산성 구아니디늄 티오시아나이트-페놀-클로로폼 추출물
Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
산성 구아니듐 티오시아네이트-페놀-클로로폼 추출(약칭 AGPC)은 생화학에서 액체-액체 추출 기법이다.분자생물학에서 RNA(일부 경우에는 DNA와 단백질뿐만 아니라)를 분리하기 위해 널리 사용된다.이 방법은 실리카 기반 정화 같은 기둥 기반 시스템보다 오래 걸릴 수 있지만, RNA의 순도가 높고 RNA의 회수율이 높다는 장점:[1] RNA 기둥은 일반적으로 siRNA, miRNA, gRNA, tRNA와 같은 짧은 (<200 뉴클레오티드) RNA종의 정화에 적합하지 않다.
원래는 피오트르 촘친스키와 니코레타 사치가 1987년 의정서를 출간하면서 고안한 것이다.[2][3]시약은 Sigma-Aldrich가 TRI 시약이라는 이름으로, 인비트로겐이 TRIzol이라는 이름으로, 바이오린이 트리수레로, Tel-Test가 STAT-60으로 판매한다.
작동 방식
이 방법은 수용성 시료와 수포화 페놀과 클로로포름을 함유한 용액의 혼합물을 원심분리하여 상극분리에 의존하여 상극수상 및 하극상(주로 페놀)이 발생한다.티오시아네이트(Guanidinium tiocyanate)는 유기 단계에 첨가되어 단백질의 변성을 돕는다(핵산을 강하게 결합하는 것 또는 RNA를 저하시키는 것 등).핵산(RNA 및/또는 DNA) 분할은 수용상, 단백질 분할은 유기상이다.혼합물의 pH는 어떤 핵산이 정제되는지를 결정한다.[4]산성 조건(pH 4-6)에서는 RNA가 수성 단계에 머무르는 동안 DNA 분할이 유기 단계로 들어간다.중립 조건(pH 7-8)에서는 DNA와 RNA 파티션이 모두 수용 단계로 들어간다.마지막 단계에서 핵산은 2-프로판올로 강수에 의해 수용 단계로부터 회수된다.그런 다음 2-프로판올을 에탄올과 펠릿을 잠깐 공기 건조시켜 TE 버퍼 또는 RNAse 자유수에 용해시킨다.
구아니디늄 티오시아네이트는 RNAS를 포함한 단백질을 변성시켜 리보솜 단백질과 rRNA를 분리하는 반면 페놀, 이소프로판올, 물은 용해성이 떨어지는 용제다.클로로포름 또는 BCP(브로모클로프로판)가 존재하는 경우, 이러한 용제는 색상으로 인식되는 2상, 즉 맑고 상층 수액상(핵산을 포함하는 것)과 하상(페놀에 용해된 단백질과 클로로포름에 용해된 지질 포함)으로 완전히 분리된다.2-메르카프토에탄올과 사르코신과 같은 변성 화학물질도 사용될 수 있다.주된 단점은 페놀과 클로로포름은 둘 다 위험하고 불편한 물질이며, 추출은 종종 고된 일이 많기 때문에 최근 몇 년 동안 많은 회사들이 RNA를 분리하는 대안적인 방법을 제공하고 있다는 것이다.
시약
- 페놀: 생화학에 사용되는 페놀은 트리스 완충제를 사용한 수포화 용액, 트리스 부피 페놀 50%, 클로로포름 50%, 트리스 부피 50%, 클로로포름 48%, 이소아밀 알코올 용액 2%("25:24:1"이라고도 한다)로 나온다.페놀은 자연적으로 다소 수용성이 있으며, 클로로포름의 존재에 의해 날카로워지는 퍼지 인터페이스를 제공하며, 이소아밀 알코올은 거품을 감소시킨다.산화 페놀은 핵산을 손상시키기 때문에 대부분의 용액에도 항산화제가 있다.RNA 정화를 위해 pH는 약 4로 유지되며, RNA는 수용상 우선으로 유지된다.DNA 정화의 경우 pH는 보통 7에 가깝고, 이때 모든 핵산이 수용 단계에서 발견된다.
- 클로로포름:클로로포름은 소량의 아밀렌이나 에탄올과 함께 안정되는데, 순수한 클로로포름을 산소와 자외선에 노출시키면 포스겐 가스가 생성되기 때문이다.일부 클로로포름 용액은 96%의 클로로포름, 4%의 이소아밀 알코올 혼합물을 미리 제조하여 25:24:1 용액을 얻을 수 있다.
- Isoamyl 알코올:Isoamyl 알코올은 거품을 감소시키고 RNAS의 비활성화를 보장할 수 있다.
참고 항목
참조
- ^ Morrison; et al. (2003). "Comparison of AGPC with column-based nucleic acid purification". Journal of Biomolecular Technology. 21 (17): 411–432.
- ^ Chomczynski, P.; Sacchi, N. (1987). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction". Anal. Biochem. 162 (1): 156–159. doi:10.1016/0003-2697(87)90021-2. PMID 2440339.
- ^ Chomczynski, P.; Sacchi, N. (2006). "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty-something years on". Nature Protocols. 1 (2): 581–585. doi:10.1038/nprot.2006.83. PMID 17406285. S2CID 28653075.
- ^ Perry RP, La Torre J, Kelley DE, Greenberg JR. (1972) 폴리보솜에서 메신저 RNA를 추출하는 동안 폴리(A) 시퀀스의 실행성에 대하여.바이오침.바이오피스.Acta 262: 220–226; Brawerman G, Mendecki J, Lee SY. (1972) 포유류 메신저 리보핵산을 격리하는 절차.생화학 11: 637–641.
