어피니티 크로마토그래피

Affinity chromatography

어피니티 크로마토그래피는 생체분자와 다른 물질 사이의 매우 특이적인 고분자 결합 상호작용에 기초하여 혼합물에서 생체분자를 분리하는 방법이다.결합 상호작용의 구체적인 유형은 관심 생체 분자에 따라 달라진다; 항원과 항체, 효소와 기질, 수용체와 배위자, 또는 단백질과 핵산[1] 결합 상호작용은 다양한 생체 분자의 분리를 위해 자주 이용된다.친화성 크로마토그래피는 다른 크로마토그래피 방법에 비해 높은 선택성과 [2][3]분리의 분해능으로 유용하다.

원칙

친화성 크로마토그래피는 관심 분석물(일반적으로 이동상에 용해됨)과 결합 파트너 또는 배위자(정지상 불활성화됨) 사이의 특정 결합 상호작용을 가지고 있다.전형적인 친화성 크로마토그래피 실험에서, 배위자는 화학적으로 수정되어 리간드가 반응할 수 있는 반응성 관능기를 도입하여 안정적인 [4][page needed]공유 결합을 형성하도록 고체, 불용성 매트릭스(일반적으로 아가로스 또는 폴리아크릴아미드와 같은 중합체)에 부착됩니다.정지 위상은 먼저 이동 위상이 도입되는 컬럼에 로드됩니다.배위자에 결합하는 분자는 정지상과 연관성을 유지할 것이다.그리고 나서 관심 있는 생체분자가 결합되어 있는 동안 비표적 생체분자를 정지상과의 약한 상호작용을 방해함으로써 제거하기 위해 워시 버퍼를 적용한다.표적 생체 분자는 결합된 표적 생체 분자와 배위자 사이의 상호작용을 방해하는 소위 용출 완충제를 적용함으로써 제거될 수 있다.따라서 목표 분자는 용출액에서 [5][page needed]회수된다.

친화성 크로마토그래피는 해당 분석물질의 분자량, 전하, 소수성 또는 기타 물리적 특성을 알 필요가 없지만, 그 결합 특성에 대한 지식은 분리 [5]프로토콜 설계에 유용하다.친화성 크로마토그래피 시술에서 일반적으로 이용되는 결합 상호작용의 유형은 아래 표에 요약되어 있다.

친화성[6] 크로마토그래피에서 사용되는 일반적인 생물학적 상호작용
시니어 노 배위자의 종류 표적 분자
1 기판 아날로그 효소
2 항체 항원
3 렉틴 다당류
4 핵산 상보적 염기서열
5 호르몬 리셉터
6 아비딘 비오틴/비오틴 결합 분자
7 칼모듈린 칼모듈린결합파트너
8 글루타치온 GST융합단백질
9 단백질 A와 G 면역글로불린
10 금속 이온 폴리히스티딘융합단백질

배치 및 열 설정

친화 컬럼 크로마토그래피의 원리
배치 크로마토그래피

고상과의 결합은 고형매체를 기둥에 충전하고 초기혼합물을 컬럼에 통과시켜 침하를 가능하게 하고, 컬럼을 통과시켜 워시버퍼와 그 컬럼에 이어서 도포하여 포집하는 컬럼크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다.이러한 단계는 일반적으로 주변 압력에서 수행됩니다.또, 예를 들면, 용기내의 고상에 초기 혼합물을 첨가해, 고상을 혼합, 분리, 액상의 제거, 세척, 재원심화, 용출 버퍼의 추가, 재원심화, 용출물의 제거에 의해서, 일괄 처리를 실시하는 것으로도 좋다.

때로는 배치법으로 결합하는 하이브리드법을 사용하기도 하지만 목표분자가 결합된 고체상을 기둥에 충전하여 기둥에 세척 및 용출한다.

친화성 크로마토그래피에서 사용되는 배위자는 유기 및 무기 공급원 모두에서 얻을 수 있습니다.생물학적 소스의 예로는 혈청 단백질, 렉틴, 항체가 있다.무기 공급원은 모로니산, 금속 킬레이트 및 트리아진 [7]염료이다.

세 번째 방법인 확장 바닥 흡수법도 개발되었으며, 이는 위에서 언급한 두 가지 방법의 장점을 결합한 것이다.고체상 입자는 바닥에서 액상을 펌핑하여 상부에서 배출하는 기둥에 배치됩니다.입자의 중력에 의해 고체상이 액체상과 함께 칼럼 밖으로 나오지 않도록 합니다.

어피니티 컬럼은 염분 농도, pH, pI, 전하 및 이온 강도를 직접 변화시키거나 구배를 통해 용출시켜 관심 입자를 분해할 수 있다.

최근에는 두 개 이상의 열을 직렬로 사용하는 설정이 개발되었습니다.단일 칼럼 설정에 비해 비결합성 제품이 새로운 칼럼 재료로 연속 칼럼에 직접 전달되므로 수지 재료를 완전히 적재할 수 있다는 장점이 있습니다.이러한 크로마토그래피 과정은 주기적 역류 크로마토그래피(PCC)로 알려져 있습니다.따라서 제품 생산량당 수지 비용을 대폭 절감할 수 있습니다.한 열은 항상 용출되고 다른 열은 로드되는 동안 재생성될 수 있으므로 이미 [8]두 열은 이점을 충분히 활용하기에 충분합니다.추가 칼럼은 추가 장비와 수지 비용을 들여 용출 및 재생 시간을 위한 추가 유연성을 제공할 수 있습니다.

특정 용도

친화성 크로마토그래피는 핵산 정제, 무세포 추출물로부터의 단백질 정제[9], 혈액으로부터의 정화를 포함한 많은 응용 분야에서 사용될 수 있다.

친화성 크로마토그래피를 사용함으로써 특정 단편에 결합하는 단백질과 특정 [10]단편을 결합하지 않는 단백질을 분리할 수 있다.이 정제 기술은 필요한 단백질의 생물학적 특성에 의존하기 때문에 유용한 기술이며 단백질은 한 [11][page needed]번에 여러 번 정화할 수 있다.

다양한 어피니티 미디어

다양한 [12][9][13]어피니티 미디어가 다양한 용도로 사용됩니다.즉, 기능성 스페이서, 서포트 매트릭스, 독성 시약의 취급을 배제하는 (일반화) 활성화/기능화됩니다.

아미노산 배지는 다양한 혈청 단백질, 단백질, 펩타이드 및 효소와 함께 rRNA 및 dsDNA와 함께 사용된다.아비딘 비오틴 배지는 비오틴/아비딘 및 그 유도체의 정제 과정에 사용된다.

탄수화물 결합은 당단백질이나 다른 탄수화물 함유 물질과 함께 가장 자주 사용된다; 탄수화물은 렉틴, 당단백질 또는 다른 탄수화물 대사물 단백질과 함께 사용된다.염료 배위자는 비특이적이지만 생물학적 기질 및 단백질을 모방한다.글루타치온은 GST 태그 부착 재조합 단백질의 분리에 유용하다.헤파린은 일반화된 친화성 배위자이며 핵산 효소 및 리파아제와 함께 혈장 응고 단백질의 분리에 가장 유용하다.

소수성 상호작용 매체는 유리 카르복실기와 단백질을 목표로 하는 데 가장 일반적으로 사용된다.

면역친화성 매체(아래 상세)는 항원과 항체의 높은 특이성을 분리하기 위해 사용한다. 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피는 아래에 상세하게 설명되어 있으며 금속 이온과 단백질(일반적으로 특별히 태그 부착) 사이의 상호작용을 분리하기 위해 사용한다. 탈수소효소, 키나아제 및 아미노기 전이를 분리하기 위해 작용하는 뉴클레오티드/조효소.

핵산은 mRNA, DNA, rRNA 및 기타 핵산/올리고뉴클레오티드를 가두는 기능을 한다.면역글로불린을 정제하기 위해 단백질 A/G법을 사용한다.

특수 배지는 특정 등급 또는 유형의 단백질/co 효소를 위해 설계됩니다. 이러한 유형의 배지는 특정 단백질 또는 조효소를 분리하는 데만 작동합니다.

면역친화성

이 시술의 또 다른 용도는 혈청에서 항체의 친화성 정제이다.혈청이 특정 항원에 대한 항체를 포함하는 것으로 알려진 경우(예를 들어 혈청이 관련 항원에 대해 면역된 유기체에서 나온 경우) 혈청은 해당 항원의 친화성 정화에 사용될 수 있다.이것은 면역 친화성 크로마토그래피로도 알려져 있다.예를 들어, 유기체가 GST-융합 단백질에 대해 면역이 되면 융합 단백질에 대한 항체가 생성되며, GST 태그에 대한 항체도 생성될 수 있습니다.그 후 단백질은 아가로스와 같은 고체 지지체와 공유 결합되어 면역 혈청에서 항체를 정제하는 데 친화성 배위자로 사용될 수 있다.

GST 단백질과 GST-퓨전 단백질을 분리하여 결합할 수 있다.혈청은 처음에는 GST 친화 매트릭스에 결합할 수 있습니다.이것은 융합 단백질의 GST 부분에 대한 항체를 제거할 것입니다.그런 다음 혈청을 고형 지지체로부터 분리하여 GST-융합 단백질 매트릭스에 결합할 수 있습니다.이를 통해 항원을 인식하는 모든 항체를 고체 지지대에서 포착할 수 있습니다.관심 항체의 용출은 글리신 pH 2.8과 같은 낮은 pH 완충제를 사용하여 달성되는 경우가 가장 많습니다.용출액은 중성 트리 또는 인산염 완충액으로 수집되어 낮은 pH 용출 완충액을 중화시키고 항체의 활성 저하를 막습니다.이는 초기 GST-퓨전 단백질을 정제하고 혈청에서 바람직하지 않은 항GST 항체를 제거하며 표적 항체를 정제하기 위해 친화력 정화를 사용하는 좋은 예이다.

모노클로널 항체는 또한 단백질이 상당히 완만한 조건에서 방출되는 큰 특이성으로 단백질을 결합하기 위해 선택될 수 있다.이것은 [14]장래의 추가 연구에 유용하게 쓰일 수 있다.

펩타이드 항원에 대해 생성된 항체를 정제하기 위해 간단한 전략이 종종 사용된다.펩타이드 항원이 합성될 때 펩타이드 N 말단 또는 C 말단에 시스테인 말단 잔기가 첨가된다.이 시스테인 잔기는 펩타이드가 캐리어 단백질에 쉽게 결합될 수 있는 술프하이드릴 관능기(예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH))를 포함한다.동일한 시스테인 함유 펩타이드도 시스테인 잔기를 통해 아가로스 수지 위에 고정화된 후 항체를 정제하는 데 사용된다.

대부분의 모노클로널 항체는 박테리아에서 유래한 면역글로불린 [15]특이 단백질 A 또는 단백질 G에 기초한 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다.

모노클론 항체가 단일 컬럼에 고정화된 면역 친화도 크로마토그래피는 EV의 [16][17]표면에 있는 테트라스파닌과 인테그린을 대상으로 하여 인간의 혈장으로부터 세포외 소포(예: 엑소좀 및 엑소미어)를 포착하는 데 성공적으로 사용되었다.

면역 친화도 크로마토그래피는 또한 환자 치료에서 신속한 진단 수단을 제공하는 면역 색채 검사(ICT) 스트립의 기초가 됩니다.기술자는 ICT를 사용하여 [18]실험실이 필요 없이 환자의 침상에서 결정을 내릴 수 있습니다.ICT 검출은 [19]감염을 일으키는 미생물에 매우 특이합니다.

고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피

고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 아미노산, 특히 히스티딘의 금속에 대한 특정 공유 결합에 기초한다.이 기술은 히스티딘 함유 단백질 또는 펩타이드의 정화를 위한 코발트, 니켈 또는 구리, 인산화 단백질 또는 펩타이드의 정화를 위한 철, 아연 또는 갈륨과 같은 고정화된 금속 이온을 포함하는 컬럼에 금속 이온에 대한 친화력을 가진 단백질을 유지함으로써 작동한다.자연적으로 발생하는 많은 단백질은 금속 이온에 대한 친화력을 가지고 있지 않기 때문에 재조합 DNA 기술을 사용하여 해당 단백질 태그를 관련 유전자에 도입할 수 있다.관심 단백질을 용출하기 위해 사용되는 방법에는 pH를 바꾸거나 이미다졸과 [20][21]같은 경쟁 분자를 첨가하는 것이 포함된다.

히스티딘 태그에 의한 단백질 정화에 사용되는 니켈-아갈로스 비즈를 포함한 크로마토그래피 컬럼
다음 항목도 참조하십시오.폴리히스티딘 태그

재조합단백질

아마도 친화성 크로마토그래피의 가장 일반적인 사용은 재조합 단백질의 정제이다.알려진 친화력을 가진 단백질은 그들의 정화를 돕기 위해 태그된 단백질이다.단백질은 친화력 결합을 위해 선택될 수 있도록 유전적으로 변형되었을 수 있습니다. 이것은 융합 단백질로 알려져 있습니다.태그는 헥사히스티딘(His), 글루타티온-S-전달효소(GST) 및 말토스 결합단백질(MBP)을 포함한다.히스티딘 태그는 고정상에 내장된 킬레이터와 좌표 공유 결합을 형성함으로써 고정화된 니켈, 코발트, 아연, 구리 및 철 이온에 친화성을 가진다.용출에는 이미다졸 등 금속이온배위자로 작용할 수 있는 화합물이 과잉으로 사용된다.GST는 글루타치온 아가로스로서 시판되는 글루타치온에 대한 친화력을 가지고 있다.용출 중에는 과잉 글루타치온이 태그가 부착된 단백질을 치환하기 위해 사용된다.

렉틴스

렉틴 친화성 크로마토그래피는 렉틴이 샘플 내의 성분을 분리하기 위해 사용되는 친화성 크로마토그래피의 한 형태이다.콘카나발린 A와 같은 렉틴은 특정 알파-D-만노스 및 알파-D-포도당 탄수화물 분자와 결합할 수 있는 단백질이다.렉틴 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 일반적인 탄수화물 분자는 Con A-Sepharose와 WGA-agarose입니다.[22]렉틴의 또 다른 예는 D-N-아세틸-글루코사민을 [23]결합하는 밀배아 응집소이다.가장 일반적인 적용은 글리코실화 단백질에서 당단백질을 분리하거나 다른 [24]글리코포름에서 글리코포름을 분리하는 것이다.렉틴 어피니티 크로마토그래피를 실행하는 방법은 다양하지만 목표는 원하는 단백질의 [22]당배위자를 추출하는 것이다.

전문

친화성 크로마토그래피의 또 다른 용도는 특정 단백질에 고유한 겔 매트릭스를 사용하여 특정 단백질을 정제하는 것이다.예를 들어 p-아미노베닐-1-티오-β-D-갈락토피라노실아가로스를 어피니티 매트릭스로 하는 어피니티 크로마토그래피로 대장균β-갈락토시드가수분해효소의 정화를 달성한다.E.Coli-B-갈락토시다아제이 특성은 효소가 친화력 매트릭스의 정지상에 결합할 수 있도록 하며,[25] 컬럼에 염분 농도를 증가시킴으로써 용출된다.

알칼리인산가수분해효소

대장균의 알칼리성 인산가수분해효소는 DEAE-Cellulos 매트릭스를 사용하여 정제할 수 있다.A. 포스파타아제는 약간의 음전하를 가지며, 기질에서 양전하를 띤 아민기에 약하게 결합할 수 있습니다.그리고 나서 그 효소는 더 [26]높은 소금 농도의 완충제를 첨가함으로써 용출될 수 있다.

붕산염 친화성 크로마토그래피

붕산 친화성 크로마토그래피는 당단백질을 용출하고 정량화하기 위해 붕산 또는 붕산염을 사용하는 것으로 구성된다.임상적응은 당화된 헤모글로빈 분석을 [23]통해 당뇨병 환자의 장기 평가를 결정하기 위해 이러한 유형의 크로마토그래피를 적용했다.

혈청 알부민 정제

어피니티 크로마토그래피의 많은 사용 중 한 가지 사용은 알부민과 매크로글로불린 오염의 어피니티 정제에서 나타난다.이러한 정제 유형은 질량 분석 시 과도한 알부민과 α-마크로글로불린2 오염을 제거하는 데 도움이 됩니다.혈청 알부민의 친화성 정제에서 혈청 단백질의 채취 또는 흡착에 이용되는 정제는 시바크론 블루-세파로스가 될 수 있다.그런 다음 혈청 단백질은 티오시아네이트(SCN−)[27]를 포함한 완충제를 사용하여 흡착제로부터 용출될 수 있다.

약한 친화성 크로마토그래피

약친화성 크로마토그래피[28](WAC)는 약물 개발 [29][30]시 친화성 스크리닝을 위한 친화성 크로마토그래피 기법이다.WAC는 고정화된 표적에 대한 다른 약한 친화력을 바탕으로 화학성분을 분리하는 친화력 기반의 액체 크로마토그래피 기술이다.타겟에 대한 친화력이 높을수록 분리단위에 오래 남아서 유지시간이 길어진다.얻어진 분석된 화합물의 체류시간을 처리함으로써 친화력 측정과 친화력 순위를 얻을 수 있다.친화성 크로마토그래피는 화학단백질학 기반 약물 표적 식별에 사용되는 더 큰 기술 모음의 일부이다.

WAC 기술은 단백질 분해효소, 키나아제, 샤페론 및 단백질-단백질 상호작용(PPI) 표적과 같은 여러 가지 다른 단백질 표적에 대해 입증되었습니다.WAC는 fragment 기반 [30]스크리닝에 대해 확립된 방법보다 효과적인 것으로 나타났습니다.

역사

친화성 크로마토그래피는 Pedro Cuatrecasas와 Meir Wilchek에 [31][32]의해 구상되고 처음 개발되었다.

레퍼런스

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외부 링크

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