cDNA 라이브러리
cDNA library | 이 글은 검증을 위해 인용구가 추가로 필요하다.– · · 책· · (2008년 5월) (이 |
cDNA 라이브러리는 숙주세포의 집합에 삽입된 복제 cDNA(복제 DNA) 파편들의 조합으로, 유기체의 대본의 일부를 구성하고 "도서관"으로 저장된다. cDNA는 핵에서 발견된 완전히 전사된 mRNA로부터 생성되어 유기체의 표현된 유전자만을 포함한다. 마찬가지로 조직별 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 진핵 세포에서 성숙한 mRNA는 이미 분열되어 있으므로, 생성된 cDNA는 인트론이 부족하고 박테리아 세포에서 쉽게 표현할 수 있다. 유전자 제품이 쉽게 식별되기 때문에 cDNA 라이브러리의 정보는 강력하고 유용한 도구인 반면, 도서관은 유전체 DNA 라이브러리에서 발견되는 엔핸서, 인트론 및 기타 규제 요소에 대한 정보가 부족하다.
cDNA 라이브러리 구축
cDNA는 역성격화효소(reverse transcriptase)를 사용하는 진핵세포에서 성숙한 mRNA로 만들어진다. 진핵생물에서 폴리(A) 꼬리(아데닌 뉴클레오티드의 긴 시퀀스로 구성됨)는 mRNA와 tRNA를 구별하므로 역전사의 프라이머 부위로 사용할 수 있다. 이것은 히스톤과 같은 모든 대본이 다 A 꼬리를 암호화하는 것은 아니라는 문제를 가지고 있다.
mRNA 추출
첫째, mRNA는 나머지 RNA로부터 획득하여 정제한다. RNA를 정화하기 위한 방법으로는 트라이졸 추출, 컬럼 정화 등 여러 가지가 있다. 컬럼 정화는 폴리 A 꼬리가 있는 mRNA만 결합되는 과두 dT 뉴클레오티드 코팅 레진을 사용하여 이루어진다. 나머지 RNA는 용출된다. mRNA는 용출 버퍼와 약간의 열을 사용하여 올리고-dT에서 mRNA 가닥을 분리하여 용출한다.
cDNA건설
mRNA가 정화되면 올리고-dT(데옥시-시미딘 뉴클레오티드의 짧은 시퀀스)는 보완적 프라이머로 태그가 지정되며, 이는 역분해효소에 의해 확장될 수 있는 3'-OH의 자유로운 끝을 제공하여 보완적 DNA 가닥을 생성한다. mRNA는 RNAse 효소를 사용하여 제거되며 단일 가닥 cDNA(sscDNA)를 남긴다. sscDNA는 DNA 중합효소의 도움을 받아 이중 가닥 DNA로 변환된다. 단, DNA 중합효소가 보완 가닥을 합성하기 위해서는 3'-OH의 자유로운 종말이 필요하다. 이것은 3의 끝에서 스스로 코일링하여 헤어핀 루프를 생성함으로써 sscDNA가 스스로 제공한다. 중합효소는 3'-OH 끝을 확장하고, 나중에 3' 끝의 루프는 S1 누클레스의 가위 작용에 의해 개방된다. 제한적 내핵과 DNA 리게아제는 그 결과들을 박테리아 플라스미드로 복제하는데 사용된다.
그리고 나서 복제된 박테리아는 항생제 선택을 통해 선택된다. 일단 선택되면, 박테리아의 재고가 생성되고 나중에 재배되고 cDNA 라이브러리를 컴파일할 수 있다.
cDNA 라이브러리 사용
cDNA 라이브러리는 많은 수의 비코딩 영역을 도서관에서 제거하기 위해 정보의 양이 줄어들기 때문에 진핵 게놈을 재생산할 때 흔히 사용된다. cDNA 라이브러리는 원핵생물에서 진핵 유전자를 표현하기 위해 사용된다. 원핵생물들은 그들의 DNA에 인트론을 가지고 있지 않기 때문에 전사 과정에서 그것을 잘라낼 수 있는 효소를 가지고 있지 않다. cDNA는 인트론을 가지고 있지 않기 때문에 원핵세포로 표현될 수 있다. cDNA 도서관은 추가적인 유전 정보가 덜 사용되는 역유전학에서 가장 유용하다. 또한, cDNA 라이브러리는 기능 복제에 자주 사용되어 인코딩된 단백질의 기능에 기초하여 유전자를 식별한다. 진핵 DNA를 연구할 때, 표현 라이브러리는 삽입물이 진정한 유전자임을 확실히 하기 위해 보완 DNA(cDNA)를 사용하여 구성된다.[1]
cDNA 라이브러리 vs. 게놈 DNA 라이브러리
cDNA 라이브러리에는 유전체 DNA에서 발견되는 비코딩 및 규제 요소가 없다. 유전적 DNA 라이브러리는 유기체에 대한 보다 상세한 정보를 제공하지만, 생성 및 보관에 더 많은 자원을 필요로 한다.
cDNA 복제
cDNA 분자는 제한 사이트 링커를 사용하여 복제할 수 있다. 링커는 길이가 약 8~12개의 뉴클레오티드 쌍의 짧고 이중 좌초된 DNA 조각이며, 여기에는 제한 엔도뉴클레오티드가 포함된다(예: 밤).HI. cDNA와 링커 모두 끝이 뭉툭해서 T4 DNA 리게아제를 고농축으로 함께 묶을 수 있다. 그런 다음 cDNA 분자(현재는 통합된 부지가 있는 링커 포함)를 적절한 내분자(endonuclease)로 쪼개서 끈적끈적한 끝이 cDNA 분자에서 생성된다. 그런 다음 복제 벡터(플라스미드)도 적절한 내분비법으로 분할한다. 벡터에 삽입된 삽입물의 "딱딱딱딱한 끝" 결합 후에 결과 재조합 DNA 분자는 복제를 위해 대장균 호스트 세포로 전달된다.
참고 항목
참조
- ^ P., Clark, David (2009). Biotechnology : applying the genetic revolution. Pazdernik, Nanette Jean. Amsterdam: Academic Press/Elsevier. ISBN 9780121755522. OCLC 226038060.
