분광 광도 측정

Spectrophotometry
테이블 상판 분광 광도계
베크만 IR-1 분광광도계, 1941년 경
Beckman Model DB Spectrophotometer(이중 빔 모델
그래픽[1] 산업에서 사용되는 휴대용 분광 광도계

분광광도법은 파장의 [2]함수로서 물질의 반사 또는 투과 성질을 정량적으로 측정하는 것과 관련된 전자파 분광학의 한 분야이다.분광광도측정법은 분광광도계로 알려진 광도계를 사용하여 다른 파장에서 광선의 강도를 측정할 수 있다.분광 광도계는 자외선, 가시적외선 방사선에 가장 일반적으로 적용되지만, 최신 분광 광도계는 X선, 자외선, 가시, 적외선 및/또는 마이크로파장을 포함한 광범위한 전자기 스펙트럼을 조사할 수 있다.

개요

분광광도법은 착색된 화합물에 흡수되는 빛의 양에 따라 분자의 정량적 분석에 좌우되는 도구다.분광 광도계의 중요한 특징은 스펙트럼 대역폭(테스트 샘플을 통해 전송할 수 있는 색 범위), 샘플 전송 비율, 샘플 흡수의 로그 범위 및 때로는 반사율 측정 비율이다.

분광광도계는 일반적으로 용액, 투명 또는 불투명한 고체(예: 광택 유리) 또는 가스의 투과율 또는 반사율 측정에 사용됩니다.많은 생화학물질이 착색되어 있어 가시광선을 흡수하기 때문에 측색법으로 측정할 수 있지만, 무색 생화학물질이라도 발색반응에 적합한 착색화합물로 변환되어 측색분석에 [3]: 65 적합한 화합물을 얻을 수 있는 경우가 많다.단, 일반적으로 약 200~2500nm에 이르는 모든 광범위에서 다른 제어와 [2]교정을 사용하여 확산도를 측정하도록 설계할 수도 있습니다.이러한 빛의 범위 내에서 광도 [4]측정파장에 따라 유형이 다른 표준을 사용하여 기계에 보정이 필요합니다.

용액의 평형 상수 결정에 분광 광도법을 사용한 실험의 예.용액 내의 특정 화학반응은 반응물이 생성물을 형성하고 생성물이 반응물로 분해되는 전방 및 역방향으로 발생할 수 있습니다.어느 시점에서, 이 화학 반응은 평형점이라고 불리는 균형점에 도달할 것이다.이 시점에서 반응물 및 제품의 농도를 측정하기 위해 분광광도법을 사용하여 용액의 광투과율을 시험할 수 있다.용액을 통과하는 빛의 양은 빛이 통과할 수 없도록 하는 특정 화학 물질의 농도를 나타냅니다.

빛의 흡수는 빛의 상호작용과 분자의 전자 및 진동 모드 때문이다.분자의 각 유형은 화학 결합과 핵의 구성과 관련된 에너지 수준의 개별 세트를 가지고 있으며, 따라서 특정 파장의 빛 또는 에너지를 흡수하여 독특한 스펙트럼 [5]특성을 갖게 됩니다.이것은 그것의 독특하고 뚜렷한 구성에 바탕을 두고 있다.

분광 광도계의 사용은 물리학, 재료 과학, 화학, 생화학, 화학 공학, 분자 [6]생물학 등 다양한 과학 분야에 걸쳐 있습니다.반도체, 레이저 및 광학 제조, 인쇄 및 법의학 검사, 화학 물질 연구를 위한 실험실 등 많은 산업에서 널리 사용되고 있습니다.분광광도법은 효소 활성 측정, 단백질 농도 측정, 효소 운동 상수의 측정, 배위자 결합 [3]: 65 반응의 측정에 종종 사용된다.최종적으로 분광광도계는 제어 또는 교정에 따라 관찰된 파장의 계산을 통해 목표물에 어떤 물질이 존재하는지, 그리고 정확히 얼마만큼 존재하는지 판단할 수 있다.

천문학에서 분광광도법(spectrophotometry)이란 스펙트럼의 플럭스 스케일을 파장의 함수로 보정하고 보통 분광광도 표준별의 관측과 비교하여 지구 [7]대기에 의한 빛의 흡수를 보정하는 천체 스펙트럼측정을 말한다.

역사

아놀드 오에 의해 발명되었다. 1940년[disputed ] Beckman은 1935년 설립된 Beckman Instrument Company, 궁극적으로는 Beckman Coolter라는 회사 National Technical Laboratory의 동료들의 도움으로 분광 광도계를 만들었습니다.이것은 자외선을 제대로 흡수할 수 없었던 이전에 만들어진 분광 광도계에 대한 해결책으로 나올 것이다.그는 자외선을 흡수하기 위해 유리 프리즘이 사용된 모델 A의 발명으로 시작할 것이다.이는 만족스러운 결과를 가져오지 못했기 때문에 모델 B에서는 유리 프리즘에서 석영 프리즘으로 전환하여 흡광도를 높였습니다.거기서부터, C모델은 파장 분해능을 조정해 탄생해, 3개의 유닛을 생산했습니다.마지막이자 가장 인기 있는 모델은 D모델로, 지금은 계기 케이스가 들어 있는 DU 분광 광도계, 자외선 연속체가 있는 수소 램프, 더 나은 단색기로 [8]더 잘 알려져 있다.1941년부터 1976년까지 생산되었으며, 1941년에는 가격이 미화 723달러(원거리 UV 액세서리는 추가 비용 부담)였다.노벨 화학상 수상자인 브루스 메리필드의 말에 따르면, 그것은 "아마도 [9]생명과학의 발전을 위해 개발된 가장 중요한 도구였을 것이다."

1976년에 [10]단종된 , Hewlett-Packard는 1979년에 HP 8450A로 [11]알려진 최초의 상업용 다이오드 어레이 분광 광도계를 개발했습니다.다이오드 배열 분광광도계는 베크먼이 개발한 최초의 단일 빔 마이크로프로세서 제어 분광광도계라는 점에서 다른 점이 있었다.성질에 따라 시료가 흡수하는 다색광을 시료에 조사한다.그런 다음 스펙트럼의 [12]파장 영역을 검출하는 포토다이오드 어레이를 그레이팅하여 반송합니다.그 이후로 분광광도 측정 장치의 제작과 구현은 엄청나게 증가했고 우리 시대의 가장 혁신적인 도구 중 하나가 되었다.

설계.

싱글빔 주사 분광 광도계

디바이스에는 크게 싱글빔과 더블빔의 2가지 클래스가 있습니다.이중빔 분광광도계는[13] 2개의 광로(한쪽은 기준샘플을 포함하고 다른 한쪽은 테스트샘플을 포함한다) 간의 광강도를 비교한다.단일빔 분광광도계는 시험샘플 삽입 전후의 빔의 상대광도를 측정한다.더블빔 계측기의 비교 측정이 더 쉽고 안정적이지만 싱글빔 계측기는 동적 범위가 더 크고 광학적으로 더 단순하고 콤팩트합니다.또한 현미경이나 망원경에 내장된 분광광도계와 같은 일부 특수 장비는 실용성 때문에 단일 빔 기구이다.

지금까지 분광광도계는 회절격자를 포함한 단색기를 사용하여 분석 스펙트럼을 생성했습니다.격자는 이동하거나 고정할 수 있습니다.광전자 증배관 또는 광다이오드와 같은 단일 검출기를 사용하는 경우 검출기가 각 파장에서(각 "단계"에 해당하는) 빛의 강도를 측정할 수 있도록 격자를 단계적(스캔 분광 광도계) 스캔할 수 있다.전하결합소자(CCD) 또는 포토다이오드 어레이(PDA)와 같은 검출기 어레이(어레이 분광광도계)도 사용할 수 있다.이러한 시스템에서는 그레이팅이 고정되고 어레이 내의 다른 검출기에 의해 빛의 각 파장의 강도가 측정된다.또한, 대부분의 현대 중적외선 분광 광도계는 스펙트럼 정보를 얻기 위해 푸리에 변환 기술을 사용합니다.이 기술은 푸리에 변환 적외선 분광법이라고 불립니다.

분광광도계는 투과측정 시 기준용액과 시험용액을 통과하는 빛의 비율을 정량적으로 비교한 후 두 신호의 강도를 전자적으로 비교하여 기준기준과 비교한 시료의 투과율을 산출한다.반사율 측정의 경우 분광 광도계는 기준 샘플과 테스트 샘플에서 반사되는 빛의 비율을 정량적으로 비교합니다.소스 램프로부터의 빛은 단색기를 통과하며, 단색기는 회전 프리즘을 통해 빛을 파장의 "무지개"로 회절시켜 이 회절된 스펙트럼의 좁은 대역폭을 단색기의 출력 측에 있는 기계적 슬릿을 통해 출력한다.이러한 대역폭은 테스트샘플을 통해 전송됩니다.그런 다음 투과광 또는 반사광의 광자속 밀도(보통 m2당 와트)를 포토다이오드, 전하 결합 소자 또는 기타 광센서로 측정한다.그런 다음 테스트 샘플의 각 파장에 대한 투과율 또는 반사율 값을 기준 샘플의 투과율 또는 반사율 값과 비교합니다.대부분의 계측기는 선형 투과율에 로그 함수를 적용하여 샘플의 '흡수성'을 계산합니다. 이 값은 측정하는 화학 물질의 '농도'에 비례합니다.

즉, 스캔 분광 광도계의 이벤트 시퀀스는 다음과 같습니다.

  1. 광원은 단색기로 빛나 무지개로 회절되어 두 개의 빔으로 분할됩니다.그런 다음 샘플과 기준 용액을 통해 스캔됩니다.
  2. 입사 파장의 일부는 시료와 기준에서 투과되거나 반사된다.
  3. 그 결과 발생하는 빛은 두 빔의 상대적 강도를 비교하는 광검출기 장치에 닿습니다.
  4. 전자회로는 상대전류를 선형전송률 및/또는 흡광도/농도 값으로 변환한다.

어레이 분광 광도계의 순서는 다음과 같습니다.[14]

  1. 광원을 샘플에 비추고 슬릿에 초점을 맞춥니다.
  2. 투과된 빛은 반사 격자와 함께 무지개로 굴절됩니다.
  3. 결과적으로 발생하는 빛이 광검출기 장치에 닿아 빔의 강도를 비교합니다.
  4. 전자 회로는 상대 전류를 선형 전송 비율 및/또는 흡광도/농도 값으로 변환합니다.

많은 구형 분광 광도계는 검출기에서 두 빔의 Null 전류 출력의 균형을 맞추기 위해 "영점 조정"이라고 알려진 절차를 통해 보정해야 합니다.기준물질의 전달은 기준치(기준치)로 설정되므로 다른 모든 물질의 전달은 최초 "영점" 물질에 대해 기록된다.그런 다음 분광 광도계는 투과율을 [6]초기 물질에 대한 테스트 샘플의 특정 성분 농도인 '흡수성'으로 변환합니다.

생화학 분야에서의 응용

분광광도측정법은 DNA, RNA, 단백질 분리, 효소 동력학 및 생화학 [15]분석과 관련된 많은 생화학 실험에서 사용되는 중요한 기술이다.이러한 애플리케이션의 샘플은 대량으로 쉽게 구할 수 없기 때문에 특히 이 비파괴 기법으로 분석하기에 적합합니다.또한 전체 [16]분석을 위해 1uL 정도의 시료가 필요한 마이크로볼륨 플랫폼을 활용하여 귀중한 시료를 절약할 수 있습니다.분광광도법의 간단한 설명은 착색화합물을 포함하지 않는 블랭크 시료의 흡광도와 착색화합물을 포함한 시료의 비교를 포함한다.이 색상은 595nm에서 측정된 Comasie Brilliant Blue G-250 염료 또는 [3]: 21–119 420nm에서 측정된 β-galactosidase와 ONPG(샘플 옐로우 턴) 사이의 효소 반응을 통해 얻을 수 있습니다.분광광도계는 가시광선 영역(350nm와 800nm [3]: 65 사이)에서 착색된 화합물을 측정하는 데 사용되므로 연구 중인 물질에 대한 더 많은 정보를 찾는 데 사용할 수 있습니다.생화학적 실험에서 화학 및/또는 물리적 특성이 선택되며, 사용되는 절차는 양, 순도, 효소 활성 등과 같은 샘플에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해 해당 특성에 고유하다.분광광도법은 시료의 최적 파장 흡광도 결정, 시료의 흡광도에 대한 최적 pH 결정, 미지의 시료의 농도 결정, 다양한 [3]: 21–119 시료의 pKa 결정 등 다양한 기술에 사용할 수 있다.분광광도측정법은 단백질 정화에[17] 도움이 되는 과정이며 화합물의 광학적 분석을 만드는 방법으로도 사용될 수 있다.분광 광도 데이터는 맥주-람버트 방정식, - 10 T c D A=-\ _와 함께 사용할 수도 있다.OD 투과율과 농도, 흡광도와 [3]: 21–119 농도 사이의 다양한 관계를 판단하기 위한 입니다.분광광도계는 그 색을 통해 화합물의 파장을 측정하기 때문에 색소결합물질을 첨가하여 [18]색변화를 일으켜 측정할 수 있다.각 성분의 표준용액의 흡수 스펙트럼을 이용하여 두 성분 혼합물의 농도를 알 수 있다.이를 위해서는 두 파장에서의 이 혼합물의 소멸 계수와 두 [19]성분의 알려진 무게를 포함하는 용액의 소멸 계수를 알아야 합니다.기존의 Beer-Lamberts 법칙 모델 외에도 큐벳 기반의 라벨 프리 분광법을 사용할 수 있으며, 이는 빛의 경로에 광학 필터를 추가하여 분광 광도계가 손 [20]법칙에 따라 샘플의 농도, 크기 및 굴절률을 정량화할 수 있게 한다.분광 광도계는 수십 년 동안 개발되고 개선되어 왔으며 화학자들 사이에서 널리 사용되어 왔다.또한 분광광도계는 UV 또는 가시광선 파장 흡광도 [3]: 21–119 값을 측정하는 데 특화되어 있습니다.이것은 매우 민감한 매우 정확한 기구로 간주되며, 따라서 특히 색상 변화를 [21]결정할 때 매우 정밀합니다.이 방법은 저렴하고 비교적 간단한 공정이기 때문에 실험실 실험에도 편리합니다.

자외선 가시 분광 광도 측정

대부분의 분광 광도계는 스펙트럼의 자외선가시 영역에서 사용되며, 이러한 기기 중 일부는 근적외선 영역에서도 작동합니다.단백질 농도는 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌의 존재로 인해 280 nm에서 OD를 측정하여 추정할 수 있다.단백질의 조성이 크게 달라 280nm에서 아미노산이 전혀 없는 단백질은 최대 흡수가 되지 않기 때문에 이 방법은 정확하지 않다.핵산 오염도 간섭을 일으킬 수 있다.이 방법에는 석영 큐벳으로 [3]: 135 자외선 영역에서 측정할 수 있는 분광 광도계가 필요합니다.

자외선 가시(UV-visible) 분광법은 전자 전환을 자극하는 에너지 수준을 포함합니다.UV-vis 빛의 흡수는 지면 상태에 있는 분자들을 들뜬 [5]상태로 흥분시킵니다.

가시영역 400~700 nm 분광광도법은 측색과학에서 광범위하게 사용된다.0.2~0.8 O.D. 범위에서 가장 잘 동작한다는 것은 이미 알려진 사실입니다.잉크 제조업체, 인쇄 회사, 직물 공급업체 및 기타 많은 기업들은 측색 기술을 통해 제공되는 데이터를 필요로 합니다.가시 영역을 따라 5~20나노미터마다 측정하여 스펙트럼 반사율 곡선 또는 데이터 스트림을 생성한다.이 곡선을 사용하여 새로운 배지의 착색제를 테스트하여 ISO 인쇄 표준 등의 사양과 일치하는지 확인할 수 있습니다.

기존의 가시 영역 분광 광도계는 착색제나 기재에 형광이 있는지 여부를 검출할 수 없습니다.이것에 의해, 예를 들면, 1개 또는 복수의 인쇄 잉크가 형광인 경우, 색상의 문제를 관리하는 것이 어려워질 가능성이 있습니다.착색제가 형광을 포함하는 경우, 양분광 형광 분광 광도계를 사용한다.시각 스펙트럼 분광 광도계에는 d/8(구면)과 0/45의 두 가지 주요 설정이 있다.이러한 이름은 광원, 관찰자 및 측정 챔버 내부의 형상 때문에 붙여졌습니다.과학자들은 이 기구를 사용하여 샘플의 화합물 양을 측정합니다.화합물이 더 농축되면 샘플에 의해 더 많은 빛이 흡수됩니다. 작은 범위에서는 맥주-람버트 법칙이 유지되고 샘플 간의 흡광도는 농도에 따라 선형적으로 변화합니다.인쇄 측정의 경우 일반적으로 두 가지 대체 설정이 사용됩니다. 즉, 용지 용지 용지 내에서 UV 밝기의 효과를 더 잘 제어하기 위해 UV 필터가 없거나 함께 사용됩니다.

메틀러 톨레도 UV5나노 마이크로볼륨 분광광도계

샘플은 보통 큐벳으로 준비된다. 관심 영역에 따라 유리, 플라스틱(관심 스펙트럼 영역) 또는 석영(관심 UV 스펙트럼 영역)으로 구성될 수 있다.마이크로볼륨 플랫폼에서 실행할 수 있는 소규모 볼륨 측정이 필요한 응용 프로그램도 있습니다.

적용들

실험 응용 프로그램

응용 섹션에서 설명한 바와 같이, 분광광도법은 DNA, RNA 및 단백질의 정성적 및 정량적 분석에 모두 사용될 수 있다.질적 분석을 이용할 수 있으며, 분광광도계를 사용하여 광파장 영역을 주사하여 각 [5]파장에서의 화합물의 흡광도 특성(색상의 강도)을 측정함으로써 화합물의 스펙트럼을 기록할 수 있다.가시 분광 광도법이 가질 수 있는 다양한 용도를 증명할 수 있는 한 가지 실험은 다양한 단백질의 혼합물에서 β-갈락토시다아제를 분리하는 것이다.일반적으로 분광 광도법은 총 단백질 농도에 비해 샘플이 정제된 양을 정량화하는 데 가장 적합합니다.어피니티 크로마토그래피를 실행함으로써 채취한 시료를 ONPG와 반응시켜 시료가 노란색으로 [3]: 21–119 변하는지 여부를 판정함으로써 B-갈락토시다아제를 분리하여 시험할 수 있다.ONPG와의 특정 상호작용에 대해서는 420nm에서, Bradford Assay에 대해서는 595에서 샘플의 정제량을 정량적으로 [3]: 21–119 평가할 수 있습니다.이 분광광도 측정법 외에도 다양한 단백질 샘플을 정제 및 분리하기 위해 SDS-Page 전기영동법 등의 다른 기술과 함께 사용할 수 있습니다.

적외선 분광 광도법

적외선 영역용으로 설계된 분광 광도계는 해당 영역의 기술적 측정 요건 때문에 상당히 다릅니다.한 가지 주요 요인은 다른 스펙트럼 영역에 사용할 수 있는 광센서의 유형이지만, 거의 모든 것이 열 방사선으로 적외선 빛을 방출하기 때문에, 특히 약 5μm 이상의 파장에서 적외선 측정도 어렵다.

유리나 플라스틱 등 적외선을 흡수하는 소재가 많아 광학매체와 호환되지 않는 것도 합병증이다.이상적인 광학 재료는 소금으로, 강하게 흡수되지 않습니다.IR 분광 광도 측정용 샘플은 브롬화칼륨 디스크 2장 사이에 묻히거나 브롬화칼륨을 분쇄하여 펠릿에 압착할 수 있습니다.수용액을 측정하는 경우에는 불용성 염화은을 사용하여 세포를 구성한다.

분광 방사계

가시 영역 분광 광도계와 거의 비슷하게 작동하는 분광 방사계광원의 스펙트럼 밀도를 측정하기 위해 설계되었습니다.응용 프로그램에는 제조업체에 의한 판매를 위한 조명 평가 및 분류 또는 고객이 구매하기로 결정한 램프가 사양 범위 내에 있는지 확인하기 위한 분류가 포함될 수 있습니다.컴포넌트:

  1. 광원은 샘플 위 또는 샘플 속을 비춥니다.
  2. 샘플은 빛을 투과하거나 반사합니다.
  3. 검출기는 샘플에서 반사되거나 샘플을 통해 투과된 빛의 양을 검출합니다.
  4. 그런 다음 검출기는 샘플이 투과하거나 반사한 빛의 양을 수치로 변환합니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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외부 링크