주기적 역류 크로마토그래피

Periodic counter-current chromatography

주기적 역류 크로마토그래피(PCC)는 친화력 크로마토그래피를 준연속적으로 실행하는 방법이다. 오늘날 이 과정은 주로 연구 개발뿐 아니라 바이오의약품 산업의[1] 항체 정화에 이용되고 있다. 항체를 정화시킬 때 단백질 A는 친화력 매트릭스로 사용된다. 단, 주기적인 역류 프로세스는 모든 친화도형 크로마토그래피에 적용할 수 있다.[2]

기본 원리

기존 친화력 크로마토그래피에서는 단일 크로마토그래피 컬럼에 대상 물질(제품)을 더 이상 친화성 물질로 유지할 수 없게 되기 전까지 최대 지점까지 피드 재료를 적재한다. 흡착된 제품이 묻은 수지는 그 다음 세척하여 불순물을 제거한다. 마지막으로 순수한 제품은 다른 완충제로 용출된다. 특히 기둥에 너무 많은 사료 재료를 적재하면 제품이 파손돼 제품이 유실될 수 있다. 따라서 수율을 최대화하기 위해 기둥을 부분적으로만 적재하는 것이 매우 중요하다.

2열 주기적 역류 공정 "CaptureSMB"에 대한 공정도.

주기적인 역류 크로마토그래피는 둘 이상의 열을 활용함으로써 이 문제를 제쳐둔다. PCC 프로세스는 2개부터 시작하여 임의의 수의 열로 실행할 수 있다.[3] 다음 단락에서는 PCC의 2열 버전을 설명하지만, 더 많은 열을 가진 다른 프로토콜은 동일한 원리에 의존한다(아래 참조). 오른쪽에는 개별 공정 단계를 나타낸 도표가 표시되어 있다. 1단계에서는 소위 순차적 적재 단계인 1열과 2열이 상호 연결된다. 1열은 2열에서 돌파구가 포착되는 동안 샘플(빨간색)이 완전히 적재된다. 2단계에서 1열은 세척, 용출, 세척 및 재균형화되며, 2열은 별도로 적재한다. 3단계에서는 1열 재생 후 1열에 돌파구가 포착되는 동안 2열은 다시 상호 연결되고 2열은 완전히 적재된다. 마지막으로 4단계에서 2열은 세척, 용출, 세척 및 재균형을 하고 1열에서 독립적으로 하중이 계속된다. 이 순환 과정은 연속적으로 반복된다.

세 개 이상의 열을 갖는 주기적 역류 크로마토그래피에는 여러 가지 변형이 존재한다. 이 경우 로딩 중 추가 컬럼이 피드 스트림 내에 배치되어 긴 컬럼을 사용하는 것과 같은 효과를 갖는다. 또는 추가 기둥은 적재 중에 비어 있는 대기 모드로 유지할 수 있다. 이 모드는 세탁 및 세척 프로토콜의 영향을 받지 않는다는 추가적인 보장을 제공하지만, 실제로는 거의 필요하지 않다. 반면에 활용도가 낮은 칼럼은 그러한 프로세스의 이론적 최대 생산성을 감소시킨다. 일반적으로, 다른 다단 프로토콜의 장단점이 토론의 대상이다.[4] 그러나, 의심의 여지 없이, 단일 열 배치 프로세스와 비교했을 때, 주기적인 역류 프로세스는 현저하게 높은 생산성을 제공한다.

동적 프로세스 제어

주기적인 역류 크로마토그래피에 대한 동적 프로세스 제어 메커니즘.

연속 크로마토그래피 실행 시간 척도에서 컬럼 상태, 버퍼 품질, 피드 티터(농도) 또는 피드 구성과 같은 중요한 프로세스 파라미터의 변화를 관찰하는 것이 상당히 일반적이다. 이러한 변경으로 인해 로드된 공급 재료의 양과 비교하여 최대 열 용량이 변경된다. 각 공정 주기에 대해 안정적인 품질과 수율을 달성하려면 개별 공정 단계의 타이밍을 조정해야 한다. 수작업은 원칙적으로 상상할 수 있지만 다소 비현실적이다. 보다 일반적으로 동적 프로세스 제어 알고리즘은 프로세스 파라미터를 모니터링하고 필요에 따라 변경사항을 자동으로 적용한다.

현재 사용 중인 동적 프로세스 컨트롤러에는 두 가지 작동 모드가 있다(오른쪽 그림 참조). DeltaUV라고 불리는 첫 번째 것은 첫 번째 열 전후에 위치한 검출기에서 나오는 두 신호의 차이를 감시한다. 초기하중에서는 두 신호의 차이가 크지만 불순물이 기둥을 통과하면서 점점 줄어들고 있다. 컬럼이 불순물로 완전히 포화되고 추가 제품만 억제되면 신호 간 차이가 일정한 값에 도달한다. 제품이 기둥에 완전히 포획되는 한 신호의 차이는 일정하게 유지된다. 제품 일부가 기둥을 뚫고 들어가는 순간(위 대비) 차이는 줄어든다. 따라서, 제품 돌파의 시기와 양을 결정할 수 있다. 두 번째 가능성인 AutomAb는 첫 번째 열 뒤에 위치한 단일 검출기의 신호만 필요로 한다. 초기 적재 중에는 불순물이 기둥을 통과하면서 신호가 증가한다. 기둥에 불순물이 가득 차 있고 제품이 기둥에 완전히 포획되는 한, 그 신호는 일정하게 유지된다. 제품 일부가 컬럼을 뚫는 순간(위 대비) 신호가 다시 커진다. 따라서, 제품 돌파의 시기와 양을 다시 결정할 수 있다.

두 반복 모두 이론적으로 똑같이 잘 작동한다. 실제로 두 개의 동기화된 신호와 하나의 검출기가 정화되지 않은 공급 물질에 노출되는 요건은 디타를 만든다.UV 접근은 AutomAb보다 신뢰성이 떨어진다.

상업상황

2017년 현재 GE 헬스케어는 3단 주기적 역류 크로마토그래피 특허를 보유하고 있는데, 이 기술은 헥타 PCC 계측기에 사용된다.[citation needed] 마찬가지로 ChromaCon은 최적화된 2열 버전(CaptureSMB)에 대한 특허를 보유하고 있다.[citation needed] 캡처SMB는 ChromaCon의 Contichrom CUBE에서 사용되며 YMC의 에코프라임 트윈 시스템에서는 라이센스 하에 사용된다. 주기적인 역류 크로마토그래피가 가능한 시스템의 추가 제조사로는 Novasep와 Pall이 있다.[citation needed]

참조

  1. ^ Warikoo, Veena; Godawat, Rahul; Brower, Kevin; Jain, Sujit; Cummings, Daniel; Simons, Elizabeth; Johnson, Timothy; Walther, Jason; Yu, Marcella; Wright, Benjamin; McLarty, Jean; Karey, Kenneth P.; Hwang, Chris; Zhou, Weichang; Riske, Frank; Konstantinov, Konstantin (December 2012). "Integrated continuous production of recombinant therapeutic proteins". Biotechnology and Bioengineering. 109 (12): 3018–3029. doi:10.1002/bit.24584. PMID 22729761. S2CID 20663834.
  2. ^ Godawat, Rahul; Brower, Kevin; Jain, Sujit; Konstantinov, Konstantin; Riske, Frank; Warikoo, Veena (December 2012). "Periodic counter-current chromatography - design and operational considerations for integrated and continuous purification of proteins". Biotechnology Journal. 7 (12): 1496–1508. doi:10.1002/biot.201200068. PMID 23070975.
  3. ^ Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Baur, Daniel; Lievrouw, Roel; Lissens, Geert; Morbidelli, Massimo (April 2015). "Twin-column CaptureSMB: A novel cyclic process for protein A affinity chromatography". Journal of Chromatography A. 1389: 85–95. doi:10.1016/j.chroma.2015.02.046. PMID 25748537.
  4. ^ Baur, Daniel; Angarita, Monica; Müller-Späth, Thomas; Steinebach, Fabian; Morbidelli, Massimo (July 2016). "Comparison of batch and continuous multi-column protein A capture processes by optimal design". Biotechnology Journal. 11 (7): 920–931. doi:10.1002/biot.201500481. PMID 26992151.