현장 형광 교배

Fluorescence in situ hybridization
보기를 사용하여 셀에서 다중 RNA 시각화RNA FISH 어세스
FISH를 사용한 bcr/abl 재배열(만성 골수성 백혈병과 관련)에 양성인 중상세포.염색체는 파란색으로 보입니다.녹색과 빨간색 점(왼쪽 위)으로 표시된 염색체가 재배열이 있는 염색체입니다.

FISH(Fluorescence in sit hybridization)는 높은 배열 상보성으로 핵산 배열의 특정 부분에만 결합하는 형광 프로브를 사용하는 분자 세포 유전학 기술이다.1980년대[1] 초 생물의학 연구자들에 의해 염색체에 특정 DNA 배열의 유무를 검출하고 국소화하기 위해 개발되었다.형광 현미경은 형광 탐침이 염색체에 결합되어 있는 위치를 알아내기 위해 사용될 수 있다.FISH는 종종 유전자 상담, 의학, 그리고 종 [2]식별에 사용하기 위해 DNA에서 특정한 특징을 찾는 데 사용됩니다.또한 FISH를 사용하여 세포, 순환 종양 세포 및 조직 샘플에서 특정 RNA 표적(mRNA, lncRNA 및 miRNA)[citation needed]을 검출하고 국소화할 수 있습니다.이러한 맥락에서, 그것은 세포와 조직 내에서 유전자 발현의 공간적-시간적 패턴을 정의하는 것을 도울 수 있다.

프로브 – RNA 및 DNA

C2C12 분화세포에서 miR-133(녹색)과 myogenin mRNA(빨간색)의 ViewRNA 검출

생물학에서 프로브는 관심 있는 뉴클레오티드 염기서열을 보완하는 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다.

RNA 프로브는 조직 및 세포에서 mRNA,[3][4][5] lncRNA 및 miRNA의 시각화를 위해 유전자 또는 유전자 내의 모든 배열을 위해 설계될 수 있다.FISH는 세포 재생 주기, 특히 염색체 [9]이상에 대한 핵의 상간 검사를 통해 사용됩니다.FISH는 유사한 [9]염색체를 유인할 인공 염색체 기초가 있는 탐침을 만들어냄으로써 정확히 특정된 염색체를 식별하기 훨씬 쉬운 일련의 보관 사례를 분석할 수 있게 해준다.핵 이상이 [9]감지될 때 각 프로브에 대한 하이브리드화 신호입니다.mRNA 및 lncRNA 검출을 위한 각 프로브는 약 20~50쌍의 올리고뉴클레오티드 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 40~50bp의 공간을 커버한다.자세한 내용은 사용되는 특정 FISH 기술에 따라 달라집니다.miRNA 검출을 위해 프로브는 miRNA의 특정 검출을 위해 독점적인 화학작용을 사용하며 miRNA 시퀀스 전체를 커버합니다.

4개의 다른 탐침으로 표시된 요관 세포

프로브는 종종 인간 게놈 프로젝트에서 사용하기 위해 분리, 정제 및 증폭된 DNA 조각에서 파생됩니다.인간 게놈의 크기는 직접 배열될 수 있는 길이에 비해 너무 커서, 게놈을 조각으로 나눌 필요가 있었다. (최종 분석에서, 이 조각들은 배열 특이적 핵산 분해 효소를 사용하여 각 조각의 복사본을 더 작은 조각으로 소화하는 것으로 정렬되었다.크기 결정 크로마토그래피를 사용하고 그 정보를 사용하여 큰 조각이 서로 겹치는 위치를 판별합니다.조각들을 각각의 DNA 배열로 보존하기 위해, 조각들은 지속적으로 박테리아 집단을 복제하는 시스템에 추가되었다.각각의 집단이 하나의 인공 염색체를 유지하는 박테리아 복제 집단은 전 세계의 다양한 실험실에 저장되어 있다.인공염색체(BAC)는 도서관이 있는 모든 연구실에서 배양, 추출 및 라벨 부착이 가능합니다.게놈 라이브러리는 종종 그들이 개발된 기관의 이름을 따서 붙여진다.예를 들어 RPCI-11 라이브러리는 뉴욕 버팔로의 Roswell Park Comprehensive Cancer Center(이전에는 Roswell Park Cancer Institute)에서 이름을 따온 것입니다.이들 fragment는 약 10만 개의 베이스 페어로, 대부분의 FISH 프로브의 기초가 됩니다.

준비 및 하이브리드 프로세스– RNA

RNA FISH를 사용하는 목적은 세포, 조직 단면 또는 전체 [10]마운트에서 표적 mRNA 전달을 감지하는 것입니다.이 프로세스는 조직 준비(전 하이브리드화), 하이브리드화 및 세척(후 하이브리드화)의 세 가지 주요 절차로 수행됩니다.

RNA FISH를 실시하기 위한 적절한 조직부위를 채취하는 것부터 시작하여 세포, 순환종양세포(CTC), 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FPE) 또는 냉동조직부위를 고정한다.일반적으로 사용되는 고정제는 인산염 완충 식염수(PBS)[10]의 4% 포름알데히드 또는 파라포름알데히드(PFA)입니다.FISH는 고정되지 않은 [11]세포에서도 성공적으로 수행되었습니다.고정 후 시료를 투과시켜 하이브리드화 시약을 투과시킨다.Tween-20 또는 Triton X-100과 같은 조직 투과성을 [12]높이기 위해 0.1% 농도의 세제를 사용하는 것이 일반적이다.

교배 공정은 온도, pH, 염분 농도, 교배 반응 시간 등 모든 최적의 조건을 갖추는 것이 중요하다.필요한 모든 조건을 확인한 후 먼저 20개의 올리고뉴클레오티드 쌍으로 구성된 표적 특이 프로브를 표적 RNA에 첨가함으로써 하이브리드화 단계를 시작할 수 있다.개별적이지만 호환되는 신호 증폭 시스템을 통해 다중 검사를 실행할 수 있습니다(측정당 최대 2개의 표적).신호 증폭은 일련의 순차적 하이브리드화 [13]단계를 통해 이루어집니다.

하이브리드화 공정 후 세척 공정을 실시한다.이러한 단계는 비특이적 잡종을 제거하고 샘플에서 결합되지 않은 프로브 분자를 제거하여 백그라운드 시그널링을 줄이는 것을 목적으로 합니다.에탄올 세척의 사용은 일반적으로 조직이나 [14]세포의 자가 형광을 줄이기 위해 이 단계에서 사용됩니다.검사가 끝나면 공초점 형광 현미경 및 키언스 [12]현미경과 같은 형광 현미경으로 조직 샘플을 시각화합니다.

준비 및 하이브리드 프로세스– DNA

핵에서 유전자의 국부화를 위한 FISH 실험의 원칙 체계.

먼저 프로브를 구축합니다.프로브는 타깃과 특별히 교배할 수 있을 정도로 커야 하지만 교배 프로세스를 방해할 정도로 커서는 안 됩니다.프로브에는 형광체, 항체 대상 또는 비오틴이 직접 부착됩니다.태그 부착은 닉 번역이나 태그 부착 뉴클레오티드를 이용한 중합효소 연쇄 반응과 같은 다양한 방법으로 이루어질 수 있습니다.

그 후, 상간 또는 중기의 염색체 제제가 생성된다.염색체들은 기질에 단단히 부착되어 있는데, 보통 유리다.반복적인 DNA 배열은 샘플에 짧은 DNA 조각을 추가하여 차단해야 합니다.그런 다음 탐침은 염색체 DNA에 적용되고 잡종을 하는 동안 약 12시간 동안 배양된다.여러 세척 단계를 통해 모든 하이브리드 또는 부분적으로 하이브리드된 프로브를 제거합니다.그런 다음 염료를 자극하고 이미지를 기록할 수 있는 현미경을 사용하여 결과를 시각화하고 정량화합니다.

형광신호가 약할 경우 현미경의 검출역치를 초과하기 위해 증폭이 필요할 수 있다.형광 신호 강도는 프로브 라벨링 효율성, 프로브 유형, 염료 유형 등 여러 요소에 따라 달라집니다.형광 태그 부착 항체 또는 스트렙타비딘이 염료 분자에 결합되어 있다.이러한 세컨더리 컴포넌트는 강한 신호를 가지도록 선택됩니다.

프로브 및 분석의 변화

FISH는 매우 일반적인 기술입니다.다양한 FISH 기술 간의 차이는 보통 프로브의 순서와 라벨의 변화 및 조합 사용 방법에 기인합니다.프로브는 cellular와 acellular의 두 가지 범주로 나뉩니다.형광 "장소"에서 하이브리드화는 프로브의 세포 배치를 의미합니다.

프로브 크기는 긴 프로브가 짧은 프로브보다 덜 특이적으로 교배되기 때문에 중요하며, 따라서 주어진 표적 서열을 보완하는 짧은 DNA 또는 RNA(종종 10-25개의 뉴클레오티드)가 종종 표적 위치를 찾기 위해 사용된다.오버랩은 검출 가능한 기능의 분해능을 정의합니다.예를 들어, 실험의 목적이 전위점의 브레이크포인트를 검출하는 경우, 프로브의 오버랩(인접 프로브에 1개의 DNA 시퀀스가 포함되는 정도)에 의해 브레이크포인트가 검출될 가능성이 있는 최소 윈도우가 정의됩니다.

프로브 시퀀스의 혼합에 따라 프로브가 검출할 수 있는 기능의 유형이 결정됩니다.전체 염색체를 따라 교배되는 탐침은 특정 염색체의 수를 세거나, 전위를 보여주거나, 염색질의 염색체 외 단편을 식별하는데 사용된다.이것은 종종 "전체 염색체 그림"이라고 불립니다.만약 가능한 모든 탐침을 사용한다면, 모든 염색체, (전체 게놈)는 형광으로 표시될 것이고, 이것은 개별 배열의 특징을 결정하는 데 특별히 유용하지 않을 것이다.그러나 DNA의 특정 영역(위치)에 특정한 작은 프로브의 혼합물을 만들 수 있습니다. 이러한 혼합물은 결실 돌연변이를 검출하는 데 사용됩니다.특정 색상과 조합할 경우 궤적별 프로브 혼합물을 사용하여 매우 구체적인 전이를 검출합니다.특별한 궤적 특이적 프로브 혼합물은 각 염색체를 식별하기에 충분히 구별되는 염색체의 중심체 영역에 결합함으로써 염색체를 계수하는 데 종종 사용된다(염색체 13, 14, 21, 22 제외).

다른 다양한 기법은 다른 색상의 프로브를 혼합하여 사용합니다.형광색소 혼합물의 색범위를 검출할 수 있으므로 인간 염색체는 전염색체 프로브 혼합물을 이용한 특징적인 색상과 다양한 색비로 동정할 수 있다.쉽게 구별할 수 있는 형광 염료 색상보다 더 많은 염색체가 있지만 프로브 혼합 비율을 사용하여 2차 색상을 만들 수 있습니다.비교 유전체 교배와 마찬가지로 2차 색상의 프로브 혼합물은 동일한 염색체에 대해 다른 색상의 프로브 2세트의 정확한 비율을 혼합함으로써 생성된다.이 기술은 때때로 M-FISH라고 불린다.

M-FISH의 다양한 색상을 가능하게 하는 동일한 물리학을 전위 검출에 사용할 수 있습니다.즉, 인접한 색상이 겹치는 것처럼 보이므로 보조 색상이 관찰됩니다.일부 측정법은 관심 있는 경우 보조 색상이 있거나 표시되지 않도록 설계되어 있습니다.예를 들어 BCR/ABL 전이 검출이 있으며, 보조 색상은 질병을 나타냅니다.이 변형은 종종 이중 융합 FISH 또는 D-FISH라고 불립니다.2차 색상의 부재가 병리적인 반대 상황에서는 중단점 중 하나만 알려져 있거나 일정한 위치 이동을 조사하는 데 사용되는 분석으로 설명된다.위치 특이적 탐침은 중단점의 한쪽과 다른 한쪽 온전한 염색체에 대해 만들어진다.정상 세포에서는 2차 색상이 관찰되지만 전위 발생 시 원색만 관찰됩니다.이 기술은 때때로 "break-sparate FISH"라고 불립니다.

단분자 RNA FISH

Stellaris® RNA[15] FISH 또는 [16]smFISH라고도 하는 단일 분자 RNA FISH는 얇은 조직 샘플 층에서 mRNA 및 기타 긴 RNA 분자를 검출하고 정량화하는 방법입니다.표적은 여러 개의 짧은 단일 라벨이 부착된 올리고뉴클레오티드 [17]프로브의 적용을 통해 확실하게 촬영될 수 있다.최대 48개의 형광 라벨이 부착된 올리고가 단일 mRNA 분자에 결합함으로써 광시야 형광 현미경 영상에서 각 표적 mRNA를 정확하게 검출하고 국부화하기에 충분한 형광을 제공한다.프로브가 의도한 시퀀스에 결합하지 않으면 [18]배경과 구별될 정도로 국부적 형광을 충분히 얻을 수 없다.

단분자 RNA FIXH 측정법은 단순 또는 다중으로 수행될 수 있으며 정량 PCR의 후속 실험으로 사용하거나 형광 항체 측정과 동시에 촬영할 수 있습니다.이 기술은 암 진단,[19] 신경과학, 유전자 발현 분석,[20] 동반자 진단 등에 응용될 가능성이 있다.

파이버 피쉬

섬유 FISH, 상간염색체를 기존의 FISH와 같이 단단히 감겨 있거나 상간 FISH와 같이 염색체 영역 배열을 채택하지 않고 직선상으로 뻗어나가도록 슬라이드에 부착하는 것을 특징으로 하는 상간 또는 중상제제의 대체기술.이것은 슬라이드에 고정된 후 용해된 세포 또는 정제된 DNA 용액에 슬라이드의 길이를 따라 기계적 전단을 적용함으로써 달성됩니다.염색체 빗으로 알려진 기술이 이 목적을 위해 점점 더 많이 사용되고 있다.염색체의 확장된 배치는 심지어 몇 킬로베이스까지 극적으로 더 높은 분해능을 가능하게 한다.파이버 FISH 샘플의 준비는 개념적으로는 간단하지만 상당히 숙련된 기술이며, 전문 실험실만이 [21]이 기술을 일상적으로 사용합니다.

Q-FISH

주요 기사 : Q-FISH

Q-FISH는 FISH와 PNA 및 컴퓨터 소프트웨어를 결합하여 형광 강도를 정량화합니다.이 기술은 텔로미어 길이 연구에서 일상적으로 사용됩니다.

플로피시

주요 기사:플로피시

Flow-FISH는 세포 단위 형광 측정을 사용하여 자동으로 FISH를 수행합니다.

마피시

미세유체학 지원 FISH(MA-FISH)는 미세유체 흐름을 사용하여 DNA 하이브리드화 효율성을 높이고 값비싼 FISH 프로브 소비를 줄이고 하이브리드화 시간을 단축합니다.MA-FISH는 유방암 조직에서 [22]HER2 유전자를 검출하기 위해 사용된다.

마르피시

마이크로오토라디오그래피 FISH는 기존의 FISH와 무선표지 기질을 조합하여 계통발생군과 대사활동을 동시에 [23]검출하는 기술이다.

하이브리드 퓨전-FISH

Hybrid Fusion FISH(HF-FISH)는 형광체의 1차 첨가 들뜸/방출 조합을 사용하여 동적 광전송(DOT)으로 알려진 라벨링 프로세스를 통해 추가 스펙트럼을 생성한다.3개의 1차 형광구는 DOT를 사용한 조합 라벨링의 결과로 총 7개의 쉽게 검출 가능한 방출 스펙트럼을 생성할 수 있다.Hybrid Fusion FISH는 임상 종양학 패널 내에서 고도로 다중화된 FISH 애플리케이션을 가능하게 합니다.이 기술은 기존의 형광 현미경으로 쉽게 검출할 수 있는 효율적인 프로브셋으로 더 빠른 점수를 제공합니다.

머피시

다중화된 오류-강성 현장 형광은[24] smFISH의 고도로 다중화된 버전입니다.조합적 라벨링, 이미지 작성, 오류 방지[25] 인코딩을 사용하여 많은 수의 RNA 분자와 세포 내 공간적 위치 파악을 수행합니다.많은 RNA 분자의 포획은 유전자 조절 네트워크의 설명, 비주석 유전자의 기능 예측, 그리고 그들의 관련 단백질과 상관관계가 있는 RNA 분자 분포 패턴의 식별을 가능하게 한다.

불가사리[26]

불가사리는 모든 변형이 동일한 데이터 세트(세포 내 x 및 y 좌표에 매핑된 유전자 발현 값)를 생성하기 때문에 FISH의 9가지 다른 변종 데이터를 분석하기 위해 과학자들의 컨소시엄에 의해 2019년에 개발된 소프트웨어 도구 세트입니다.생물정보학자들뿐만 아니라 모든 과학자들을 위해 개발된 이 소프트웨어는 일련의 이미지를 읽고, 소음을 제거하며, RNA 분자를 식별한다.이 접근방식은 단세포 전사체 분석과 유사한 방식으로 FISH 데이터 세트의 표준 분석 체계를 정의하기 시작했다.

의료 응용 프로그램

발달 장애가 있는 아이들의 부모들은 종종 다른 아이를 가지기로 선택하기 전에 그들의 아이의 상태에 대해 더 알고 싶어 한다.이러한 우려는 부모와 자녀의 DNA를 분석함으로써 해결될 수 있다.아이의 발달장애를 이해하지 못하는 경우에는 FISH 및 세포유전학적 기법을 사용하여 그 원인을 잠재적으로 파악할 수 있다.FISH를 사용하여 진단되는 질환의 예로는 프라더윌리 증후군, 엔젤만 증후군, 22q13 결실 증후군, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, Cri-du-chat, Velocardioface Syndrome, Down 증후군이 있다.정자세포의 FISH는 올리고동물성 남성의 약 50%가 정자염색체 [27]이상 비율을 증가시키기 때문에 비정상적인 체핵형 또는 감수성 핵형을 가진 남성 및 올리고동물성 혈증을 가진 남성에게 나타난다.21번, X번, Y번 염색체의 분석은 위험에 [27]처한 올리고생물의 식별에 충분하다.

의학에서 FISH는 진단을 형성하거나 예후를 평가하거나 암과 같은 질병의 완화를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.그런 다음 특별히 치료를 맞춤화할 수 있습니다.중기의 염색체 분석을 포함한 전통적인 검사는 미묘한 염색체 특성 때문에 한 질병을 다른 질병과 구별하는 특징을 식별하지 못하는 경우가 많다. FISH는 이러한 차이를 설명할 수 있다.또한 FISH는 표준 세포유전학 방법보다 더 쉽게 병든 세포를 검출할 수 있습니다.세포유전학 방법에서는 세포를 분할해야 하며 기술자가 슬라이드를 수작업으로 준비 및 분석해야 합니다.반면, FISH는 살아있는 세포를 필요로 하지 않고 자동으로 계량될 수 있으며, 컴퓨터는 존재하는 형광 점을 세어본다.그러나, 구부러지거나 뒤틀린 메타기 염색체에서 밴딩 패턴의 미묘한 차이를 구별하기 위해 훈련된 기술자가 필요하다.FISH는 Lab-on-a-chip 마이크로 유체 장치에 통합될 수 있습니다.이 기술은 아직 개발 단계에 있지만 다른 칩 연구소와 마찬가지로 더 휴대성이 높은 진단 [28][29]기술로 이어질 수 있습니다.

This figure outlines the process of fluorescent in situ hybridization (FISH) used for pathogen identification. First, a sample of the infected tissue is taken from the patient. Then an oligonucleotide that is complementary to the suspected pathogen's genetic code is synthesized and chemically tagged with a fluorescent probe. The collected tissue sample must then be chemically treated in order to make the cell membranes permeable to the fluorescently tagged oligonucleotide. After the tissue sample is treated, the tagged complementary oligonucleotide is added. The fluorescently tagged oligonucleotide will only bind to the complementary DNA of the suspected pathogen. If the pathogen is present in the tissue sample, then the pathogen's cells will glow/fluoresce after treatment with the tagged oligonucleotide. All other cells will not glow after treatment.
세균 병원체 식별에 사용되는 형광 현장 교배(FISH)의 일반적인 과정입니다.먼저 감염된 조직 샘플을 환자로부터 채취합니다.다음으로 의심되는 병원체의 유전자 코드를 상보하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 형광 탐침으로 화학적으로 태그를 붙인다.조직 샘플은 형광 태그가 부착된 올리고뉴클레오티드에 세포막을 투과시키기 위해 화학적으로 처리된다.그런 다음 형광 태그가 추가되고 의심되는 병원체의 상보적인 DNA에만 결합됩니다.병원체가 조직 샘플에 존재하는 경우, 병원체의 세포는 태그가 부착된 올리고뉴클레오티드로 처리된 후 형광을 발생시킵니다.다른 세포는 빛나지 않습니다.

종의 식별

FISH는 의료 미생물학 [30]분야에서 병원균의 식별을 위한 진단 기술로 광범위하게 연구되어 왔다.유용하고 적용 가능한 기술로 입증되었지만, 여전히 진단 실험실에서 널리 사용되지 않습니다.단시간(2시간 미만)의 진단은 생화학적 분화에 비해 큰 장점이었지만, 이러한 장점은 생화학적 분화 기술에 비해 광범위한 병원균을 식별할 수 있는 MALDI-TOF-MS에 의해 도전받고 있다.진단 목적으로 FISH를 사용하는 것은 즉각적인 종 식별이 필요할 때, 특히 FISH가 예비 신속 [30]진단을 위한 저렴하고 쉬운 기술인 혈액 배양 조사를 위해 그 목적을 찾았다.

FISH는 또한 두 생물 종의 게놈을 비교하고 진화 관계를 추론하는 데 사용될 수 있습니다.비슷한 교배 기술은 동물원 블롯이라고 불린다.세균성 FISH 프로브는 종종 16s rRNA 영역의 프라이머입니다.

FISH는 미생물 생태학 분야에서 미생물을 식별하기 위해 널리 사용되고 있습니다.예를 들어, 바이오 필름은 복잡한 (종종) 다종 박테리아 조직으로 구성됩니다.한 종에 대한 DNA 탐침을 준비하고 이 탐침으로 FISH를 수행하면 생물막 내에서 이 특정 종의 분포를 시각화할 수 있습니다.두 종에 대한 탐침을 준비하면 (두 가지 다른 색상으로) 연구자들은 바이오 필름에서 이 두 종의 공동 위치 파악을 시각화하고 연구할 수 있으며, 바이오 필름의 미세한 구조를 결정하는 데 유용할 수 있다.

비교 유전자 교배

비교 유전체 교배는 [31]핵의 게놈에서 DNA 배열의 복제 과정의 주요 교란을 기억하기 위해 교배 강도의 비교와 병행하여 FISH를 사용하는 방법으로 기술될 수 있다.

가상핵형

가상 키리타이핑은 단일 어레이에서 수천에서 수백만 개의 프로브를 사용하여 전례 없는 분해능으로 복사 번호의 변화를 검출하는 FISH 패널의 또 다른 비용 효율이 높고 임상적으로 이용 가능한 대안입니다.현재, 이러한 유형의 분석은 염색체 물질의 득실만을 검출할 뿐이며, 많은 유형의 백혈병 및 림프종에서 나타나는 특징적인 이상인 전위 및 반전과 같은 균형 잡힌 재배열을 검출하지 못할 것이다.

스펙트럼핵형

스펙트럼 핵형은 색소 염색체의 이미지이다.스펙트럼 핵형성에는 여러 종류의 탐침의 여러 형태를 사용하는 FICH가 포함되며, 그 결과 각 염색체가 메타기 단계를 통해 라벨링되는 것을 볼 수 있다.이러한 유형의 핵형은 특히 염색체 배열을 찾을 때 사용된다.

「 」를 참조해 주세요.

갤러리

  • Another schematic of FISH process.

    FISH 프로세스의 또 다른 개략도입니다.

  • Microfluidic chip that lowered the cost-per-test of FISH by 90%.

    FISH의 테스트당 비용을 90% 절감한 마이크로 유체 칩.

  • Dual label FISH image; Bifidobacteria Cy3, Total bacteria FITC.

    이중 라벨 FISH 이미지, Bifidobacteria Cy3, Total 박테리아 FITC.

  • Paraspeckles visualized by single-molecule FISH against NEAT1 (Quasar 570) in U-2 OS cells (DAPI).

    U-2 OS 셀(DAPI)에서 NEAT1(Quasar 570)에 대해 단일 분자 FISH로 시각화되는 파라페클.

레퍼런스

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