DNA추출

DNA extraction
다양한 메서드의 경우에는 핵산 메서드를 참조하십시오.

디옥시 리보 핵산(DNA)의 첫번째 격리 1869년 프리드리히 미셰르에 의해 이루어졌다.[1]분자 생물학이나 법 의학적 분석에 현재는 통상적인 절차이다.그 화학적 방법에는 많은 다른 세트가 추출에 사용되고 정확한 선택 장비 최적화 및 추출 절차에 시간을 절약할 수 있다.PCR은 민감성 탐지가 상업적 도구 사이의 변화를 보여 주는 것으로 간주된다.[2]

기본 절차

  • 연구 대상 세포는 채취할 필요가 있다.
  • 세포막을 부수어 내부 세포질과 함께 DNA를 노출시키는 것(세포 용해).
  • 그 용액은 부서진 단백질, 지질, RNA와 같은 찌꺼기를 뭉치게 하기 위해 농축 소금 용액(염수)으로 처리된다.
  • 용액의 원심분리. 뭉친 세포 부스러기를 DNA에서 분리한다.
  • 세포 용해 단계에서 사용되는 세제, 단백질, 소금 및 시약으로부터 DNA 정제.가장 일반적으로 사용되는 절차는 다음과 같습니다.

DNA에 결합된 세포단백질 및 히스톤단백질은 단백질분해효소를 첨가하거나 해당 단백질을 초산나트륨 또는 아세트산암모늄으로 침전시키거나 DNA침전 전에 페놀-클로로포름 혼합물로 추출함으로써 제거할 수 있다.

분리 후 DNA는 보통 TE 버퍼 또는 초순수에서 약간 알칼리성 버퍼에 용해된다.

방법 선택

가장 일반적인 DNA 추출 방법 중 일부는 유기 추출, 첼렉스 추출, 고상 [3]추출을 포함한다.이 방법들은 지속적으로 분리된 DNA를 생산하지만, 그것들은 추출된 DNA의 질과 양에서 모두 다르다.DNA 추출 방법을 선택할 때 비용, 시간, 안전성, 오염 위험 등 고려해야 할 여러 요소가 있습니다.

유기 추출은 용해 단계, 페놀 클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 세척 단계를 포함한 여러 다른 화학 [3]용액의 첨가 및 배양과 관련이 있습니다.유기 추출은 값이 싸고 많은 양의 순수 DNA를 생산하기 때문에 실험실에서 종종 사용된다.간단하지만 여러 단계가 얽혀 있어 다른 방법보다 시간이 오래 걸립니다.또한 독성 화학 물질인 페놀과 클로로포름의 사용이 불리하며, 여러 [4]튜브 간의 DNA 이동으로 인한 오염 위험이 높아집니다.DNA의 유기적 추출에 기초한 몇 가지 프로토콜이 수십 [5]년 전에 효과적으로 개발되었지만, 이러한 프로토콜의 보다 실용적인 버전도 지난 [6]몇 년 동안 개발되고 출판되었습니다.

Chelex 추출법은 시료에 Chelex 수지를 첨가하여 용액을 끓인 후 vortex 및 원심분리하는 방법입니다.세포 물질은 첼렉스 비즈에 결합하고 DNA는 [4]상등액에서 사용할 수 있습니다.첼렉스 방식은 유기 추출법보다 훨씬 빠르고 간단하며 튜브 하나만 있으면 돼 DNA 오염 위험을 줄일 수 있다.안타깝게도 Chelex 추출은 많은 양을 산출하지 못하고 산출된 DNA는 단일 가닥이므로 PCR 기반 분석에만 사용할 수 있으며 [4]RFLP에는 사용할 수 없습니다.

스핀칼럼계 추출법을 이용하는 등의 고체상 추출은 DNA가 실리카에 결합하는 것을 이용한다.DNA를 포함한 샘플은 실리카 겔 또는 실리카 비즈와 카오트로픽 소금을 포함하는 컬럼에 추가됩니다.카오트로픽 소금은 핵산을 소수성으로 함으로써 가닥 사이의 수소 결합을 파괴하고 DNA와 실리카의 결합을 촉진한다.이렇게 하면 인산염 잔류물이 노출되어 [7]흡착에 사용할 수 있습니다.DNA는 실리카에 결합하고, 용액의 나머지 부분은 에탄올을 사용하여 씻어내어 향정신성염과 다른 불필요한 [3]성분을 제거합니다.그리고 나서 DNA는 구슬에서 DNA가 용출될 수 있도록 저염수 수용액으로 재수화 될 수 있다.

이 방법은 PCR 및 RFLP 분석에 모두 사용할 수 있는 고품질의 이중 가닥 DNA를 생성합니다.이 절차는 페놀클로로포름 방법보다 낮지만 자동화할[4] 수 있고 높은 throughput을 가지고 있습니다.이 방법은 한 번의 작업으로 전체 절차가 하나의 튜브에서 완료됩니다.이것은 DNA의 법의학적 추출에 매우 유용하게 만드는 오염의 위험을 낮춥니다.여러 개의 고상 추출 상용 키트가 서로 다른 회사에서 제조 및 판매되고 있습니다. 단, 문제는 유기 추출이나 CHElex 추출보다 가격이 비싸다는 것입니다.

특별한 종류

일부 샘플에서 DNA를 분리하기 위해 특정 기술을 선택해야 합니다.복잡한 DNA 분리를 가진 일반적인 샘플은 다음과 같습니다.

  • 부분적으로 분해된 DNA를 포함한 고고학적 샘플, 고대 DNA[8] 참조
  • 토양, 인디고 및 기타 직물 염료 또는 혈액 내 헤모글로빈과 같은 PCR의 억제제를 포함한 샘플
  • 두꺼운 세포벽을 가진 미생물 샘플, 예를 들어 효모
  • 여러 출처의 혼합 DNA를 포함한 샘플

염색체외 DNA는 일반적으로 분리하기 쉬우며, 특히 플라스미드는 세포 용해에 이어 단백질의 침전에 의해 쉽게 분리될 수 있으며, 이는 염색체 DNA를 불용성 분획에 가두어 원심분리 후 플라스미드 DNA를 가용성 분획에서 정제할 수 있다.

Hirt DNA 추출은 포유동물 세포에서 모든 염색체외 DNA를 분리하는 것이다.Hirt 추출 과정은 고분자 핵 DNA를 제거하고 세포에 존재하는 저분자 미토콘드리아 DNA와 바이러스 에피솜만 남습니다.

DNA의 검출

주요 기사:핵산의 정량화

디페닐아민(DPA) 표시기가 DNA의 존재를 확인합니다.이 절차는 DNA의 화학적 가수분해를 포함한다: 산에서 가열될 때(예: 95°C 이상), 반응은 디옥시리보스 당을 필요로 하므로 DNA에 특이적이다.이러한 조건 하에서 2-디옥시리보스는 w-히드록시일불리닐알데히드로 변환되어 디페닐아민과 반응하여 파란색 화합물을 생성한다.DNA 농도는 분광광도계를 사용하여 600nm에서 용액의 흡광도를 측정하고 알려진 DNA 농도의 표준 곡선과 비교할 수 있다.

DNA 순도 측정으로는 파장 260nm, 280nm에서 DNA 용액의 흡광도를 측정한다.DNA는 제한효소로 DNA를 절단하고, 아가로스겔 위에서 실행하고, 브롬화 에티듐(EtBr) 또는 다른 염색체로 염색하고, DNA의 강도를 알려진 농도의 DNA 마커와 비교함으로써 정량화할 수 있다.

Southern Blot 기술을 사용하여 이 정량화된 DNA를 분리하여 PCR 및 RFLP 분석을 사용하여 추가로 검사할 수 있습니다.이러한 절차를 통해 게놈 내에서 반복되는 염기서열을 구별할 수 있습니다.그것은 법의학자들이 비교, 확인, 분석을 위해 사용하는 기술이다.

High-molecular-weight DNA추출 법

이 방법에서 식물핵은 조직을 물리적으로 분쇄하고 온전한 핵을 고유한 핵분리완충제(NIB)로 재구성함으로써 분리된다.플라스티드 DNA는 유기체에서 방출되며 세척 및 원심분리에 의해 삼투압 완충액으로 제거된다.정제된 핵은 유기 추출에 의해 용해되고 더욱 세척되며, 고농도의 CTAB로 게놈 DNA가 침전된다.고순도 고분자량 gDNA는 핵에서 추출되어 높은 pH 버퍼에 용해되어 안정적인 장기 [9]저장을 가능하게 합니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

  1. ^ Dahm R (January 2008). "Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research". Human Genetics. 122 (6): 565–81. doi:10.1007/s00439-007-0433-0. PMID 17901982. S2CID 915930.
  2. ^ Yoshikawa H, Dogruman-Al F, Dogruman-Ai F, Turk S, Kustimur S, Balaban N, Sultan N (October 2011). "Evaluation of DNA extraction kits for molecular diagnosis of human Blastocystis subtypes from fecal samples". Parasitology Research. 109 (4): 1045–50. doi:10.1007/s00436-011-2342-3. PMID 21499752. S2CID 37191780.
  3. ^ a b c Elkins KM (2013). "DNA Extraction". Forensic DNA Biology. pp. 39–52. doi:10.1016/B978-0-12-394585-3.00004-3. ISBN 9780123945853.
  4. ^ a b c d Butler JM (2005). Forensic DNA typing : biology, technology, and genetics of STR markers (2nd ed.). Amsterdam: Elsevier Academic Press. ISBN 9780080470610. OCLC 123448124.
  5. ^ Marmur, J. (1961). "A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms". Journal of Molecular Biology. 3 (2): 208–IN1. doi:10.1016/S0022-2836(61)80047-8.
  6. ^ Salvà-Serra F, Svensson-Stadler L, Busquets A, Jaén-Luchoro D, Karlsson R, Moore ER, Gomila M (2018). "A protocol for extraction and purification of high-quality and quantity bacterial DNA applicable for genome sequencing: A modified version of the Marmur procedure". Protocol Exchange. doi:10.1038/protex.2018.084.
  7. ^ Li, Richard (11 March 2015). Forensic biology (2nd ed.). Boca Raton. ISBN 978-1439889725. OCLC 907517669.
  8. ^ Pääbo S (March 1989). "Ancient DNA: extraction, characterization, molecular cloning, and enzymatic amplification". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (6): 1939–43. Bibcode:1989PNAS...86.1939P. doi:10.1073/pnas.86.6.1939. PMC 286820. PMID 2928314.
  9. ^ Li는 우주, 패리스 신부, 스티븐, Saski, 크리스토퍼 A(2020년)." 간단한 식물high-molecular-weight DNA추출 법single-molecule 기술에 적합한".식물 사용합니다.16:38.doi:10.1186/s13007-020-00579-4.ISSN 1746-4811.PMC 7071634.PMID 32190102.텍스트는 창조적 공용 귀인 4.0국제 라이센스 하에 가능하다 이 원본에서 복사되었다.

추가 정보

  • 샘브룩, 마이클 R.녹색, 조셉.분자 클로닝 (제4판)콜드 스프링 하버, 뉴욕주: 콜드 스프링 하버 연구소 박사ISBN 1936113422.
  • 법의학, 리처드 리, (2015) 보카 라톤: CRC 프레스, 테일러 & 프란시스 그룹.ISBN 9781439889701

외부 링크