플라스미드 조제

Plasmid preparation
플라스미드 미니프렙 0.8% 아가로오스 겔레티듐 브로마이드 얼룩

플라스미드 제제는 플라스미드 DNA를 위한 DNA 추출과 정화의 방법이다.많은 방법들이 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 정화하기 위해 개발되었다.이러한 방법에는 반드시 다음과 같은 세 가지 단계가 포함된다.[1]

  • 박테리아 배양균의 성장
  • 박테리아 채취 및 용해
  • 플라스미드 DNA 정화

박테리아 배양균의 성장

플라스미드는 거의 항상 액체 박테리아 배양액에서 정화되는데, 보통 대장균은 변형되어 격리되어 있다.일반적으로 사용되는 사실상 모든 플라스미드 벡터는 하나 이상의 항생제 내성 유전자를 선택 가능한 표식기(예: 유전자 부호화 앰피실린 또는 카나마이신 저항성)로 암호화하여 성공적으로 변형된 박테리아가 억제되지 않고 증식할 수 있게 한다.플라스미드 벡터를 차지하지 않은 박테리아는 저항 유전자가 부족한 것으로 추정되며, 따라서 성공적인 변형을 나타내는 군집만이 성장할 것으로 예상된다.박테리아는 좋은 환경에서 자란다.null

박테리아 채취 및 용해

알칼리성 조건(pH 12.0–12.5)에서 박테리아가 리싱될 때 염색체 DNA와 단백질 모두 변성되지만 플라스미드 DNA는 안정적이다.일부 과학자들은 ssDNA 발생을 줄이기 위해 사용된 NaOH 농도를 0.1M으로 줄인다.아세테이트 함유 중화 완충제를 추가한 후 크고 덜 코팅된 염색체 DNA와 단백질이 침전되지만 작은 박테리아 DNA 플라스미드는 용액에 머무른다.null

크기별 준비

키트는 세균 배양 크기와 그에 상응하는 플라스미드 수확량으로 명명된 플라스미드 DNA를 정화하기 위해 다양한 제조사로부터 제공된다.순서가 증가함에 따라, 이것들은 미니프렙, 미디프렙, maxiprep, 메가프렙, 기가프렙이다.플라스미드 DNA 산출량은 플라스미드 복사 번호, 종류와 크기, 박테리아 변형률, 성장 조건, 키트에 따라 달라질 것이다.null

미니프레파레이션

플라스미드 DNA의 미니프레파레이션은 플라스미드 DNA를 박테리아로부터 빠르고 작은 규모로 분리하는 것이다.알칼리성 용해법에 근거한다.미니프렙을 수행함으로써 추출된 플라스미드 DNA를 종종 "미니프렙"이라고 부른다.미니프렙은 분자복제 과정에서 박테리아 클론을 분석하는 데 사용된다.미니프렙의 전형적인 플라스미드 DNA 수율은 세포 변종에 따라 5 ~ 50 µg이다.다량의 플라스미드의 미니프립은 셀을 라이스로 거르고 플라스미드를 여과지에 용해시켜 여과지에서도 편리하게 할 수 있다.null

중간 분석

시작 대장균 배양량은 리소게니 육수(LB) 15~25mL이며 예상 DNA 산출량은 100~350µg이다.null

맥시프레파레이션

시작 대장균 배양량은 LB 100~200mL이고 예상 DNA 산출량은 500~850µg이다.null

메가프레파레이션

시작 대장균 배양량은 LB 500 mL – 2.5 L이며 예상 DNA 산출량은 1.5-2.5 mg이다.null

기가프레파레이션

시작 대장균 배양량은 LB 2.5~5L이고 예상 DNA 산출량은 7.5~10mg이다.null

플라스미드 DNA 정화

핵산 정화에는 여러 가지 방법이 존재한다.모두 핵산만 침전하거나 다른 생체분자만 침전하여 핵산이 분리될 수 있는 조건을 발생시키는 원리에 따라 작용한다.null

에탄올 침전

에탄올 침전은 에탄올을 DNA의 방산물로 사용하여 용액에서 침전시키는 작용을 한다.수용성 분수는 다른 생체 분자를 제거하기 위해 버려진다.null

스핀 컬럼

스핀 칼럼 기반의 핵산 정화는 핵산을 침전시켜 고체 매트릭스를 결합시키고 다른 성분들이 흘러 들어간다.그런 다음 정제된 핵산을 용출하기 위해 조건을 바꾼다.null

페놀-클로로폼 추출

페놀-클로로폼 추출에서 페놀/클로로폼 혼합물을 첨가하면 단백질과 지질 오염물질이 용해되어 핵산이 수성 단계로 남게 된다.그것은 또한 DNase와 같은 단백질을 변성시키기도 하는데, 이것은 특히 플라스미드가 효소 소화에 이용될 경우에 중요하다.그렇지 않으면, 얼룩은 플라스미드 DNA의 효소 제한 형태에서 발생할 수 있다.

참조

  1. ^ Bouchard, Roland; et al. (2010). Laboratory Methods in Microbiology. Universal Scientific. pp. 119–126.

추가 읽기

외부 링크