트로셀룰로오스막의 박리에 대해 잘 확립된 프로토콜이 있지만, 보다 견고한 PVDF는 박리가 용이하고 백그라운드 노이즈 제한 실험 전에 더 많은 재사용을 가능하게 합니다.또 다른 차이점은 니트로셀룰로오스와 달리 PVDF는 95% 에탄올, 이소프로판올 또는 메탄올에 담가 사용해야 한다는 것이다.또한 PVDF 막은 더 두껍고 사용 중 손상에 더 강한 경향이 있습니다.

2-D겔 전기영동

주요 기사:2차원 겔 전기영동

2차원 SDS-PAGE는 위에서 설명한 원칙과 기술을 사용합니다. 2-D SDS-PAGE는 이름에서 알 수 있듯이 2차원에서의 폴리펩타이드 이행이 수반됩니다.예를 들어 제1차원에서는 폴리펩타이드가 등전점에 따라 분리되고, 제2차원에서는 폴리펩타이드가 분자량에 따라 분리된다.주어진 단백질의 등전점은 양(예: 리신, 아르기닌) 및 음(예: 글루탐산, 아스파르트산) 하전 아미노산의 상대적인 수에 의해 결정되며, 음( amino) 하전 아미노산은 낮은 등전점에 기여하고 양( amino) 하전 아미노산은 높은 등전점에 기여한다.또한 SDS-PAGE를 사용하여 비환원 조건에서 먼저 시료를 분리할 수 있으며, 서브유닛을 결합하는 이황화물 결합을 분해하는 두 번째 차원에서는 환원 조건에서 시료를 분리할 수 있다.SDS-PAGE는 또한 2차원 겔을 위해 요소-PAGE와 결합될 수 있다.

원칙적으로 이 방법은 하나의 큰 겔에서 모든 세포 단백질을 분리할 수 있도록 한다.이 방법의 주요 장점은 종종 특정 단백질의 서로 다른 동질 형태(예: 음전하를 띤 그룹의 추가에 의해 인산화 된 단백질)를 구별한다는 것이다.분리된 단백질은 겔에서 잘라낸 후 분자량을 식별하는 질량분석법에 의해 분석될 수 있다.

발표

연구자들은 웨스턴 블롯 결과를 우아하게 표현하기 위해 다른 소프트웨어를 사용하여 이미지 섹션을 처리하고 정렬합니다.인기 있는 툴로는 Sciugo, Microsoft PowerPoint, Adobe Illustrator, GIMP 등이 있습니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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