형광 분광학

Fluorescence spectroscopy
수은 결정을 위한 원자 형광 분광 분석기

형광 분광법(형광법 또는 분광법이라고도 함)은 표본의 형광을 분석하는 전자기 분광법의 일종이다.그것은 특정 화합물의 분자에서 전자를 흥분시켜 빛을 발산하게 하는, 일반적으로는 꼭 그렇지만 꼭 보이는 것은 아닌, 가시광선을 이용하는 것을 포함한다.보완 기법은 흡수 분광법이다.단일 분자 형광 분광법의 특별한 경우, 방출된 빛으로부터의 강도 변동은 단일 형광체 또는 쌍의 형광체로부터 측정된다.

형광을 측정하는 장치를 형광계라고 한다.

이론

주요 기사:형광

분자는 에너지 수준이라고 불리는 다양한 상태를 가지고 있다.형광 스펙트럼 분석은 주로 전자적 및 진동적 상태에 관한 것이다.일반적으로 검사되는 종은 지상 전자 상태(낮은 에너지 상태)와 더 높은 에너지의 흥분된 전자 상태를 가지고 있다.이러한 각각의 전자 상태 안에는 다양한 진동 상태가 있다.[1]

형광에서 이 종은 지상 전자 상태에서 흥분한 전자 상태의 다양한 진동 상태 중 하나로 광자를 흡수함으로써 먼저 흥분한다.다른 분자와의 충돌은 흥분한 분자가 흥분한 전자 상태에서 가장 낮은 진동 상태에 도달할 때까지 진동 에너지를 잃게 한다.이 과정은 종종 자블론스키 도표로 시각화된다.[1]

그러면 분자는 그 과정에서 광자를 방출하면서 다시 지상 전자 상태의 다양한 진동 수준 중 하나로 떨어진다.[1]분자가 지면 상태의 여러 진동 수준 중 하나로 떨어질 수 있기 때문에 방출되는 광자는 다른 에너지, 즉 주파수를 가질 것이다.따라서 형광 분광기에서 방출되는 빛의 다양한 주파수를 상대적 강도와 함께 분석함으로써 다른 진동 수준의 구조를 파악할 수 있다.

원자종의 경우 그 과정은 유사하지만, 원자종은 진동 에너지 수준을 가지지 않기 때문에 방출되는 광자는 입사 방사선과 같은 파장에 있는 경우가 많다.흡수된 광자를 재방출하는 이러한 과정은 "재조합 형광"이며, 원자 형광의 특성이기는 하지만 분자 형광에서도 나타난다.[2]

일반적인 형광(배출) 측정에서는 흥분 파장이 고정되어 있고 탐지 파장은 변화하는 반면 형광 투과 측정에서는 검출 파장이 고정되어 있고 관심 영역에 걸쳐 흥분 파장은 변화한다.방출 지도는 다양한 흥분 파장에서 발생하는 방출 스펙트럼을 기록하고 그것들을 모두 결합하여 측정한다.이것은 3차원 표면 데이터 집합으로, 방출 강도는 흥분과 방출 파장의 함수로써, 전형적으로 등고선도로 묘사된다.

계측

두 가지 일반적인 유형의 계측기가 존재한다: 필터를 사용하여 입사광과 형광등을 분리하는 필터 형광계와 회절 그래팅 단색기를 사용하여 입사광과 형광등을 분리하는 분광기계가 있다.

두 가지 유형 모두 다음과 같은 방법을 사용한다: 흥분원에서 나오는 빛이 필터나 단색화기를 통과하여 샘플을 타격한다.입사광의 일부는 표본에 의해 흡수되고, 표본의 일부 분자는 형광을 발한다.형광등은 사방으로 발산된다.이 형광등 중 일부는 두 번째 필터나 단색화기를 통과하여 검출기에 도달하는데, 검출기에 도달하는 입사광의 전송 또는 반사광의 위험을 최소화하기 위해 보통 입사광선에 90°에 위치한다.

불소측정기 구성요소의 단순설계

레이저, LED 및 램프, 특히 제논 호 및 수은증기 램프를 포함한 다양한 광원을 흥분원으로 사용할 수 있다.레이저가 매우 좁은 파장 간격(일반적으로 0.01nm 이하)에서만 높은 방사조도 빛을 방출하므로 배설 단색기 또는 필터가 불필요하다.이 방법의 단점은 레이저의 파장을 크게 바꿀 수 없다는 것이다.수은증기등(Mercury Vaper Lamp)은 라인 램프로서, 피크 파장 근처에서 빛을 방출한다는 것을 의미한다.대조적으로 제논 아크는 300-800nm 범위에서 거의 일정한 강도와 200nm 바로 위까지 측정하기에 충분한 방사조도를 가진 연속 방출 스펙트럼을 가지고 있다.

필터 및/또는 단색화기는 불소계에 사용할 수 있다.단색화기는 조정 가능한 허용오차로 조정 가능한 파장의 빛을 전달한다.가장 일반적인 유형의 단색화기는 회절 그레이팅을 활용하는데, 즉 시준된 빛이 그레이팅을 비추고 파장에 따라 다른 각도로 출구한다.그런 다음 모노크롬화기를 조정하여 전송할 파장을 선택할 수 있다.음이소트로피 측정을 허용하려면 다음 두 가지 양극화 필터를 추가해야 한다.배출 단색화기 또는 필터 뒤에 1개, 배출 단색화기 또는 필터 앞에 1개.

앞에서 언급했듯이 형광은 흥분광에 비해 90° 각도로 측정되는 경우가 가장 많다.이 지오메트리는 송신된 흥분등의 간섭을 피하기 위해 180° 각도의 흥분등 선에 센서를 배치하는 대신 사용된다.어떤 단색화기도 완벽하지 않고 그것은 어떤 빗나간 빛, 즉 목표한 것 이외의 다른 파장으로 빛을 전달할 것이다.이상적인 단색화기는 지정된 범위 내에서만 빛을 전송하고 높은 파장에 독립적인 전송을 할 수 있다.90° 각도로 측정할 때는 표본에 의해 산란된 빛만이 표광을 유발한다.이로 인해 신호 대 잡음 비율이 향상되고 180° 기하학과 비교할 [3]때 검출 한계가 약 10000만큼 낮아진다.게다가, 형광은 또한 탁하거나 불투명한 샘플에 대해 종종 행해지는 전면으로부터 측정될 수 있다.[4]

검출기는 단일 채널 또는 다중 채널로 구성될 수 있다.단채널 검출기는 한 번에 한 파장의 강도만 검출할 수 있는 반면, 다채널 검출기는 모든 파장의 강도를 동시에 검출해 방출 단색기 또는 필터가 불필요하게 된다.다양한 유형의 검출기는 장단점을 모두 가지고 있다.

이중 단색화기와 연속적인 흥분 광원을 가진 가장 다재다능한 불소계는 흥분 스펙트럼과 형광 스펙트럼 모두를 기록할 수 있다.형광 스펙트럼을 측정할 때, 호기광의 파장은 일정하게 유지되며, 가급적이면 높은 흡수의 파장에서 방출 단색체가 스펙트럼을 스캔한다.흥분 스펙트럼 측정을 위해 방출 필터나 단색화기를 통과하는 파장은 일정하게 유지되며, 흥분 단색화기는 스캐닝을 하고 있다.형광 강도가 흡수에 비례하기 때문에 일반적으로 흥분 스펙트럼은 흡수 스펙트럼과 동일하다.[5]

데이터 분석

OpenChrom에서 GNU R 내보내기
OpenChrom의 OpenFluor 플러그인에 물질 일치[6] 표시

저농도에서 형광 강도는 일반적으로 형광의 농도에 비례한다.

UV/가시 분광학에서 '표준'과 달리 장치 독립 스펙트럼은 쉽게 확보되지 않는다.스펙트럼에 영향을 미치고 왜곡되는 몇 가지 요인이 있으며, '참' 즉 기계에 독립적인 스펙트럼을 얻기 위해서는 보정이 필요하다.다양한 유형의 왜곡은 계측기 또는 샘플과 관련된 것으로 분류될 것이다.첫째, 계측기에서 발생하는 왜곡에 대해 논의한다.우선, 광원 강도 및 파장 특성은 각 실험 동안과 각 실험 사이에 시간에 따라 변화한다.게다가 어떤 램프도 모든 파장에서 일정한 강도를 가지고 있지 않다.이를 교정하기 위해 단색화기 또는 필터 후에 빔 스플리터를 적용하여 빛의 일부를 기준 검출기로 유도할 수 있다.

또한 모노크롬화기와 필터의 전송 효율을 고려해야 한다.이것들은 또한 시간이 지남에 따라 변할 수도 있다.단색화기의 전송 효율도 파장에 따라 달라진다.이는 선택적 기준 검출기를 배설 단색기 또는 필터 뒤에 배치해야 하는 이유다.검출기에 의해 집히는 형광 비율도 시스템에 따라 달라진다.또한 검출기 양자 효율, 즉 검출된 광자의 비율은 검출기가 불가피하게 악화됨에 따라 파장과 시간에 따라 검출기마다 다르다.

고려해야 하는 두 가지 다른 주제에는 방사선을 지시하는 데 사용되는 광학 및 표본 물질의 보유 또는 포함 수단(큐벳 또는 셀이라고 함)이 포함된다.대부분의 UV, 가시 및 NIR 측정의 경우 정밀 석영 큐벳을 사용해야 한다.두 경우 모두 관심 파장 범위에서 흡수가 상대적으로 적은 소재를 선택하는 것이 중요하다.Quartz는 200nm-2500nm에서 전송되기 때문에 이상적이다; 높은 등급의 Quartz는 3500nm까지 전송될 수 있는 반면, 다른 물질의 흡수 특성은 표본의 형광을 가릴 수 있다.

'표준' 스펙트럼을 얻기 위한 이러한 모든 기인 요인을 수정하는 것은 지루한 과정이며, 이는 엄격히 필요한 경우에만 실제로 적용된다.예를 들어 양자 수율을 측정하거나 방출 강도가 가장 높은 파장을 찾을 때 그렇다.

앞서 언급했듯이, 표본에서도 왜곡이 발생한다.따라서 표본의 일부 측면도 고려해야 한다.첫째로, 광선 구성은 시간 경과에 따른 형광 강도를 감소시킬 수 있다.빛의 산란도 고려해야 한다.이 맥락에서 가장 중요한 산란 유형은 레일리 산란과 라만 산란이다.레일리 산란으로 산란된 빛은 입사광과 같은 파장을 가지고 있는 반면, 산란된 라만에서 산란된 빛은 파장을 보통 더 긴 파장으로 바꾼다.라만 산란은 흥분등에 의해 유도된 가상 전자 상태의 결과물이다.이 가상 상태에서 분자는 진동 접지 상태 이외의 진동 수준으로 다시 이완할 수 있다.[7]형광 스펙트럼의 경우, 항상 정점이 물의 정점 조명보다 3600 cm−1 낮은 정점에 나타나는 경우와 같이 정점 감광 스펙트럼은 정점 감광수에 상대적인 정점 감광수 차이에서 나타난다.

고려해야 할 다른 측면은 내부 필터 효과다.[8][9]여기에는 재흡수가 포함된다.재흡수는 또 다른 분자나 고분자의 일부가 불소포자가 방사선을 방출하는 파장에서 흡수되기 때문에 일어난다.이 경우 불소포자가 방출하는 광자의 일부 또는 전부가 다시 흡수될 수 있다.또 다른 내부 필터 효과는 불소포자를 포함한 흡수 분자의 고농도 때문에 발생한다.그 결과 흥분 광선의 강도는 용액 전체에 걸쳐 일정하지 않다.결과적으로, 소량의 흥분등만이 검출 시스템에 대해 보이는 불소광에 도달한다.내부 필터 효과는 방출된 빛의 스펙트럼과 강도를 변화시키므로 형광등의 방출 스펙트럼을 분석할 때 고려해야 한다.[5][10]

트립토판 형광체

접힌 단백질의 형광은 개별 방향제 잔류물의 형광의 혼합물이다.접힌 단백질의 형광물질 배출의 대부분은 트립토판 잔류물의 배출에 기인하며, 티로신 및 페닐알라닌에 의한 배출이 일부 있지만, 이황화 결합은 또한 이 파장 범위에서 상당한 흡수를 가진다.일반적으로 트립토판은 최대 흡수량이 280nm의 파장과 지역 환경의 극성에 따라 ca. 300nm에서 350nm에 이르는 솔바토크롬의 방출 피크를 가지고 있다. 따라서 단백질 형광은 단백질의 순응 상태를 진단하는 데 사용될 수 있다.[12]또한 트립토판 형광은 다른 잔류물의 근접성에 의해 강한 영향을 받는다(즉, 아스프 또는 글루와 같은 근처의 양성자 집단은 Trp 형광의 침하를 유발할 수 있다).또한 트립토판과 다른 형광 아미노산 사이의 에너지 전달이 가능하여 분석에 영향을 미칠 수 있으며, 특히 퓌스터 산성 접근법을 취하는 경우 더욱 그러하다.게다가, 트립토판은 상대적으로 희귀한 아미노산이다; 많은 단백질은 오직 하나 또는 몇 개의 트립토판 잔류물만을 포함하고 있다.따라서 트립토판 형광은 개별 트립토판 잔류물의 순응 상태를 매우 민감하게 측정할 수 있다.외인 탐침에 비해 단백질 자체가 변하지 않는 것이 장점이다.단백질 순응 연구를 위한 내인 형광의 사용은 실제로 트립토판 잔류물이 거의(또는 아마도 한 개만) 없는 경우에 한정된다. 왜냐하면 각각 다른 국소 환경을 경험하기 때문에 다른 방출 스펙트럼이 발생하기 때문이다.

트립토판은 중요한 내인성 형광(아미노산)으로 트립토판의 미세환경의 성질을 추정하는 데 사용할 수 있다.변성제, 계면활성제 또는 다른 앰프힐 분자로 실험을 수행할 때 트립토판의 미세환경이 변화할 수 있다.예를 들어, 그것의 '수소 공포증' 코어에 단일 트립토판을 포함하는 단백질이 증가하는 온도로 변성되면, 적색 변성 방출 스펙트럼이 나타날 것이다.이것은 트립토판이 수용성 단백질 내부와는 반대로 수용성 환경에 노출되었기 때문이다.이와는 대조적으로 계면활성제를 수용액 용제에 노출된 트립토판을 함유한 단백질에 첨가하면 트립토판이 계면활성제 베실이나 미셀에 내장될 경우 푸른색 변성 방출 스펙트럼이 발생한다.[13]트립토판이 부족한 단백질은 플루오르포레와 결합될 수 있다.

295nm의 형광 투과율에서 트립토판 방출 스펙트럼은 약한 티로신 및 페닐알라닌 형광보다 우세하다.

적용들

형광 분광학은 무엇보다도 유기 화합물 분석을 위한 생화학, 의학, 화학 연구 분야에서 사용된다.악성 피부 종양과 양성 피부 종양을 구별하는 데 사용했다는 보고도 있었다.

AFS 기법은 공기나 물에 존재하는 화합물의 다른 종류의 분석/측정이나 수은과 같은 중금속 검출에 사용되는 CVAFS와 같은 다른 매체에 유용하다.

형광등은 광자를 리디렉션하는 데도 사용될 수 있다. 형광 태양열 집열기를 참조하라.

또한 형광 분광법은 미세불화분광법을 사용하여 미세한 수준에 적응시킬 수 있다.

해석 화학에서 형광 검출기는 HPLC와 함께 사용된다.

물 연구 분야에서는 형광 분광법을 활용해 유기 오염물질을 검출해 수질 상태를 모니터링할 수 있다.[14]최근의 컴퓨터 과학과 기계 학습의 발전은 심지어 물의 박테리아 오염을 탐지하는 것을 가능하게 했다.

참고 항목

참조

  1. ^ a b c 형광 원리와 UV-visible 흡광도 원리를 위한 애니메이션
  2. ^ 기악 분석의 원리 F.제임스 홀러, 더글러스 A.스쿠그 & 스탠리 R.크라우치 2006
  3. ^ 렌델, D. (1987)형광 및 인광.왕관
  4. ^ Eisinger, Josef; Flores, Jorge (1979). "Front-face fluorometry of liquid samples". Analytical Biochemistry. 94 (1): 15–21. doi:10.1016/0003-2697(79)90783-8. ISSN 0003-2697. PMID 464277.
  5. ^ a b Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21 May 1999). Introduction to Fluorescence Spectroscopy. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.
  6. ^ Murphy, Kathleen R.; Stedmon, Colin A.; Wenig, Philip; Bro, Rasmus (2014). "OpenFluor– an online spectral library of auto-fluorescence by organic compounds in the environment" (PDF). Anal. Methods. 6 (3): 658–661. doi:10.1039/C3AY41935E.
  7. ^ 가울리츠, G.와 보딘, T.(2003).분광학 안내서.와일리-VCH
  8. ^ Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Ceresa, Luca; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Szabelski, Mariusz; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2020-06-01). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence Part I: primary inner filter effect-the proper approach for sample absorbance correction". Methods and Applications in Fluorescence. 8 (3): 033002. doi:10.1088/2050-6120/ab947c. ISSN 2050-6120.
  9. ^ Ceresa, Luca; Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2021-05-24). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence. Part II: secondary inner filter effect -the proper use of front-face configuration for highly absorbing and scattering samples". Methods and Applications in Fluorescence. 9 (3): 035005. doi:10.1088/2050-6120/ac0243. ISSN 2050-6120.
  10. ^ 라코비츠, J. R. (1999년)형광 분광법의 원리.클루워어 학 / 플레넘 출판사
  11. ^ 웨이백 기계에 보관된 단백질과 펩타이드의 내인성 형광성
  12. ^ Vivian JT, Callis PR (2001). "Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins". Biophys. J. 80 (5): 2093–109. Bibcode:2001BpJ....80.2093V. doi:10.1016/S0006-3495(01)76183-8. PMC 1301402. PMID 11325713. Archived from the original on September 6, 2008.
  13. ^ 카푸토 GA, London E.아미노산 대체와 소수성 불일치가 소수성 알파헬리스크의 투과 안정성과 순응에 미치는 누적 효과.생화학2003년 3월 25일;42(11):3275-85.
  14. ^ Carstea, Elfrida M.; Bridgeman, John; Baker, Andy; Reynolds, Darren M. (2016-05-15). "Fluorescence spectroscopy for wastewater monitoring: A review". Water Research. 95: 205–219. doi:10.1016/j.watres.2016.03.021. ISSN 0043-1354. PMID 26999254.
  15. ^ Nakar, Amir; Schmilovitch, Ze’ev; Vaizel-Ohayon, Dalit; Kroupitski, Yulia; Borisover, Mikhail; Sela (Saldinger), Shlomo (2020-02-01). "Quantification of bacteria in water using PLS analysis of emission spectra of fluorescence and excitation-emission matrices". Water Research. 169: 115197. doi:10.1016/j.watres.2019.115197. ISSN 0043-1354. PMID 31670087.

외부 링크