유전자 녹아웃

Gene knockout

유전자 녹아웃(Genene Knockout)은 유기체의 유전자 중 하나가 작동하지 않게 되는 유전자 기술이다.그러나 KO는 녹아웃된 유전자나 녹아웃된 유전자를 가지고 있는 유기체를 지칭할 수도 있다.녹아웃 유기체 또는 단순히 녹아웃은 유전자 기능을 연구하는데 사용되며, 보통 유전자 손실의 영향을 조사한다.연구자들은 녹아웃 유기체와 정상 개체 간의 차이에서 추론을 도출한다.

KO 기술은 본질적으로 유전자 녹인과 반대입니다.유기체에서 두 개의 유전자를 동시에 녹아웃시키는 것은 더블 녹아웃으로 알려져 있다.마찬가지로 트리플 녹아웃(TKO)과 쿼드러플 녹아웃(QKO)이라는 용어는 각각 3개 또는 4개의 녹아웃 유전자를 설명하기 위해 사용된다.그러나 헤테로 접합성 KO와 호모 접합성 KO를 구별할 필요가 있다.전자의 경우, 2개의 유전자 카피(알레) 중 1개만 녹아웃되고, 후자의 경우 2개 모두 녹아웃된다.

방법들

녹아웃은 다양한 기술을 통해 이루어집니다.원래, 자연적으로 발생하는 돌연변이가 확인되었고, 그 후 유전자 손실이나 불활성화는 DNA 염기서열 분석이나 다른 [1]방법으로 확립되어야 했다.

정상적인 실험용 생쥐 옆에는 모발 성장에 영향을 주는 유전자가 녹아웃된 실험용 생쥐(왼쪽)가 표시되어 있다.

상동재조합

주요 기사:상동재조합

전통적으로, 상동 재조합이 유전자 녹아웃을 일으키는 주요 방법이었다.이 방법은 원하는 돌연변이를 포함하는 DNA 구성을 생성하는 것을 포함한다.녹아웃을 위해, 이것은 일반적으로 원하는 녹아웃 [2]유전자 대신 약물 내성 마커를 포함한다.이 구성에는 대상 [2]시퀀스에 대한 최소 2kb의 호몰로지도 포함됩니다.이 구조는 미세 주입이나 전기 [2]주입을 통해 줄기세포에 전달될 수 있다.이 방법은 DNA 구조를 기존 DNA로 재조합하기 위해 세포 자체의 복구 메커니즘에 의존합니다.이것은 유전자의 염기서열이 바뀌는 결과를 가져오고, 만약 유전자가 조금이라도 번역된다면 대부분의 경우, 그 유전자는 기능하지 않는 단백질로 번역될 것이다.그러나, 상동 재조합이 DNA [2][3]통합의 10에서-3 10만을 차지하기−2 때문에 이것은 비효율적인 과정이다.종종 구조의 약물 선택 마커는 재조합 이벤트가 발생한 세포를 선택하는 데 사용됩니다.

야생형 물리 이끼 및 녹아웃 이끼:유전자 교란 라이브러리 형질전환체에서 유도되는 변형 표현형.배우자세포의 분화와 발달을 유도하기 위해 최소한의 Knop 배지에서 물리적인 야생형 변형식물을 재배하였다.각 플랜트에 대해 개요(위 행, 축척 막대는 1mm에 해당)와 클로즈업(아래 행, 축척 막대는 0.5mm에 해당)이 표시됩니다.A: 잎이 많은 배우체 포자와 야생 잎 클로즈업으로 완전히 덮인 반수형 야생 이끼 식물.B~[4]D: 다른 돌연변이.

현재 이 유전자가 결여된 줄기세포는 초기 [2]배아에 삽입함으로써 예를 들어 생쥐에게 생체 내에서 사용될 수 있다.만약 그 결과로 생긴 키메라 쥐가 그들의 생식줄에 유전적 변화를 포함한다면,[2] 이것은 자손에게 유전될 수 있다.

대부분의 유전자에 대해 두 개의 대립 유전자를 포함하고 동일한 역할로 공동 작업하는 여러 개의 관련 유전자를 포함할 수 있는 이배체 유기체에서는 모든 표적 유전자가 녹아웃될 때까지 추가적인 변형과 선택이 수행됩니다.호모 접합 녹아웃 동물을 생산하기 위해서는 선택적 교배가 필요할 수 있다.

부위특이핵산가수분해효소

그림 1. 단일 염기쌍 결실로 인한 프레임시프트 돌연변이로 인해 아미노산 배열의 변화와 조기 정지 코돈이 발생한다.

현재 이중가닥 절단을 도입하기 위해 DNA 서열을 정확하게 조준하는 세 가지 방법이 사용되고 있습니다.일단 이것이 일어나면, 세포의 복구 메커니즘은 종종 두 개의 절단 끝을 [3]직접 결합하는 것을 포함하는 NHEJ(Non-Homologous End Joining)를 통해 이 이중 가닥 파단을 복구하려고 시도합니다.이는 불완전하게 수행될 수 있으며, 따라서 때때로 프레임 시프트 돌연변이를 일으키는 염기쌍의 삽입 또는 결실을 유발할 수 있습니다.이러한 돌연변이는 그들이 발생하는 유전자를 기능하지 않게 만들 수 있고, 따라서 그 유전자의 녹아웃을 만들어 낼 수 있다.이 과정은 상동 재조합보다 효율적이며, 따라서 바이알렐 [3]녹아웃을 만드는 데 더 쉽게 사용될 수 있습니다.

아연손가락

주요 기사: 아연 핑거 뉴클레아제

아연-핑거 핵산 분해효소는 DNA [3]염기서열을 정확하게 겨냥할 수 있는 DNA 결합 도메인으로 구성됩니다.각 아연 핑거는 원하는 DNA 배열의 코돈을 인식할 수 있으므로 특정 [5]배열에 결합하기 위해 모듈식으로 조립할 수 있다.이러한 결합 도메인은 [3]DNA에서 이중 가닥 절단(DSB)을 일으킬 수 있는 제한 핵산가수분해효소(Endonuclease)와 결합됩니다.복구 과정은 유전자의 기능을 파괴하는 돌연변이를 일으킬 수 있다.

손상되다

주요 기사:전사활성화제양이펙터뉴클레아제

전사활성화유사 이펙터 핵산가수분해효소(TALENs)는 DNA 결합 도메인과 [6]DNA를 분해할 수 있는 핵산가수분해효소도 포함한다.DNA 결합 영역은 각각 원하는 표적 DNA [5]배열의 단일 염기쌍을 인식하는 아미노산 반복으로 구성됩니다.이 분열이 유전자 코드 영역을 대상으로 하고 NHEJ 매개 수복에 의해 삽입 및 결실이 도입되면 프레임시프트 돌연변이가 일어나 유전자의 기능을 [6]교란시키는 경우가 많다.

CRISPR/Cas9

주요 기사: CRISPR

Cas9 [5]단백질과 복합된 가이드 RNA를 포함한 게놈 편집 방법으로서 클러스터 정규 간격간 짧은 회문 반복(CRISPR)/Cas9.가이드 RNA는 아연 핑거 또는 [7]TALEN에 의해 요구되는 구성물의 조립에 시간이 걸리는 것과 달리 단순한 상호보완적 염기쌍을 통해 원하는 DNA 염기서열을 일치시키도록 설계될 수 있다.결합된 Cas9은 [5]DNA의 이중 가닥을 파괴할 것이다.아연 손가락이나 TALEN과 같은 원리에 따라, 이러한 이중 가닥 파단을 복구하려는 시도는 종종 기능하지 않는 유전자를 [5]야기하는 프레임시프트 돌연변이를 야기합니다.

녹인

주요 기사:유전자 녹인

유전자 녹인은 유전자 녹아웃과 유사하지만, 유전자를 삭제하는 대신 다른 유전자로 대체한다.

종류들

조건부 녹아웃

주요 기사: 조건부 유전자 녹아웃

조건부 유전자 녹아웃은 조직 특이적인 방법으로 조직 내 유전자 결실을 가능하게 한다.이것은 눌 돌연변이가 태아 [8]사망으로 이어질 수 있거나 특정 조직이나 세포 유형이 특정 관심사인 경우 유전자 녹아웃 대신 필요하다.이것은 유전자 주위에 loxP 부위라고 불리는 짧은 염기서열을 도입함으로써 이루어진다.이러한 시퀀스는 녹아웃과 동일한 메커니즘을 통해 세균 라인에 도입된다.이 배아줄은 이러한 염기서열을 인식하고 재조합하여 이러한 부위 옆에 있는 유전자를 삭제할 수 있는 바이러스 효소인 Cre-re-combinase를 포함하는 다른 생식줄로 교차될 수 있다.

사용하다

일반 마우스와 비교하여 비만의 모델인 녹아웃 마우스(왼쪽).

녹아웃은 주로 녹아웃 생물과 유사한 유전적 배경을 가진 야생형을 비교함으로써 특정 유전자 또는 DNA 영역의 역할을 이해하는 데 사용된다.

녹아웃생물은 또한 약물의 개발에서 선별도구로 사용되며, 특정 녹아웃을 사용하여 특정 생물학적 과정 또는 결핍을 표적으로 하거나, 사카로미세스 세레비시아와 [9]같이 게놈 전체에 걸쳐 있는 녹아웃생물의 라이브러리를 사용하여 약물의 작용 메커니즘을 이해한다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Griffiths AJ, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin WC, Gelbart WM (2000). An Introduction to Genetic Analysis (7th ed.). New York: W. H. Freeman. ISBN 978-0-7167-3771-1.
  2. ^ a b c d e f Hall, Bradford; Limaye, Advait; Kulkarni, Ashok B. (2009-09-01). Overview: Generation of Gene Knockout Mice. Current Protocols in Cell Biology. Vol. 44. Wiley-Blackwell. pp. Unit 19.12 19.12.1–17. doi:10.1002/0471143030.cb1912s44. ISBN 978-0471143031. PMC 2782548. PMID 19731224.
  3. ^ a b c d e Santiago, Yolanda; Chan, Edmond; Liu, Pei-Qi; Orlando, Salvatore; Zhang, Lin; Urnov, Fyodor D.; Holmes, Michael C.; Guschin, Dmitry; Waite, Adam (2008-04-15). "Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases". Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (15): 5809–5814. doi:10.1073/pnas.0800940105. ISSN 0027-8424. PMC 2299223. PMID 18359850.
  4. ^ Egener T, Granado J, Guitton M, Hohe A, Holtorf H, Lucht JM, et al. (2002). "High frequency of phenotypic deviations in Physcomitrella patens plants transformed with a gene-disruption library". BMC Plant Biology. 2 (1): 6. doi:10.1186/1471-2229-2-6. PMC 117800. PMID 12123528.
  5. ^ a b c d e Gaj, Thomas; Gersbach, Charles A.; Barbas, Carlos F. (2013). "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering". Trends in Biotechnology. 31 (7): 397–405. doi:10.1016/j.tibtech.2013.04.004. PMC 3694601. PMID 23664777.
  6. ^ a b Joung, J. Keith; Sander, Jeffry D. (January 2013). "TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing". Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1): 49–55. doi:10.1038/nrm3486. ISSN 1471-0080. PMC 3547402. PMID 23169466.
  7. ^ Ni, Wei; Qiao, Jun; Hu, Shengwei; Zhao, Xinxia; Regouski, Misha; Yang, Min; Polejaeva, Irina A.; Chen, Chuangfu (2014-09-04). "Efficient Gene Knockout in Goats Using CRISPR/Cas9 System". PLOS ONE. 9 (9): e106718. Bibcode:2014PLoSO...9j6718N. doi:10.1371/journal.pone.0106718. ISSN 1932-6203. PMC 4154755. PMID 25188313.
  8. ^ Le, Yunzheng; Sauer, Brian (2001-03-01). "Conditional gene knockout using cre recombinase". Molecular Biotechnology. 17 (3): 269–275. doi:10.1385/MB:17:3:269. ISSN 1073-6085. PMID 11434315. S2CID 41578035.
  9. ^ "YeastDeletionWebPages". Retrieved 21 February 2017.

외부 링크