자외선-가시광선 분광법

Ultraviolet–visible spectroscopy
벡맨 DU640 UV/Vis 분광 광도계

자외선(UV) 분광법 또는 자외선-가시광선(UV-VIS) 분광법은[1][2][3] 자외선과 전자기 스펙트럼의 완전하고 인접한 가시 영역의 일부에서 흡수 분광법 또는 반사율 분광법을 말합니다.[2] 비교적 저렴하고 쉽게 구현되는 이 방법론은 다양한 응용 및 기본 응용 분야에서 널리 사용됩니다. 유일한 요구 사항은 샘플이 UV-Vis 영역에서 흡수되는 것, 즉 발색단이 되는 것입니다. 흡수 분광법은 형광 분광법과 상보적입니다. 측정 파장 외에 관심 있는 파라미터는 흡광도(A) 또는 투과도(%T) 또는 반사도(%R)이며, 시간에 따른 변화입니다.[4][5]

UV-vis 분광 광도계는 시료에 흡수되는 자외선(UV)과 가시광선의 양을 측정하는 분석 장비입니다. 다양한 샘플에서 화합물을 식별하고 정량화하기 위해 화학, 생화학 및 기타 분야에서 널리 사용되는 기술입니다.[6]

UV-vis 분광 광도계는 샘플에 빛줄기를 통과시키고 각 파장에서 흡수되는 빛의 양을 측정하여 작동합니다. 흡수되는 빛의 양은 시료 내 흡수 화합물의 농도에 비례합니다.

광학적 전이

대부분의 분자와 이온은 자외선이나 가시광선 영역의 에너지를 흡수하는데, 즉 발색단입니다. 흡수된 광자는 발색단의 전자를 더 높은 에너지 분자 궤도로 여기시켜 들뜬 상태를 만듭니다.[7] 유기 발색단의 경우 π–π*, n–π*, σ–σ*, n–σ*의 네 가지 유형의 전이가 가정됩니다. 전이 금속 복합체는 불완전하게 채워진 궤도와 관련된 복수의 전자 상태의 존재로 인해 종종 착색(즉, 가시광선을 흡수)됩니다.[5]

적용들

UV/Vis 판독값 예시

UV/Vis를 사용하여 DNA의 구조적 변화를 모니터링할 수 있습니다.[8]

UV/Vis 분광법은 전이금속 이온, 고도로 결합된 유기 화합물, 생물학적 거대분자와 같은 다양한 분석물 또는 시료의 정량적 측정을 위해 분석 화학에서 일반적으로 사용됩니다. 분광 분석은 일반적으로 용액에서 수행되지만 고체 및 가스도 연구할 수 있습니다.

  • 유기 화합물, 특히 접합 정도가 높은 화합물은 자외선 또는 전자기 스펙트럼의 가시 영역의 빛도 흡수합니다. 이러한 측정을 위한 용매는 종종 수용성 화합물을 위한 물, 또는 유기 수용성 화합물을 위한 에탄올이다(유기 용매는 상당한 UV 흡수를 가질 수 있다; 모든 용매가 UV 분광법에 사용하기에 적합한 것은 아니다). 에탄올은 대부분의 파장에서 매우 약하게 흡수합니다.) 용매 극성과 pH는 유기 화합물의 흡수 스펙트럼에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 티로신은 pH가 6에서 13으로 증가하거나 용매 극성이 감소할 때 흡수 최대치와 몰 흡광 계수가 증가합니다.
  • 전하 이동 복합체가 색을 띠기도 하지만 색이 너무 강렬하여 정량적 측정에 사용할 수 없는 경우가 많습니다.

Beer-Lambert 법칙에 따르면 용액의 흡광도는 용액 내 흡수종의 농도와 경로 길이에 정비례합니다.[9] 따라서 고정 경로 길이의 경우 UV/Vis 분광법을 사용하여 용액 내 흡수체의 농도를 측정할 수 있습니다. 흡광도가 농도에 따라 얼마나 빨리 변하는지 알아야 합니다. 이 값은 기준(몰 흡광 계수 표)에서 가져온 것이거나, 더 정확하게는 보정 곡선에서 결정된 것일 수 있습니다.

HPLC의 검출기로 UV/Vis 분광 광도계를 사용할 수 있습니다. 분석 물질의 존재는 농도에 비례하는 것으로 가정된 반응을 제공합니다. 정확한 결과를 얻기 위해서는 미지의 분석물에 대한 기기의 반응을 표준에 대한 반응과 비교해야 합니다. 이는 교정 곡선을 사용하는 것과 매우 유사합니다. 특정 농도에 대한 반응(예: 피크 높이)을 반응 계수라고 합니다.

흡수 피크의 파장은 주어진 분자의 결합 유형과 상관관계가 있을 수 있으며 분자 내의 작용기를 결정하는 데 유용합니다. 예를 들어, 우드워드-피에르 규칙은 디엔이나 케톤과 같은 공액 유기 화합물에 대해 가장 강한 UV/Vis 흡수 파장인 λ을 예측하기 위해 사용되는 일련의 경험적 관찰입니다. 그러나 스펙트럼만으로는 주어진 샘플에 대한 특정 테스트를 수행할 수 없습니다. 용매의 성질, 용액의 pH, 온도, 높은 전해질 농도, 간섭 물질의 존재 여부 등이 흡수 스펙트럼에 영향을 미칠 수 있습니다. 분광 광도계의 슬릿 폭(유효 대역폭)과 같은 실험적 변화도 스펙트럼을 변경합니다. UV/Vis 분광법을 분석에 적용하려면 존재하는 물질을 식별하기 위해 이러한 변수를 제어하거나 설명해야 합니다.[10]

이 방법은 Beer-Lambert 법칙을 사용하여 용액에서 흡수하는 종의 농도를 정량적으로 측정하는 방법으로 가장 많이 사용됩니다.[11]

= ⁡(I 0 / = ε Cl {\displaystyl A =\log _{10}(I_{0}I) =\varepsilon cL},

여기서 A는 측정된 흡광도(형식적으로는 차원이 없지만 일반적으로 흡광도 단위(AU)에 보고됨)[12]이며, 0{\는 주어진 파장에서의 입사광 강도이고, I는 투과 강도이며, L은 샘플을 통과하는 경로 길이이며, 그리고 c 흡수종의 농도. 각 종 및 파장에 대해 ε은 몰 흡수율 또는 흡광 계수로 알려진 상수입니다. 이 상수는 특정 온도와 압력에서 용매의 기본 분자 특성이며 1/∗ 1/M*cm} 단위를 갖습니다.

흡광도와 소멸 ε은 때때로 밑-10 로그 대신 자연 로그로 정의됩니다.

맥주-람베르트 법칙은 많은 화합물을 특성화하는 데 유용하지만 모든 물질의 농축과 흡수에 대한 보편적인 관계로 적용되지는 않습니다. 흡수와 농도 사이의 2차 다항식 관계는 유기 염료와 같은 매우 크고 복잡한 분자(예를 들어, 자일레놀 오렌지 또는 뉴트럴 레드)에 대해 때때로 마주칩니다[13].[14][15]

UV-Vis 분광법은 반도체 산업에서도 웨이퍼 상의 박막의 두께와 광학적 특성을 측정하는 데 사용됩니다. UV-Vis 분광계는 빛의 반사율을 측정하는 데 사용되며, Forouhi-Bloomer 분산 방정식을 통해 분석하여 측정된 스펙트럼 범위에 걸쳐 주어진 필름의 굴절률( n과 흡광 계수( k를 결정할 수 있습니다.[16]

실용적 고려사항

맥주-램버트 법칙은 적용되기 위해 실험적으로 충족되어야 하는 암묵적인 가정을 가지고 있습니다. 그렇지 않으면 법칙에서 벗어날 가능성이 있습니다.[14] 예를 들어, 시료의 화학적 구성 및 물리적 환경에 따라 시료의 흡광 계수가 변경될 수 있습니다. 따라서 테스트 샘플의 화학적 및 물리적 조건이 기준 측정값과 일치해야 결과가 유효합니다. 전 세계적으로 미국(USP) 및 유럽(Ph. Eur.) 약전은 분광[17] 광도계가 미광 및 파장 정확도와 같은 요소를 포괄하는 엄격한 규제 요구 사항에 따라 수행될 것을 요구합니다.[18]

스펙트럼 대역폭

분광 광도계의 스펙트럼 대역폭은 계측기가 주어진 시간에 샘플을 통해 전송하는 파장 범위입니다.[19] 광원, 단색기, 물리적 슬릿 폭 및 광학 분산, 분광 광도계의 검출기에 의해 결정됩니다. 스펙트럼 대역폭은 측정의 해상도와 정확도에 영향을 미칩니다. 스펙트럼 대역폭이 좁을수록 더 높은 해상도와 정확도를 제공하지만 전체 스펙트럼을 스캔하는 데 더 많은 시간과 에너지가 필요합니다. 스펙트럼 대역폭이 넓으면 더 빠르고 쉽게 스캔할 수 있지만 특히 흡수 피크가 겹치는 샘플의 경우 분해능과 정확도가 낮아질 수 있습니다. 따라서 신뢰할 수 있고 정확한 결과를 얻기 위해서는 적절한 스펙트럼 대역폭을 선택하는 것이 중요합니다.

응답의 선형성을 향상시키기 위해 샘플 셀에 입사하는 빛에 대해 단색의 방사선 소스를 갖는 것이 중요합니다.[14] 대역폭이 단색(파장의 전송 단위)에 가까울수록 응답이 선형적으로 됩니다. 스펙트럼 대역폭은 단색기에서 나오는 빛의 최대 세기의 절반으로 전송되는 파장의 수로 측정됩니다.

UV 분광 광도계의 사양은 가능한 최고의 스펙트럼 대역폭이며, 입사광이 얼마나 단색일 수 있는지를 특징으로 합니다. 이 대역폭이 샘플 성분의 흡수 피크 폭과 비슷하거나 그 이상이면 측정된 흡광 계수는 정확하지 않습니다. 기준 측정에서 기기 대역폭(입사광의 대역폭)은 스펙트럼 피크의 폭 이하로 유지됩니다. 시험 물질을 측정할 때는 입사광의 대역폭도 충분히 좁아야 합니다. 스펙트럼 대역폭을 줄이면 디텍터로 전달되는 에너지가 줄어들기 때문에 동일한 신호 대 잡음비를 달성하는 데 더 긴 측정 시간이 필요합니다.

파장 오차

용액 내 분석 물질의 흡광 계수는 파장에 따라 점진적으로 변합니다. 파장에 따른 흡광도 변화율이 가장 낮은 흡광도 곡선 대 파장, 즉 UV-VIS 스펙트럼에서의 피크(흡광도가 최대에 이르는 파장).[14] 따라서 보통 흡광도 피크 주변의 파장을 사용하여 용질의 정량적 측정을 수행하여 파장에 따른 흡광계수의 변화로 인한 파장의 오차를 최소화합니다.

스트레이 라이트

참고 항목: 스트레이 라이트

UV 분광 광도계의 미광은[20] 단색기에서 선택한 파장이 아닌 검출기에 도달하는 모든 빛입니다. 이는 예를 들어 기기 내에서 빛이 산란되거나 광학 표면에서 반사되어 발생할 수 있습니다.

미광은 실제로 선택된 파장의 일부가 아님에도 검출기에서 감지한 신호에 미광이 추가되기 때문에 특히 높은 흡광도에서 흡광도 측정에 상당한 오류를 일으킬 수 있습니다. 측정 및 보고된 흡광도가 샘플의 실제 흡광도보다 낮을 것이라는 결과입니다.

미광은 분석에 사용되는 빛의 순도를 결정하기 때문에 중요한 요소입니다. 영향을 미치는 가장 중요한 요소는 단색기의 미광 수준입니다.[14]

일반적으로 UV-VIS 분광 광도계에 사용되는 검출기는 광대역이며 도달하는 모든 빛에 반응합니다. 샘플을 통과한 상당한 양의 빛이 공칭 파장보다 훨씬 낮은 흡광 계수를 가진 파장을 포함하는 경우 계측기에서 흡광도가 잘못 보고됩니다. 검출기가 단순히 미광에 반응하기 때문에 모든 기기는 샘플 농도의 증가가 보고된 흡광도의 증가로 이어지지 않는 지점에 도달합니다. 실제로는 기기에 유효한 범위 내에 미지의 흡광도를 배치하기 위해 샘플의 농도 또는 광 경로 길이를 조정해야 합니다. 때로는 알려진 샘플 농도를 사용하여 계측기가 비선형화되는 영역으로 측정할 수 있는 경험적 보정 기능이 개발됩니다.

개략적으로 설명하자면, 단일 단색기가 있는 계측기의 경우 일반적으로 약 3 AU(흡광도 단위)에 해당하는 미광도 레벨이 있으므로 약 2 AU 이상의 측정은 문제가 됩니다. 이중 단색기가 있는 더 복잡한 기기는 약 6AU에 해당하는 미광 레벨을 가질 수 있으므로 훨씬 더 넓은 흡광도 범위를 측정할 수 있습니다.

맥주-람베르트 법칙의 일탈

충분히 높은 농도에서 흡수 밴드는 포화되어 흡수 평탄화를 보여줍니다. 이미 100%에 가까운 빛이 흡수되고 있기 때문에 흡수 피크가 평평해지는 것처럼 보입니다. 이러한 현상이 발생하는 농도는 측정되는 특정 화합물에 따라 달라집니다. 이 효과를 검정하는 데 사용할 수 있는 한 가지 테스트는 측정의 경로 길이를 변경하는 것입니다. Beer-Lambert 법칙에서 농도와 경로 길이의 변화는 동등한 효과를 갖는데, 용액을 10배로 희석하는 것은 경로 길이를 10배로 단축하는 것과 같은 효과를 갖습니다. 경로 길이가 다른 셀을 사용할 수 있는 경우 이 관계가 사실인지 테스트하는 것이 흡수 평탄화가 발생하는지 여부를 판단하는 한 가지 방법입니다.

균질하지 않은 용액은 흡수평탄화 현상으로 인해 Beer-Lambert 법칙의 편차를 보일 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 흡수 물질이 부유 입자 내에 위치하는 경우에 발생할 수 있습니다.[21][22] 낮은 농도와 높은 흡광도의 조건에서 편차가 가장 두드러집니다. 마지막 참조는 이 편차를 수정하는 방법을 설명합니다.

구리와 같은 해결책도 있습니다.II) 물속의 염화물은 유색 이온(2가 구리 이온) 주변의 변화된 조건으로 인해 특정 농도에서 시각적으로 변화합니다. 구리용(II) 염화물은 파란색에서 녹색으로 전환되는 [23]것을 의미하며, 이는 단색 측정이 맥주-람베르트 법칙에서 벗어난다는 것을 의미합니다.

측정불확도원

상기 인자들은 UV/Vis 분광 광도법으로 얻은 결과의 측정 불확실성에 기여합니다. 정량적 화학 분석에서 UV/Vis 분광 광도법을 사용하는 경우 결과는 측정되는 화합물 및/또는 용액의 특성에서 발생하는 불확실성 소스에 의해 추가적으로 영향을 받습니다. 여기에는 흡수 밴드 오버랩으로 인한 스펙트럼 간섭, 흡수 종의 색상의 퇴색(분해 또는 반응으로 인해 발생), 시료와 보정 용액 사이의 조성 불일치 가능성 등이 포함됩니다.[24]

자외선 가시광도계

참고 항목: 분광광도법

자외선-가시광선 분광법에 사용되는 장비를 UV/Vis 분광 광도계라고 합니다. 샘플을 통과한 후의 빛의 세기를 측정하고( I 샘플을 통과하기 전의 빛의 세기와 비교합니다( / 의 비율을 투과율이라고 하며, 일반적으로 백분율(%T)로 표시됩니다. 흡광도, {\A는 투과율을 기준으로 합니다.

UV-visible 분광 광도계는 반사율을 측정하도록 구성할 수도 있습니다. 이 경우 분광 광도계는 시료에서 반사되는 빛의 세기를 측정하고( I 기준 물질( 에서 반사되는 빛의 세기(예: 흰색 타일)와 비교합니다. / 비율을 반사율이라고 하며, 일반적으로 백분율(%R)로 표시됩니다.

분광 광도계의 기본 부품은 광원, 샘플용 홀더, 서로 다른 파장의 빛을 분리하기 위한 단색기로서의 회절격자 또는 프리즘, 그리고 검출기입니다. 방사선 소스는 종종 텅스텐 필라멘트(300~2500nm), 자외선 영역(190~400nm)에 걸쳐 연속되는 중수소 아크 램프, 160~2,000nm에서 연속되는 크세논 아크 램프, 또는 보다 최근에는 가시 파장에 대한 발광 다이오드(LED)[4]입니다. 검출기는 일반적으로 광전자 증배관, 포토다이오드, 포토다이오드 배열 또는 전하 결합 장치(CCD)입니다. 단일 포토다이오드 검출기와 광전자 증배관은 스캔 단색기와 함께 사용되며, 이 단색기는 한 번에 단일 파장의 빛만 검출기에 도달하도록 빛을 필터링합니다. 스캐닝 단색기는 회절격자를 "스텝 스루"로 이동시켜 각 파장의 세기를 파장의 함수로 측정할 수 있도록 합니다. 고정 단색기는 CCD 및 포토다이오드 어레이와 함께 사용됩니다. 이 두 장치 모두 하나 또는 두 차원 배열로 그룹화된 많은 검출기로 구성되어 있기 때문에 서로 다른 픽셀 또는 픽셀 그룹에서 서로 다른 파장의 빛을 동시에 수집할 수 있습니다.

UV-가시광선 분광광도계의 개략도

분광 광도계는 단일 빔 또는 이중 빔일 수 있습니다. 단일 빔 계측기(예: Spectronic 20)에서는 모든 빛이 샘플 셀을 통과합니다. 는 시료를 제거하여 측정해야 합니다. 이것은 가장 초기의 디자인이며 여전히 교육 및 산업 실험실에서 일반적으로 사용됩니다.

더블 빔 기기에서 빛은 샘플에 도달하기 전에 두 개의 빔으로 분할됩니다. 하나의 빔이 기준으로 사용되고 다른 빔은 샘플을 통과합니다. 기준 빔 강도는 100% 투과(또는 0 흡광도)로 측정되며 표시되는 측정값은 두 빔 강도의 비율입니다. 일부 이중 빔 계측기에는 두 개의 디텍터(포토다이오드)가 있으며 샘플과 기준 빔이 동시에 측정됩니다. 다른 기기에서는 두 개의 빔이 한 번에 하나의 빔을 차단하는 빔 초퍼를 통과합니다. 디텍터는 초퍼와 동기하여 샘플 빔과 기준 빔을 번갈아 측정합니다. 또한 초퍼 주기에는 하나 이상의 어두운 간격이 있을 수 있습니다. 이 때, 측정된 빔 강도는 비율을 취하기 전에 어두운 간격에서 측정된 강도를 빼서 보정할 수 있습니다.

단일 빔 기구에서는 먼저 용매만 포함된 큐벳을 측정해야 합니다. Mettler Toledo는 UV/VIS 범위에서 빠르고 정확한 측정이 가능한 단일 빔 어레이 분광 광도계를 개발했습니다. 광원은 자외선(UV)을 위한 제논 플래시 램프와 가시광선(VIS) 및 근적외선 파장 영역을 위한 190~1100nm의 스펙트럼 범위로 구성됩니다. 램프 섬광은 유리 섬유에 초점을 맞추어 샘플 용액이 들어 있는 큐벳으로 광선을 구동합니다. 빔은 샘플을 통과하고 특정 파장은 샘플 구성 요소에 의해 흡수됩니다. 큐벳 후 남은 빛은 유리 섬유에 의해 수집되어 분광기로 구동됩니다. 분광기는 빛을 다른 파장으로 분리하는 회절격자와 데이터를 기록하는 CCD 센서로 구성됩니다. 따라서 전체 스펙트럼이 동시에 측정되어 빠른 기록이 가능합니다.[25]

UV/Vis 분광 광도법의 샘플은 대부분 액체이지만 가스의 흡광도와 고체의 흡광도도 측정할 수 있습니다. 샘플은 일반적으로 큐벳이라고 하는 투명한 셀에 넣어집니다. 큐벳은 일반적으로 직사각형 모양이며, 일반적으로 내부 너비는 1cm입니다. (이 너비는 맥주-람베르트 법칙에서경로 길이 L이 됩니다.) 테스트 튜브는 일부 기기에서 큐벳으로 사용할 수도 있습니다. 사용되는 샘플 용기의 유형은 방사선이 관심 스펙트럼 영역을 통과하도록 허용해야 합니다. 가장 널리 적용 가능한 큐벳은 UV, 가시광선 및 근적외선 영역 전체에 걸쳐 투명하기 때문에 고품질의 융합 실리카 또는 석영 유리로 만들어졌습니다. 유리와 플라스틱 큐벳도 흔하지만 유리와 대부분의 플라스틱은 UV를 흡수하여 가시 파장에 그 유용성이 제한됩니다.[4]

전문 악기도 제작되었습니다. 여기에는 망원경에 분광 광도계를 부착하여 천문학적 특징의 스펙트럼을 측정하는 것이 포함됩니다. UV-visible 마이크로 분광 광도계는 UV-visible 분광 광도계와 통합된 UV-visible 현미경으로 구성됩니다.

관심 있는 모든 파장에서의 완전한 흡수 스펙트럼은 종종 더 정교한 분광 광도계에 의해 직접 생성될 수 있습니다. 더 단순한 기기에서는 흡수가 한 번에 하나의 파장을 결정한 다음 작업자에 의해 스펙트럼으로 컴파일됩니다. 농도 의존성을 제거하여 흡광계수(ε)를 파장의 함수로 결정할 수 있습니다.

미세분광광도법

현미경 샘플의 UV-visible spectroscopy는 광학 현미경과 UV-visible 광학, 백색 광원, 단색기 및 전하 결합 장치(CCD) 또는 광전자 증배관(PMT)과 같은 민감한 검출기를 통합하여 수행됩니다. 단일 광 경로만 사용할 수 있으므로 단일 빔 계측기입니다. 현대 기기는 반사율과 마이크론 규모 샘플링 영역의 투과율 모두에서 UV-가시 스펙트럼을 측정할 수 있습니다. 이러한 기구를 사용하면 미세한 시료를 측정할 수 있지만 공간 분해능이 높은 더 큰 시료의 스펙트럼도 측정할 수 있다는 장점이 있습니다. 따라서 법의학 실험실에서 개별 섬유, 미세 [26]페인트 칩 및 유리[27] 파편의 색상에 있는 염료와 색소를 분석하는 데 사용됩니다. 또한 재료 과학 및 생물학 연구 및 유리질 반사율을 측정하여 석탄 및 석유 원천 암석의 에너지 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 마이크로 분광 광도계는 반도체 및 마이크로 광학 산업에서 박막이 증착된 후 두께를 모니터링하는 데 사용됩니다. 반도체 산업에서는 회로의 임계 치수가 미세하기 때문에 사용됩니다. 반도체 웨이퍼의 일반적인 테스트는 패턴화된 웨이퍼 또는 패턴화되지 않은 웨이퍼의 많은 지점에서 스펙트럼을 획득하는 것을 수반합니다. 증착된 필름의 두께는 스펙트럼의 간섭 패턴으로부터 계산될 수 있습니다. 또한, 자외선-가시광선 분광광도법을 이용하여 박막의 굴절률 및 흡광계수와 함께 두께를 측정할 수 있습니다.[16] 그런 다음 전체 웨이퍼에 걸친 막 두께 맵을 생성하여 품질 관리 목적으로 사용할 수 있습니다.[28]

추가 응용프로그램

UV/Vis를 적용하여 화학 반응 속도를 특성화할 수 있습니다. 예시적인 것은 수은 디티존산의 노란색-주황색 이성질체와 파란색 이성질체의 전환입니다. 이 분석 방법은 농도가 농도에 선형적으로 비례한다는 사실에 의존합니다. 동일한 접근 방식으로 발색단 간의 평형을 결정할 수 있습니다.[29][30]

연소 가스의 스펙트럼에서 연료의 화학적 조성, 가스의 온도, 공연비를 결정할 수 있습니다.[31]

참고 항목

참고문헌

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