코스미드

Cosmid

cosmid는 람다 파지 cos [1]시퀀스를 포함하는 하이브리드 플라스미드의 한 유형입니다.그것들은 종종 유전공학에서 복제 벡터로 사용된다.우주론은 게놈 라이브러리를 만드는 데 사용될 수 있다.그것들은 [2]1978년 콜린스와 혼에 의해 처음 기술되었다.코스미드는 37~52kb의 DNA를 포함할 수 있으며, 이는 일반적인 박테리오파지 포장 크기에 근거한 한계치입니다.그들은 적절한 복제의 기원을 가지고 있다면 플라스미드로 복제할 수 있습니다. 예를 들어 포유동물 세포의 SV40 오리, 이중 가닥 DNA 복제를 위한 ColE1 오리, 원핵 생물의 단일 가닥 DNA 복제를 위한 f1 오리입니다.또한 항생제 내성 등의 선택 유전자를 포함하는 경우가 많아 항생제가 함유된 배지에 도금함으로써 변형된 세포를 식별할 수 있다.cosmid를 차지하지 않은 세포는 [3]성장할 수 없습니다.

플라스미드와 달리, 그것들은 또한 응집력이 있는 끝을 필요로 하는 단계인 파지캡시드로 시험관내 포장될 수 있으며, 또한 클로닝에서 람다 파지를 벡터로 사용하는 것으로도 알려져 있지만, 거의 모든 람다 유전자는 cos 염기서열을 제외하고 삭제되었다.그리고 나서 캡시드의 하이브리드 코스미드 DNA는 전달에 의해 박테리아 세포로 옮겨질 수 있다.cos 부위 사이에 최소 38kb의 DNA가 필요한 시험관내 패키징 요건이 있기 때문에 삽입 DNA가 없는 벡터는 패키징되지 않는다(새로운 삽입 DNA가 많은 직접 반복 또는 회문(반전 반복) DNA를 포함할 경우 플라스미드의 불안정성이 증가한다).이러한 불안정성은 DNA 재조합에 영향을 미치는 특정 돌연변이를 가진 숙주 박테리아를 사용함으로써 대부분 상쇄될 수 있다(N.B. 역반복의 부재는 위에서 인용한 첫 번째 Hohn & Collins 출판물에서 언급되었다. 참조[4]).

CoS 시퀀스

시퀀스 길이는 최대 200쌍이며 패키징에 필수적입니다.그것들은 각 가닥에서 12bp씩 말단에 의해 DNA가 절단되는 cosN 사이트를 포함하고 있다.이로 인해 12bp의 2개의 "접착형" 또는 "스틱형 끝"을 가진 원형 cosmid가 선형화됩니다.(DNA는 파지헤드에 들어가려면 선형이어야 합니다.)cosB 사이트는 가닥을 끊고 분리하는 동안 터미네이스를 유지합니다.셀룰러 DNase에 의한 열화를 방지하기 위해 다음 cosmid의 cosQ 사이트(롤링 서클 복제로 인해 종종 선형 콘크리트가 생성됨)는 이전 cosmid가 패키지화된 후 종단 처리로 유지됩니다.

코스미드 기능 및 용도

코스미드 벡터에서의 DNA 복제 방식.

우주체는 주로 박테리아 오리V, 항생제 선택 표시 및 복제 부위를 가진 플라스미드이지만, 박테리오파지 람다에서 파생된 하나 또는 더 최근에는 두 개의 세포 부위를 가지고 있다.실험의 특정 목적에 따라 광범위한 호스트 범위 우주, 셔틀 우주 또는 '마말리안' 우주(SV40 오리V 및 포유류 선택 마커와 연결됨)를 사용할 수 있습니다.우주체의 하중 용량은 벡터 자체의 크기에 따라 다르지만 보통 40-45kb입니다.복제 절차에는 두 개의 벡터 암이 생성되어 외부 DNA에 결합됩니다.야생형 cosmid DNA에 대한 선택은 단순히 크기 제외를 통해 이루어집니다.그러므로 우주체는 항상 집단을 형성하고 플라크는 형성하지 않는다.또한 클론 밀도는 결합 DNA µg당 약 105~106 CFU로 훨씬 낮다.

재조합 람다 또는 코스미드 라이브러리의 구성 후, 총 DNA는 체외 포장이라고 불리는 기술을 통해 적절한 대장균 숙주로 옮겨진다.필요한 포장 추출물은 대장균 cI857 용원(각각 홍감샘과 댐(헤드 어셈블리) 및 Eam(테일 어셈블리))에서 추출된다.이러한 추출물은 체외에서 재조합 분자를 인식하고 포장하여 성숙한 파지 입자(람다 기반 벡터) 또는 파지 껍질(코스미드)에 포함된 재조합 플라스미드를 생성한다.이러한 차이는 람다 치환 벡터를 선호하는 다양한 감염 빈도에 반영된다.이는 로딩 용량이 약간 낮다는 점을 보완합니다.또한 phage 라이브러리는 cosmid 라이브러리보다 더 쉽게 저장되고 스크리닝됩니다.

표적 DNA: 복제할 게놈 DNA는 제한 조각의 적절한 크기 범위로 잘라져야 합니다.이는 일반적으로 염색체 스크램블을 피하기 위해 크기 분할 또는 탈인산화(종아리-장 포스파타아제 사용), 즉 물리적으로 연결되지 않은 단편의 결속을 방지하기 위해 부분 제한에 의해 수행된다.

cosmid 벡터의 예

일반적으로 사용되는 벡터에는 "SuperCos 1"이 있습니다.

레퍼런스

  1. ^ Hohn B, Murray K (August 1977). "Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8): 3259–63. Bibcode:1977PNAS...74.3259H. doi:10.1073/pnas.74.8.3259. PMC 431522. PMID 333431.
  2. ^ Collins J, Hohn B (September 1978). "Cosmids: a type of plasmid gene-cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda heads". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9): 4242–6. Bibcode:1978PNAS...75.4242C. doi:10.1073/pnas.75.9.4242. PMC 336088. PMID 360212.
  3. ^ "Cosmids". Phillip McClean. Retrieved April 4, 2014.
  4. ^ Collins J (1981). "Instability of palindromic DNA in Escherichia coli". Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45 Pt 1: 409–16. doi:10.1101/SQB.1981.045.01.055. PMID 6271486.

추가 정보