붐법
Boom method붐법(일명 붐핵산추출법)은 생체시료에서 핵산을 분리하는 고상추출법이다.이 방법은 "핵산(NA)을 실리카 비즈에 흡수"하는 것이 특징이다.
개요
붐법(Boom nuclear acid 추출법)[1][2][3][4][5][6][7][8]은 생체시료에서 핵산(NA)[note 1][9]을 분리하기 위한 고상추출법이다.이 방법의 핵심은 효과에 따라 카오트로픽 물질의 존재 하에서 NA를 결합할 수 있는 실리카 비즈의 사용이다.이 방법은 생물학적 샘플에서 핵산을 분리하는 가장 광범위한[6][7] 방법 중 하나이며 생물학적 샘플에서 NA를 소량 정제하는 간단하고 빠르고 신뢰할[2] 수 있는 방법으로 알려져 있습니다.
이 방법은 Willem R에 의해 개발되고 발명되었다고 한다. 1990년경 [note 2]붐 등그러나 앞서 언급한 카오트로픽 효과 자체는 BOOM 방법이 개발되기 전에 이미 알려져 있고 Vogelstein과 Gillespie에[10][note 3] 의해 이미 보고되었다.따라서 Boom 등의 기여는 체액 및 기타 생물학적 시작 재료와 같은 복잡한 시작 [1]재료에 대한 방법의 최적화일 수 있으며 Boom 등의 간단한 절차를 제공한다.US5234809.[1]Boom [1]등이 제출된 후, 다른 당사자들도 유사한[11][12][13] 출원을 하였다.
좁은 의미에서, "실리카"라는 단어는 SiO 결정을2 의미하지만, 다른 형태의 실리카 입자를 사용할 수 있습니다.핵산결합고상재료로는 특히 비정질산화규소 및 유리분말, 알킬실리카, 규산알루미늄(제올라이트) 또는 활성실리카가2 적합하다.오늘날에는 '자성구슬(실리카구슬은 자성구슬)'을 이용한 붐법이 널리 사용되고 있다.이와 같이 타지마 피펫,[14][15][16] 픽펜(R),[3][4] 쿼드폴 컬렉터 등의 [17]자성 비즈 컬렉터에 의해 실리카 비즈를 포획한다.
간단한 절차
Boom법의 시작 물질에서 핵산을 분리하는 과정은 기본적으로 다음 4단계로[1][2][3][4] 구성된다(그림 1 참조).
(a) 시작 재료의 용해 및/또는 균질화.
단백질 분해 효소의 존재 하에서 예를 들어 세제로 시작 물질의 리세이트를 얻는다.
(b) 시작 재료에 카오트로픽 물질과 실리카 비즈를 혼합한다.
NA를 실리카 비즈에 결합하는 카오트로픽 물질인 스타팅 재료와 (a)의 스타팅 재료의 용해액을 충분히 다량의 카오트로픽 물질과 혼합한다.카오트로픽 효과에 따라 방출 NA는 거의 즉각적으로 실리카 비즈에 결합된다.이와 같이 실리카-핵산 복합체를 형성한다.NA와 실리카가 결합을 형성하는 이유는 다음 절(기본 원칙)에서 설명해야 한다.
다. 실리카 비즈 세척
이 공정에서는 (b)의 실리카 비즈를 여러 번 세척하여 오염물질을 제거한다.실리카-핵산 복합체(실리카 비즈)의 세척 과정은 일반적으로 다음과 같은 단계로 구성된다.
- 예를 들어 Tajima pipet(그림 1,2 참조) 또는 펠릿다운(급침전(농축) 및 상등액 폐기(예: 흡착)에 의한 액체로부터의 실리카 비즈 채취
- 예를 들어 보텍스 믹서를 사용하여 실리카 비즈를 카오트로픽 소금 함유 세척 완충제로 재분산한다.
- 위에 언급된 세척 완충제에서 다시 분산된 실리카 비즈를 수거합니다.
- 알코올 수용액과[note 4] 아세톤을 사용하여 연속적으로 세척한다.
- 비즈는 건조하는 것이 좋다.
(d) 결합핵산의 분리
실리카 비즈에서 결합된 핵산을 분리합니다.순수 NA는 카오트로픽 물질의 농도를 낮추어 완충제로 용출된다.세척된(및 바람직하게는 건조된) 실리카-핵산 복합체에 제시되는 NA는 TE 버퍼, 아쿠아 비데스트, ... 등의 용출 완충액에 용출된다.용출 버퍼의 선택은 격리된 NA의 고려된 사용에 따라 결정됩니다.
이와 같이 순수 NA는 출발 물질에서 분리된다.
실험 조건의 변경, 특히 시약(카오트로픽 물질, 세척 완충제 등)의 조성을 변경함으로써 보다 구체적인 분리를 실현할 수 있다.예를 들어, 일부 시약 조성물은 긴 ds DNA를 얻는 데 적합하고, 일부 시약 조성물은 짧은 ss RNA에 적합한 등입니다.
시작물질은 예를 들어 전혈, 혈청, 버피코트, 소변, 대변, 뇌척수액, 정자, 타액, 조직, 세포배양물, 식품, 백신 등 다양한 시작생물물질을 이용할 수 있다.
시작 물질에 따른 시술의 원인 최적화에는 원하는 핵산 종(DNA/RNA, 선형/원형, ds/ss, long/short)이 필요하다.
현재는 실리카 코팅 마그네틱 비즈를 사용한 검사가 가장 일반적인 것 같습니다.따라서 본 문서에서 "실리카 비즈"는 달리 명시되지 않은 한 실리카 코팅된 마그네틱 비즈를 의미합니다.
자기 비즈
실리카 코팅[18][19][20] 비즈는 다양한 자성 입자(자기 캐리어)를 실리카로 코팅하는 경우가 많습니다.마그헤미트 입자(δ-FeO23) 및 마그네타이트 입자(FeO34) 및 그 중간 산화철 입자가 자성담체로서 가장 적합하다.
일반적으로 마그네틱 비즈의 품질은 다음과 같은 [18][21]파라미터로 특징지어집니다.
- 포화 자화(~10-80 A m2/kg (emu/g):초파라매틱)[18]
- 보자기력(~ 0.80~15.92kA/m),[18]
- 크기 직경(~ 0.1~0.5μm),[18]
- 각 입자의 질량(~ 2.7 ng),[18][note 5]
- 수집의 용이성(나중에 [18]언급),
- 캡처 기능(나중에 [18]언급),
- 침강 속도(30분 [21]동안 약 4%),
- 면적비(> 1002 m/g),
- 유효밀도(~ 2.5g/cm3)
- 입자 수(~ 1 x 108 입자/mg).[21]
여기서 "수집 용이성"은 다음과 같이 정의되고 비교됩니다.
자성구슬은 생체물질을 포함한 수용액 WmL(~1mL) 중 적어도 Zmg(~20mg)의 양으로 분산되었을 때 Y가우스(~3000gauss)의 자기장이 존재하는 상태에서 T초(~3초) 이내에 Xwt%(~90wt%) 이상 채취된다.
캡처 능력은 다음과 같이 정의 및 비교됩니다.
생체물질을 포함한 시료의 수용액 WmL(~1mL) 중 적어도 Zmg(~20mg)의 양이 분산되었을 때 Bmg(~1mg)당 최소 Aμg(~0.4μg)의 생체물질과 결합한다.
기본 원칙
이 방법의[1][2][3][4][14] 원리는 이 카오트로픽 작용에 따른 카오트로픽 작용의 존재 하에서 실리카 입자 또는 규소의 핵산 결합 특성에 기초한다.
간단히 말해서, 카오트로픽 효과는 수용액 중의 카오트로픽 음이온이 물의 구조를 교란시키고 소수성 상호작용을 [22][23]약화시키는 것이다.
넓은 의미에서 '카오트로픽제'는 단백질 및 핵산의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변경할 수 있지만 적어도 1차 구조를 [24]그대로 유지할 수 있는 물질을 의미한다.
카오트로픽 소금 수용액은 카오트로픽제이다.카오트로픽 음이온은 수소 결합, 반데르발스 힘, 소수성 효과와 같은 비공유력에 의해 매개되는 분자간 상호작용을 방해함으로써 시스템의 엔트로피를 증가시킨다.예를 들어 티오시안산 이온, 요오드 이온, 과염소산 이온, 질산 이온, 브롬 이온, 염소 이온, 아세트산 이온, 불소 이온, 황산 이온의 수용액 또는 이들 수용액과 이들의 조합이다.본 발명의 Boom법에 따르면 이용되는 카오트로픽 구아니듐염은 바람직하게는 구아니듐 티오시안산염(GuSCN)이다.
카오트로픽 효과에 따르면 카오트로픽제의 존재 하에서 NA 골격의 인산기의 포스포디에스테르 결합에서 NA의 수화수를 얻는다.이것에 의해, 인산기가 「노출」되어 실리카와 노광 인산기와의 소수성 상호작용이 형성된다.
자동화 기기
타지마 피펫
Tajima pipet에[14][15] 기초한 핵산 추출 장치(그림 2 참조)는 Boom법을 [25]수행하는 가장 널리 보급된 기구 중 하나이다.
타지마 피펫은 일본의 정밀계측기 제조업체인 Precision System Sciences(PSS)[25]의 창업자이자 사장 타지마 [14]히데지에 의해 발명되었다.Tajima pipet은 PSS Inc.[25]의 핵심 기술입니다. PSS Inc.는 Hoffmann-La Roche, Life Technologies 등 여러 주요 시약 제조업체에 이 기술을 기반으로 한 OEM 제품(예를 들어 MagNA Pure(R))을 제공합니다.타지마 등이 [14]출원된 후, 다른 당사자에서도 같은[16] 출원이 이루어지고 있다.
Tajima pipet은 자력에 의해 대상 물질과 결합된 자분을 액체에서 분리하여 액체 속에 부유시킬 수 있는 자분 제어 방법 및 절차를 수행한다.
구성
피펫 자체는 다음과 같은 부재로 구성된 장치이다(그림 [14]2 참조).
- 피펫 팁은 각각의 용기에서 액체에 접근하여 흡입/흡입할 수 있도록 구성되며, 다음을 가진다.
- 프론트 엔드 부분
- 저수지 부분,
- 액체 통로
- 프론트 엔드부와 탱크부를 연결한다.
- 분리 지역
- 자기장의 작용을 받는 액체 통로 내에서
- 기계 장치
- 피펫 부분 내부에 음압 또는 양압을 가하여 자성 물질 부유액을 피펫 부분 또는 피펫 부분으로부터 끌어당기거나 배출하기 위한
- 자기장 소스
- 피펫 팁의 외부 및 인접 배치
- 자기장 전원 구동 장치
- 자기장 소스를 구동하여 액체 통로 외부에서 분리 영역에 자기장을 적용하거나 분리 영역에서 자기장을 제거합니다.자석을 피펫 팁에 가까이 가져가면 자기장이 작용하고, 피펫 팁에서 벗어나면 자기장이 제거됩니다.
Tajima pipet을 포함하는 핵산 추출 장치는 일반적으로 [14]다음과 같이 구성됩니다.
- 상기 타지마 피펫,
- 여러 개의 튜브
- 상기 튜브를 위한 복수의 튜브 홀더,
- 수송 평균
- Tajima pipette를 여러 개의 튜브(튜브는 튜브 홀더에 의해 지지됨) 사이에서 운반한다.
- 제어 장치
- 상기의 디바이스를 제어하기 위해서.
동작
(a) 자성 비즈 포획
이 흡인공정에서 피펫선단 외측에 배치된 자석에 의해 피펫선단 외측에서 피펫선단 분리영역에 자계를 인가하면 자성비드를 포함한 액체가 피펫선단 분리영역을 통과함에 따라 자성입자가 내측 w에 흡인되어 구속된다.피펫 팁의 모든 타일 분리 영역.
그 후 자계를 유지한 상태에서 그 용액을 토출하면 피펫 선단 내부에 자분만 남는다.이런 식으로 자분들은 액체로부터 분리된다.
타지마에 [14]따라 혼합액의 바람직한 흡입 높이는 다음과 같다.
- 액체 바닥이 액체 통로 분리 영역의 하단보다 높다(즉, 액체 바닥이 자석의 하단보다 높다).
- 모든 혼합액이 생성되면
- 흡인된 자분자를 완전히 고정할 수 있도록 한다.
이 때 자분자는 젖어 있기 때문에 피펫 선단의 액로 분리영역 내면에 부착되어 있다.피펫 팁 P를 이동 또는 이송하면 자분이 잘 떨어지지 않는다.
(b) 포획된 자성 비드의 재부착
상기 방법으로 자분을 구속한 후(a),
- 따라서 자성 입자를 제거한 혼합 액체는 액체 수용부(용기)로 배출되고 피펫 선단에는 자성 입자만 남게 됩니다.
재증강 과정을 할 수 있어요
포착된 마그네틱 비드의 재서스펜션은 다음 단계로 구성됩니다.물론, 우리는 상기 방법으로 자성 물질이 포착된 상태를 고려한다.
- 세척 완충제 등의 액체를 팁에 흡인
- 자기장 적용을 종료합니다.
- "자기장 적용을 중지합니다"에 의해 자분들은 액체 속에 부유됩니다.
- 액체(세척 버퍼 등)를 피펫 선단에서 용기로 배출한다(자석 본체에 의해 발생하는 자력이 차단된 상태).
운영
Tajima pipet을 내장한 핵산 추출 장치의 작동 예는 그림 1과 같다.
기타 방법
자분포집장치의 다른 종류의 방법의 예는 다음과 같다.
「 」를 참조해 주세요.
메모들
- ^ 본 문서에서 핵산(NA)은 DNA와 RNA를 모두 의미하며, 가능한 모든 구성(이중 가닥(ds)/단일 가닥(ss)/이들의 조합으로서 긴/짧은 것, 원형/라이너 등)을 의미한다.
- ^ Boom 등의 우선일로부터 추정.US5234809 [1], EP0389063 [2] 및 그 패밀리 특허.
- ^ Boom, et al.에 다음과 같은 기사가 인용되었다.US5234809 [3], EP0389063 [4] 및 그 패밀리 특허.
- ^ Boom의 원래 방법에 따르면 수율 손실을 제한하기 위해 가장 바람직한 것은 약 70% 에탄올이다.
- ^ 추정을 위한 순서 추정 절차는 다음과 같습니다.
- 각 입자의 반지름(r)은 약
- 0. .5 6 1 0.× m{ =0.5 10
- 따라서 각 입자(V)의 부피는 약 5.2*10cm이다−133.
- × 3 r 3 r r r 3 { { V \ { {} \ r^ { frac {} { } { r } { 3 } 。
- 이 마그네틱 입자가 FeO라고34 가정했을 때 밀도(D) 5.17g3/cm입니다.
- 따라서 각 입자의 무게(w)는 약
- w = VD = 2.7pg
레퍼런스
- ^ a b c d e f 붐 등;US5234809 [6], EP0389063 [7] 및 그 패밀리 특허.
- ^ a b c d R Boom, C J Sol, M M Salimans, C L Jansen, P M Wertheim-van Dillen 및 J van der Noorda;핵산 정제 빠르고 간단한 방법."J. Clin.미생물1990년 3월 제28권 제3호 495-503 [8]
- ^ a b c d e Matti Korpela; US6468810
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본 특허의 기기와 방법은 주로 면역체계를 대상으로 한다.단, 핵산 추출 분석의 대체 실시형태도 본 특허에 기재되어 있으며, 그림 1의 절차는 일반적으로 Boom 방법과 유사하다. - ^ a b 타지마 히데지US6509193 [16]
본 특허의 기기와 방법은 주로 면역체계를 대상으로 한다.단, 핵산 추출 분석의 대체 실시형태도 본 특허에 기재되어 있으며, 그림 1의 절차는 일반적으로 Boom 방법과 유사하다. - ^ a b "Device and method for the separation of magnetic microparticles".
- ^ a b "Apparatus and methods for magnetic separation featuring external magnetic means".
- ^ a b c d e f g h "Magnetic carrier for biological substance, production method thereof and isolation method of biological substance using same".
- ^ "Nucleic acid-bondable magnetic carrier and method for isolating nucleic acid using the same".
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