상보적 DNA

Complementary DNA
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분자 생물학에서 상보성의 일반적인 속성은 상보성(분자 생물학)을 참조하십시오.유전학 연구에 사용되는 보완 검정은 보완(유전자)을 참조하십시오.
테스트에 사용되는 cDNA 마이크로 어레이의 출력

유전학에서 상보적 DNA(cDNA)는 단일가닥 RNA(예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 또는 마이크로RNA(miRNA) 템플릿에서 역전사효소에 의해 촉매되는 반응으로 합성되는 DNA이다.CDNA는 종종 원핵생물에서 진핵생물 유전자를 복제하는데 사용된다.과학자들이 보통 그 단백질을 발현하지 않는 세포에서 특정한 단백질을 발현하고 싶을 때, 그들은 단백질을 코드하는 cDNA를 수용 세포로 옮길 것이다.분자생물학에서 cDNA는 또한 마이크로어레이 및 RNA-seq와 같은 분석의 벌크 조직, 단세포 또는 단핵의 전사체 프로파일을 분석하기 위해 생성된다.

cDNA는 또한 레트로바이러스(HIV-1, HIV-2, simian 면역결핍 바이러스 등)에 의해 자연적으로 생성되며, 그 후 숙주의 게놈에 통합되어 [1]프로바이러스를 생성한다.

cDNA라는 용어는 또한 일반적으로 생체정보학 맥락에서 RNA 염기(GCAU)가 아닌 DNA 염기(deoxy-GCAT)로 표현되는 mRNA 전사체의 염기서열을 지칭하기 위해 사용된다.

합성

RNA는 cDNA [2]합성을 위한 템플릿 역할을 한다.세포생활에서 cDNA는 표적 게놈 DNA에 RNA를 통합하기 위해 바이러스 및 역트랜스포존에 의해 생성된다.분자생물학에서 RNA는 게놈 DNA, 단백질 및 기타 세포성분을 제거한 후 원료에서 정제된다.그 후 시험관내 [3]역전사를 통해 cDNA를 합성한다.

RNA 정제

RNA는 숙주세포의 게놈 DNA에서 전사되어 먼저 세포를 용해시킨 후 페놀클로로포름, 실리카 컬럼, 비드 기반 RNA 추출법 [4]등 널리 사용되는 방법을 이용하여 RNA를 정제함으로써 추출된다.추출 방법은 원료에 따라 다릅니다.예를 들어, 식물 조직에서 RNA를 추출하려면 페놀 화합물, 탄수화물 및 RNA를 사용할 [5]수 없게 만드는 다른 화합물을 제거하기 위해 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 추가 시약이 필요합니다.DNA와 단백질을 제거하기 위해 DNase와 Proteinase K와 같은 효소가 [6]분해에 사용된다.중요한 것은 RNases를 구아니듐 이소티오시아네이트, 도데실황산나트륨(SDS), 페놀 또는 클로로포름 등의 카오트로피제로 불활성화함으로써 RNA 무결성을 유지하는 것이다.그런 다음 총 RNA는 다른 세포 성분으로부터 분리되고 알코올과 함께 침전됩니다.특정 애플리케이션을 [7]위한 단순하고 신속한 RNA 추출을 위한 다양한 상용 키트가 있습니다.크기 또는 고유한 RNA [8][9]영역에 따라 RNA의 특정 하위 유형(예: mRNA 및 마이크로RNA)을 분리하기 위해 추가적인 비드 기반 방법을 사용할 수 있습니다.

역문자 변환

제1스트랜드 합성

역전사효소 및 정제 RNA 템플릿을 사용하여 cDNA 1가닥을 생성한다(제1가닥 cDNA 합성).Moloney murine 백혈병 바이러스의 M-MLV 역전사효소는 긴 RNA의 [10]전사에 적합한 감소된 RNase H 활성 때문에 일반적으로 사용된다.조류 골수아세포증 바이러스의 AMV 역전사효소는 강력한 2차 구조(즉, 높은 용해 온도)[11]를 가진 RNA 템플릿에도 사용될 수 있다.cDNA는 일반적으로 RT-qPCR, RNA-seq [12]등의 유전자 발현 분석을 위해 mRNA에서 생성되며, mRNA는 전체 mRNA의 3' 말단에 있는 폴리아데닐화 꼬리의 역보체인 oligo-dT 프라이머를 사용하여 선택적으로 역전사된다.oligo-dT와 랜덤 헥사머 프라이머의 최적화된 혼합은 5' 또는 3' [13]바이어스를 줄이면서 전장 cDNA를 얻을 가능성을 높인다.리보솜 RNA는 또한 mRNA 및 일부 비코드 [14]RNA와 같은 비폴리 아데닐화 전사물을 풍부하게 하기 위해 고갈될 수 있다.

제2스트랜드 합성

첫 번째 스트랜드 합성 결과인 RNA-DNA 하이브리드는 여러 두 번째 스트랜드 합성 방법을 통해 처리되거나 다운스트림 [15][16]어세이에서 직접 처리될 수 있습니다.머리핀 프라이밍 합성이라고 알려진 초기 방법은 첫 번째 가닥 cDNA의 3' 말단에서 머리핀 형성에 의존하여 두 번째 가닥 합성을 주도했다.그러나 프라이밍은 무작위이며 헤어핀 가수분해는 정보 손실을 초래한다.Gubler and Hoffman 절차에서는 E를 사용합니다.대장균 RNAase H에서 Nick mRNA로 E로 대체됩니다.대장균 DNA 중합효소 I 및 E로 밀봉.대장 DNA 연결효소이 절차의 최적화는 두 번째 가닥 cDNA의 DNA 중합효소 번역 후 RNase H를 첨가하여 나중에 나머지 RNA를 제거한 상태에서 닉 mRNA에 대한 M-MLV의 낮은 RNase H 활성에 의존합니다.그러면 mRNA의 5' 끝에서 시퀀스 정보가 손실되는 것을 방지할 수 있습니다.

적용들

상보적 DNA는 종종 유전자 복제, 유전자 탐침 또는 cDNA 라이브러리 생성에 사용된다.과학자들이 새로운 유전 물질을 수용 세포에서 단백질로 표현하기 위해 한 세포에서 다른 세포로 유전자를 옮길 때, cDNA는 전체 유전자에 대한 DNA가 단백질을 코드하지 않거나 p의 코드 시퀀스를 방해하는 DNA를 포함할 수 있기 때문에 (전체 유전자가 아닌) 수용체에 추가될 것입니다.rotein(인트론 등)cDNA의 부분 배열은 종종 표현된 배열 태그로 얻을 수 있습니다.

중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 DNA 배열의 증폭은 일반적으로 초기 단계로 역전사를 수행하고, 이어서 PCR을 통해 세포 내 발현을 위한 cDNA의 정확한 배열을 얻을 수 있다.이는 단백질을 코드하는 cDNA 영역의 5' 및 3' 말단에 교배되는 배열 특이적 DNA 프라이머를 설계함으로써 달성된다.일단 증폭되면, 그 배열은 핵산 분해 효소로 양 끝에 절단될 수 있고 발현 벡터라고 알려진 많은 작은 원형 DNA 배열 중 하나에 삽입될 수 있다.이러한 벡터는 세포 내에서 자가 복제를 가능하게 하며 숙주 DNA에서 잠재적으로 통합될 수 있습니다.또한 일반적으로 표적 cDNA를 mRNA로 전사를 유도하는 강력한 프로모터를 포함하고, mRNA는 단백질로 변환됩니다.

2013년 6월 13일 미국 대법원은 분자병리학협회 대 무리어드 유전학 소송에서 자연발생 [17]인간 유전자는 특허를 받을 수 없지만 자연발생하지 않기 때문에 cDNA는 특허 자격이 있다고 판결했다.

cDNA는 또한 RNA-seq 또는 RT-qPCR과 [18][19][20]같은 방법을 통해 유전자 발현을 연구하는 데 사용된다.시퀀싱의 경우 시퀀스 플랫폼 크기 제한으로 인해 RNA가 조각화되어야 합니다.또한, 2가닥 합성 cDNA는 cDNA 조각이 PCR 증폭되어 순서 흐름 세포에 결합할 수 있는 어댑터와 결합되어야 한다.유전자 특이적 분석 방법에서는 일반적으로 마이크로어레이와 RT-qPCR을 사용하여 형광측정 및 기타 방법을 통해 cDNA 수치를 정량화한다.

바이러스 및 레트로트랜스포존

일부 바이러스는 또한 바이러스 RNA를 mRNA로 바꾸기 위해 cDNA를 사용합니다(cDNA → cDNA →mRNA는 숙주 세포를 차지하기 위해 바이러스 단백질을 만드는 데 사용된다.

바이러스 RNA에서 cDNA로의 이 첫 단계의 예는 HIV 감염 사이클에서 볼 수 있다.여기서 숙주세포막은 바이러스의 지질 외피와 부착되어 바이러스 게놈 RNA의 두 복사를 가진 바이러스 캡시드가 숙주로 들어갈 수 있게 된다.그런 다음 cDNA 복사는 샤페론 CypA와 연관된 바이러스 캡시드에 [21]의해 촉진되는 과정인 바이러스 RNA의 역전사를 통해 만들어진다.

cDNA는 또한 진핵생물 게놈의 역트랜스포존에 의해 생성된다.레트로트랜스포존은 RNA 중간체를 통해 게놈 안에서, 때로는 게놈 사이에서 스스로 움직이는 이동성 유전 요소이다.이 메커니즘은 감염 [22][23]입자의 생성을 제외하고 바이러스와 공유됩니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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