롤링 서클 복제

Rolling circle replication
원형 복제는 단일 원형 템플리트의 여러 복사본을 생성합니다.

롤링 서클 리플리케이션(RCR)은 플라스미드, 박테리오파지의 게놈, 비로이드원형 RNA 게놈 등 DNA나 RNA의 원형 분자를 여러 개 빠르게 합성할 수 있는 단방향 핵산 복제 과정이다.몇몇 진핵생물 바이러스들은 또한 롤링 서클 메커니즘을 통해 DNA나 RNA를 복제한다.

자연 롤링 서클 리플리케이션의 간략화 버전으로서 등온 DNA 증폭 기술인 롤링 서클 증폭 기술이 개발되었습니다.RCA 메커니즘은 분자생물학과 생물의학 나노테크놀로지, 특히 바이오센싱 분야(신호 [1]증폭 방법)에서 널리 사용됩니다.

원형 DNA 복제

롤링 서클 복제의 그림입니다.

롤링 서클 DNA 복제는 플라스미드 또는 박테리오파지 DNA에 의해 코드된 개시 단백질에 의해 시작되며, 이는 이중 가닥의 원형 DNA 분자의 한 가닥을 DSO라고 불리는 부위에서 절단한다.개시 단백질은 절단된 가닥의 5' 인산염 말단에 결합되어 있으며, 유리 3' 수산기 말단이 방출되어 DNA 중합효소 III에 의한 DNA 합성의 프라이머 역할을 한다.이 미니크 스트랜드를 템플릿으로 사용하여 복제는 원형 DNA 분자 주변에서 진행되며, 절단된 스트랜드를 단일 가닥 DNA로 치환합니다.절단된 가닥의 변위는 플라스미드 복제 개시 단백질의 존재 하에서 PcrA(플라스미드 복사를 줄인 약자)라고 불리는 호스트 부호화 헬리케이스에 의해 이루어진다.

지속적인 DNA 합성은 콩케머라고 불리는 연속적인 머리부터 꼬리까지 연속적으로 원래의 DNA의 여러 개의 단일 가닥 선형 복사본을 생성할 수 있습니다.이러한 선형 복사본은 다음 과정을 통해 이중 가닥 원형 분자로 변환할 수 있습니다.

우선 개시단백질은 DNA에 또 다른 칼집을 만들어 제1(선행) 가닥의 합성을 종료한다.RNA 중합효소 및 DNA 중합효소 III는 그리고 나서 또 다른 이중 가닥 원을 만들기 위해 단일 가닥 기원(SSO) DNA를 복제합니다.DNA 중합효소 I은 프라이머를 제거하여 DNA로 대체하고 DNA 연결효소는 양가닥 원형 DNA의 또 다른 분자를 만들기 위해 끝을 결합합니다.

요약하면 일반적인 DNA 롤링 서클 복제에는 5가지 [2]단계가 있습니다.

  1. 순환 dsDNA가 "nick" 됩니다.
  2. 3' 끝은 "미선택" DNA를 선도 가닥(템플릿)으로 사용하여 길어지고, 5' 끝은 변위됩니다.
  3. 치환된 DNA는 일련의 오카자키 단편을 통해 이중 가닥으로 되어 있습니다.
  4. "nicked" 및 대체된 ssDNA의 복제.
  5. 치환된 DNA가 순환합니다.

바이러스학

바이러스 DNA 복제

일부 DNA 바이러스는 롤링 서클 복제를 통해 숙주 세포에서 게놈 정보를 복제합니다.예를 들어, 인간 헤르페스 바이러스-6(HHV-6)(hibv)은 [3]이 과정에 관여한다고 생각되는 일련의 "조기 유전자"를 발현한다.그 결과 생성되는 긴 응고체는 개별 [4]비리온으로 포장될 때 리보자임에 의해 HHV-6 게놈의 pac-1과 pac-2 영역 사이에서 분할된다.

HPV16 롤링 서클 복제 모델.

인간 파필로마바이러스-16(HPV-16)은 빠른 속도로 자손을 생산하기 위해 롤링 복제를 사용하는 또 다른 바이러스이다.HPV-16은 인간의 상피세포를 감염시키고 이중 가닥 원형 게놈을 가지고 있다.복제 중에 원점에서 E1 헥사머는 단일 가닥 DNA를 감싸 3~5' 방향으로 이동한다.정상적인 양방향 복제에서는 충돌 시 두 복제 단백질이 분리되지만 HPV-16에서는 E1 헥사머가 분리되지 않아 연속적인 롤링 복제로 이어진다.HPV의 이 복제 메커니즘은 바이러스가 숙주 염색체에 통합되고 궁극적으로 자궁경부암으로 [5]진행되는 것에 생리적인 영향을 미칠 수 있다고 믿어진다.

, 제미니바이러스는, 복제 메카니즘으로서 롤링 서클 복제를 이용하기도 한다.그것은 카사바, 면화, 콩류, 옥수수, 토마토 그리고 오크라 같은 많은 주요 농작물을 파괴하는 원인이 되는 바이러스이다.바이러스는 원형의 단일 가닥 DNA를 가지고 있어 숙주 식물 세포에서 복제됩니다.전체 프로세스는 쌍둥이자리 바이러스 복제 개시 단백질인 Rep에 의해 시작됩니다.Rep은 복제 기계의 일부로 작동하도록 호스트 환경을 변경하는 역할도 합니다.또한 Rep은 유박테리아의 다른 대부분의 롤링 복제 개시 단백질과 현저하게 유사하며, 모티브 I, II 및 III는 N 말단이다.롤링 서클 복제 중에 쌍둥이자리바이러스의 ssDNA가 dsDNA로 변환되고 Rep가 원순서 TATATATAC에서 dsDNA에 부착된다.Rep가 다른 복제 단백질과 함께 dsDNA에 결합하면 DNA가 나노머 배열로 절단되어 가닥의 변위를 일으키는 줄기세포를 형성한다.이 변위는 복제 포크가 3'에서 5' 방향으로 진행되도록 하며, 궁극적으로 새로운 ssDNA 가닥과 콘카타아메리카 [6]DNA 가닥을 생성한다.

박테리오파지 T4 DNA 복제 중간체는 원형 및 분지 원형 콘크리트 [7]구조를 포함한다.이러한 구조는 복제의 롤링 서클 메커니즘을 반영할 수 있습니다.

바이러스 RNA 복제

일부 RNA 바이러스와 비로이드도 롤링 서클 RNA 복제를 통해 게놈을 복제한다.비로이드의 경우, 각각 Pospivirodae(비대칭 복제)와 Avsunviroidae(비대칭 복제)에 이은 두 가지 대체 RNA 복제 경로가 있다.

바이러스 RNA의 롤링 서클 복제

Pospiviroidae(PSTVd-like) 패밀리는 호스트 RNA 중합효소에 의해 올리고머 마이너스 스트랜드로 전사된 후 올리고머 플러스 [8]스트랜드로 전사된다.이들 올리고머 플러스 가닥은 숙주 RNase에 의해 분해되고 호스트 RNA 연결효소에 의해 결합되어 모노머 플러스 가닥 원형 RNA를 재구성한다.이를 롤링 서클 복제의 비대칭 경로라고 합니다.Avsunviroidae(ASBVd 유사)과의 비로이드는 롤링 서클 [9]복제의 대칭 경로를 통해 게놈을 복제합니다.이 대칭 경로에서 올리고머 마이너스 가닥은 먼저 절단되어 결합되어 단량체 마이너스 가닥을 형성한 후 올리고머 플러스 가닥으로 전사된다.이러한 올리고머 플러스 가닥은 단량체 플러스 가닥을 변형하기 위해 절단되고 결합됩니다.대칭 복제 경로는 플러스 가닥과 마이너스 가닥이 모두 동일한 방식으로 생성되기 때문에 명명되었습니다.

올리고머 플러스 스트랜드와 마이너스 스트랜드의 분할은 Avsunviroidae에 존재하는 자기분해성 해머헤드 리보자임 구조에 의해 매개되지만 Pospiviroidae에는 [10]그러한 구조가 존재하지 않는다.

롤링 서클 증폭

롤링서클앰프(RCA)의 분자 메커니즘

롤링 서클 복제의 파생 형태는 매우 적은 양의 시작 [1]물질에서 DNA를 증폭하는 데 성공적으로 사용되었습니다.이 증폭기법은 Rolling circle amplification(RCA; 롤링 서클 증폭)이라고 불립니다.중합효소 연쇄반응(PCR)과 같은 기존 DNA 증폭기술과는 달리 RCA는 중합효소가 원형 템플릿에 아닐된 프라이머에 단일 뉴클레오티드를 연속적으로 첨가하는 등온 핵산 증폭기술로, 결과적으로 수십에서 수백 번의 연속 반복을 포함하는 긴 콘크리트머 ssDNA를 생성한다.원형 [11]템플릿을 보완합니다).

RCA 반응을 수행하려면 다음 5가지 중요한 컴포넌트가 필요합니다.

  1. DNA중합효소
  2. 중합효소와 호환되는 적절한 완충제.
  3. 짧은 DNA 또는 RNA 프라이머
  4. 원형 DNA 템플릿
  5. 디옥시뉴클레오티드트리인산(dNTPs)
RCA 제품의 검출 방법

RCA에서 사용되는 중합효소는 DNA 증폭을 위한 Phi29, Bst 및 Vent exo-DNA 중합효소, RNA 증폭을 위한 T7 RNA 중합효소이다.Phi29 DNA 중합효소는 앞에서 언급한 모든 중합효소 중 가장 뛰어난 처리성과 가닥 변위 능력을 가지고 있기 때문에 RCA 반응에 가장 많이 사용되어 왔다.RCA는 중합효소 연쇄반응(PCR)과는 달리 자유용액과 고정화 타깃(고상증폭) 양쪽에서 일정한 온도(상온~65C)로 전도할 수 있다.

DNA RCA 반응에는 일반적으로 다음 세 가지 단계가 포함됩니다.

  1. 템플릿 매개 효소 결찰(예: T4 DNA 연결효소) 또는 특수 DNA 연결효소(예: CircLigase)를 사용하여 템플릿 없는 결찰로 수행할 수 있는 원형 템플릿 결찰.
  2. 프라이머 유도 단일 가닥 DNA 신장.여러 개의 프라이머를 사용하여 동일한 원과 교배할 수 있습니다.그 결과, 복수의 증폭 이벤트가 개시되어 복수의 RCA 제품(「멀티 프레임 RCA」)을 생성할 수 있습니다.
  3. 형광 검출을 통해 가장 일반적으로 이루어지는 증폭 생성물 검출 및 가시화. 불소 결합 dNTP, 불소 결합 상보적 또는 형광 라벨 부착 분자 비콘을 사용합니다.형광법 외에 전기영동은 RCA 제품의 검출에도 널리 사용된다.

RCA는 각 원형 템플릿이 일정 시간 동안 일정한 속도로 성장함에 따라 DNA의 선형 증폭을 생성합니다.PCR처럼 수율을 높이고 지수 증폭을 달성하기 위해 몇 가지 접근법이 조사되었다.그 중 하나는 하이퍼브런치 롤링 서클 앰프(HRCA)로 오리지널 RCA 제품에 어닐하는 프라이머가 추가되고 [12]확장됩니다.이와 같이 원래의 RCA는 증폭할 수 있는 템플릿을 더 많이 만듭니다.다른 하나는 C2CA로, RCA 생성물을 제한 효소로 소화하여 제한 올리고를 사용하여 새로운 원형 템플릿에 결합하고, 이어서 [13]더 많은 양의 원형 템플릿을 가진 새로운 RCA 라운드를 증폭한다.

RCA의 응용 프로그램

면역-RCA의 예시

RCA는 단일 분자 결합 이벤트를 1,000배 이상 증폭시킬 수 있으며, 초저함량 표적을 탐지하는 데 특히 유용합니다.RCA 반응은 자유 솔루션 환경뿐만 아니라 유리, 마이크로 또는 나노 비드, 마이크로웰 플레이트, 마이크로 유체 소자 또는 종이 스트립과 같은 단단한 표면에서도 수행할 수 있습니다.이 기능은 고체상 면역 측정(: ELISA)에서 신호를 증폭하는 매우 강력한 도구로 사용됩니다.이와 같이 RCA는 게놈학, 프로테오믹스, 진단 및 바이오센싱 분야에서 광범위한 응용 분야를 가진 매우 다용도 신호 증폭 도구가 되고 있습니다.

면역-RCA

Immuno-RCA는 고특이성, 고감도 단백질 검출 및 정량화를 위한 등온신호 증폭법이다.이 기술은 두 가지 분야를 결합한다: 뉴클레오티드 증폭을 가능하게 하는 RCA와 세포 내 또는 활성 바이오마커에 특정한 항체를 사용하는 면역측정법.그 결과, 면역-RCA는 특정 증폭 신호(높은 신호 대 잡음비)를 주어 액상 면역측정법[14][15]면역조직화학에서 저농도 단백질 마커를 검출, 정량 및 가시화하는 데 적합하다.

면역-RCA는 ELISA 또는 면역 조직 [17]염색에서 전형적인 면역 흡착제 반응을 따른다.면역-RCA 반응에 사용되는 검출 항체는 중쇄 끝에 ssDNA 올리고뉴클레오티드를 부착하여 수정한다.따라서 검출 항체의 Fab(Fragment, 항원 결합) 부분은 여전히 특정 항원과 결합할 수 있으며 올리고뉴클레오티드는 RCA 반응의 프라이머 역할을 할 수 있습니다.

대표적인 항체 매개 면역-RCA 절차는 다음과 같다.

압타머 기반 면역-rca 그림

(1) 특정 단백질 표적을 인식하는 검출항체.이 항체는 올리고뉴클레오티드 프라이머에도 부착된다.

2. 원형 DNA가 있으면 아닐하고 프라이머는 원형 DNA 상보 배열과 일치한다.

3. 원형 DNA 템플릿의 상보배열은 수백번 복사되어 항체에 부착되어 있다.

4. 형광현미경 또는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광프로브를 사용하여 RCA 출력(용융 ssDNA)을 검출한다.

압타머 기반 면역-RCA

항체 매개 면역 RCA와 더불어 ssDNA RCA 프라이머는 DNA 압타머의 3' 말단에도 결합할 수 있다.프라이머 테일은 롤링 서클 증폭을 통해 증폭될 수 있습니다.형광 [19]리포터 라벨을 통해 제품을 시각화할 수 있습니다.프로세스는 오른쪽 그림에 설명되어 있습니다.

RCA의 기타 응용 프로그램

RCA의 다양한 파생상품은 바이오센싱 분야에서 널리 사용되었습니다.예를 들어, RCA는 [20][21]임상 샘플에서 바이러스 및 박테리아 DNA의 존재를 검출하는 데 성공적으로 사용되어 감염증의 신속한 진단에 매우 유용합니다.또한 핵산(DNA 및 RNA) 마이크로어레이 [1]분석의 온칩 신호 증폭 방법으로도 사용되었습니다.

바이오센싱 어플리케이션에서의 증폭 기능 외에 RCA 기술을 DNA 나노구조 및 DNA 하이드로겔 구축에도 적용할 수 있다.RCA의 제품은 나노종이나 단백질의 주기적인 조립, 금속 나노와이어[22] 합성, 나노섬의 [1]형성을 위한 템플릿으로도 사용될 수 있다.

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레퍼런스

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