효모인공염색체

Yeast artificial chromosome
이 기사는 효모 DNA에서 유래한 염색체에 관한 것이다.합성 DNA에서 생성된 효모는 합성 DNA를 참조하십시오.

효모 인공염색체(YACs)는 효모의 DNA인 사카로미세스 세레비시아에서 파생된 유전공학 염색체이며, 사카로미세스 세레비시아에 이어 박테리아 플라스미드로 결합된다.100-1000kb의 큰 DNA 조각을 삽입함으로써 삽입된 염기서열을 복제하고 염색체 도보라고 불리는 과정을 사용하여 물리적으로 매핑할 수 있습니다.이는 인간 게놈 프로젝트에 처음 사용된 과정이지만 안정성 문제로 인해 YAC는 박테리아 인공염색체(BAC) 사용을 위해 폐기되었다.Rankin 등 연구진, Strul 등 연구진 및 Hsaio 등의 초기 연구를 시작으로, 본질적으로 취약한 염색체는 필요한 자율 복제 염기서열(ARS)[1]을 발견함으로써 안정화되었다. 이 데이터를 이용한 정제된 YAC는 1983년 Murray 등에 의해 설명되었다.[2]

YAC의 주요 구성요소는 S. cerevisiae의 ARS, 동원체 및 텔로미어입니다.또한 항생제 내성 및 가시 마커와 같은 선택 가능한 마커 유전자를 이용하여 변형 효모세포를 선택한다.이러한 배열이 없다면, 염색체는 세포외 복제 동안 안정적이지 못할 것이고,[3] 벡터가 없는 군집과 구별할 수 없을 것이다.

이 사진은 워싱턴 대학 인간 게놈 YAC 라이브러리 사본 2장입니다.각 스택은 약 12 마이크로미터 플레이트입니다.각 접시에는 96개의 우물이 있고 각각 다른 효모 클론을 가지고 있다.

건설

YAC는 초기 원형 DNA 플라스미드를 사용하여 구축되며, 이는 일반적으로 제한 효소를 사용하여 선형 DNA 분자로 절단됩니다. 그런 다음 DNA 연결효소는 단일 크고 둥근 [2]DNA 조각을 형성하면서 선형화된 DNA에 DNA 배열 또는 관심 유전자를 결합하는 데 사용됩니다.선형 효모 인공 염색체의 기본 생성은 6개의 주요 단계로 나눌 수 있다.

  1. 선택 가능한 마커를 플라스미드 벡터로 결합: 이것은 마커 유전자가 있든 없든 군락을 차등 선택할 수 있게 한다.항생제 내성 유전자는 돌연변이 대장균이 배지 내에 필요한 성분이 존재하는 상태에서 류신을 합성할 수 있는 능력을 구제함으로써 YAC 벡터를 증폭하여 대장균에서 선택할 수 있도록 한다.TRP1과 URA3 유전자는 다른 선택 가능한 마커입니다.외부 DNA에 대한 YAC 벡터 복제 사이트는 SUP4 유전자 내에 있습니다.이 유전자는 붉은 색소의 축적을 일으키는 효모 숙주 세포의 돌연변이를 보상한다.숙주 세포는 보통 빨간색이며, YAC만으로 변형된 세포는 무색 집락을 형성합니다.외래 DNA 조각을 YAC에 복제하면 유전자의 삽입 불활성화를 일으켜 붉은색을 되찾는다.따라서 이물질 DNA 조각이 포함된 군집은 [4]빨간색입니다.
  2. 유사분열 안정성을[5] 위해 필요한 구심성 배열의 결찰
  3. Autonomously Replicating Sequence(ARS; 자율적으로 복제되는 시퀀스)의 결합(Lationation of Autonomous Replicating Sequence)을 통해 유사분열 복제를 수행하는 복제의 원점을 제공합니다이것은 플라스미드가 색소외로 복제할 수 있게 하지만, 플라스미드를 매우 승모적으로 불안정하게 만들고, 중심체 [3][6]배열이 없으면 쉽게 손실된다.
  4. 원형 플라스미드를 DNA의 선형 조각으로 변환하기 위한 인공 텔로미어 배열의 결찰
  5. 증폭되는 DNA 배열 삽입(최대 1000kb)
  6. 형질전환 효모[8] 콜로니

완전 염색체 III

2014년 3월, 뉴욕대학교 랭곤 메디컬 센터의 제프 보케는 그의 팀이 그가 syn이라고 이름 붙인 S. cerevisiae 16 효모 염색체 중 하나인 III를 합성했다고 발표했다.III.[9][10] 원래 염색체의 유전자를 합성 버전으로 대체하고 완성된 합성 염색체를 효모 세포로 통합하는 과정을 포함했다.이것은 원래 염색체의 316,667쌍보다 적은 273,871쌍의 DNA 염기쌍을 설계하고 생성해야 했다.

생명공학에서의 사용

YACs, YIps(효모 통합 플라스미드) 및 YEps(효모 에피솜 플라스미드)와 같은 효모 발현 벡터는 번역 후 수정을 필요로 하는 진핵세포 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다는 점에서 세균성 인공염색체(BACs)보다 유리하다.DNA의 큰 단편을 삽입할 수 있게 됨으로써 YAC를 이용하여 [11]유기체의 게놈 전체를 복제하고 조립할 수 있다.효모세포에 YAC를 삽입함으로써, 그들은 선형 인공 염색체로 번식할 수 있고, 그 과정에서 DNA의 삽입된 영역을 복제할 수 있다.이 작업이 완료되면 두 가지 프로세스를 사용하여 배열된 게놈 또는 관심 영역을 얻을 수 있습니다.

  1. 물리 맵핑
  2. 염색체 워킹[12]

이것은 게놈의 특정 영역의 상세한 매핑을 가능하게 한다는 점에서 중요하다.X염색체와 [13]같은 인간 염색체 전체를 검사하여 수많은 유전적 장애와 [14]특징에 대한 유전자 표지의 위치를 만들어냈다.

1972년 볼리바르와 로드리게스가 UC 샌프란시스코의 Boyer Lab에서 생성한 pBR322 플라스미드의 개략도.그것은 최초이자 가장 널리 사용되는 벡터 중 하나이며, 1983년 Murray와 Szostak에 의해 만들어진 YACs의 기초이다. 플라스미드는 암피실린과 테트라사이클린 내성 유전자와 DNA 단편을 삽입하기 위한 제한 효소 표적 부위를 포함한다.

인간 게놈 프로젝트

YACs는 BACs보다 상당히 덜 안정적이며, "키메라 효과" 즉, 복제된 DNA의 배열이 실제로 단일 게놈 영역이 아닌 여러 영역에 해당하는 인공물을 생성한다.키메라증은 여러 게놈 세그먼트가 단일 YAC로 결합되거나 동일한 숙주 효모 [15]세포에서 변환된 둘 이상의 YAC가 재결합하기 때문일 수 있다.키메라증 발병률은 50%[16]까지 높을 수 있다.다른 아티팩트는 복제된 영역에서 세그먼트를 삭제하고 게놈 세그먼트를 재배치하는 것입니다(예: 반전).이 모든 경우에, YAC 클론으로부터 결정된 배열은 원래의 자연 배열과 다르며, 클론의 정보가 의존할 경우 일관성 없는 결과와 해석 오류를 초래한다.이러한 문제들 때문에, 인간 게놈 프로젝트는 결국 YAC의 사용을 포기하고 박테리아 인공 염색체로 전환했는데, 이러한 인공 염색체의 발생률은 매우 낮습니다.안정성 문제, 특히 키메라 사건의 비교적 빈번한 발생 외에도, YAC는 전체 인간 게놈을 포괄하는 최소 타일 경로를 생성할 때 비효율적인 것으로 입증되었다.클론 라이브러리 생성에는 시간이 걸립니다.또한 적절한 클론을 선택할 때 참조점으로서 시퀀스 태그 부착 사이트(STS)에 의존하는 특성으로 인해 확장해야 할 라이브러리의 추가 생성이 필요한 큰 격차가 있다.BAC를 활용하는 [17]프로젝트를 추진하게 된 것은 이 추가적인 장애물이다.이는 다음 [18]두 가지 요인에 의한 것입니다.

  1. BAC의 생성은 훨씬 고속이며 클론의 다중 라이브러리를 생성할 때는 이것이 필수적입니다.
  2. BAC를 사용하면 STS를 통해 보다 조밀한 커버리지가 가능해져 실리코에서 생성되는 최소 타일링 경로가 보다 완전하고 효율적으로 생성됩니다.

그러나 선충인 C. elegans의 게놈에서 입증되었듯이 두 가지 방법을 모두 활용할 수 있다.게놈의 대부분은 BAC로 채워졌고, 그 틈은 YAC로 [17]채워졌다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Hsiao CL, Carbon J (August 1979). "High-frequency transformation of yeast by plasmids containing the cloned yeast ARG4 gene". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (8): 3829–33. Bibcode:1979PNAS...76.3829H. doi:10.1073/pnas.76.8.3829. PMC 383928. PMID 386351.
  2. ^ a b Murray AW, Szostak JW (1983). "Construction of artificial chromosomes in yeast". Nature. 305 (5931): 189–93. Bibcode:1983Natur.305..189M. doi:10.1038/305189a0. PMID 6350893. S2CID 4337825.
  3. ^ a b Ratzkin B, Carbon J (February 1977). "Functional expression of cloned yeast DNA in Escherichia coli". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2): 487–91. Bibcode:1977PNAS...74..487R. doi:10.1073/pnas.74.2.487. PMC 392314. PMID 322128.
  4. ^ Strachan T. (2011년)인간 분자 유전학 / 톰 스트래찬과 앤드류 리드, 4학번
  5. ^ Clarke L, Carbon J (October 1980). "Isolation of a yeast centromere and construction of functional small circular chromosomes". Nature. 287 (5782): 504–9. Bibcode:1980Natur.287..504C. doi:10.1038/287504a0. PMID 6999364. S2CID 4348814.
  6. ^ Struhl K, Stinchcomb DT, Scherer S, Davis RW (March 1979). "High-frequency transformation of yeast: autonomous replication of hybrid DNA molecules". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3): 1035–9. Bibcode:1979PNAS...76.1035S. doi:10.1073/pnas.76.3.1035. PMC 383183. PMID 375221.
  7. ^ Kiss GB, Amin AA, Pearlman RE (June 1981). "Two separate regions of the extrachromosomal ribosomal deoxyribonucleic acid of Tetrahymena thermophila enable autonomous replication of plasmids in Saccharomyces cerevisiae". Molecular and Cellular Biology. 1 (6): 535–43. doi:10.1128/mcb.1.6.535. PMC 369696. PMID 6765606.
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  17. ^ a b Rowen, L., Mahairas, G. & Hood, L. 인간 게놈 배열 분석과학(1997).
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외부 링크