컬럼 크로마토그래피

Column chromatography
컬럼 크로마토그래피를 사용한 1950년대의 화학자.엘렌마이어 콘센트는 바닥에 있습니다.

화학에서 컬럼 크로마토그래피는 혼합물에서 단일 화합물을 분리하기 위해 사용되는 크로마토그래피 방법이다.크로마토그래피는 흡착제에 대한 화합물의 차등 흡착에 기초하여 물질을 분리할 수 있습니다. 화합물은 컬럼을 통해 서로 다른 속도로 이동하며, 분율로 분리할 수 있습니다.이 기법은 다양한 흡착제(정상 상, 역상 등)를 다양한 용제와 함께 사용할 수 있으므로 널리 적용할 수 있습니다.이 기술은 마이크로그램부터 킬로그램까지 척도로 사용할 수 있습니다.컬럼 크로마토그래피의 주요 장점은 공정에서 사용되는 정지상의 비교적 낮은 비용과 폐기 가능성입니다.후자는 교차 오염 및 재활용에 의한 정지상 열화를 방지합니다.컬럼 크로마토그래피는 중력을 사용하여 용제를 이동시키거나 압축가스를 사용하여 용제를 컬럼을 통해 밀어낼 수 있습니다.

얇은 층의 크로마토그래프는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었을 때 혼합물이 어떻게 작용하는지 보여줄 수 있다.컬럼 크로마토그래피를 수행하기 전에 먼저 박층 크로마토그래피를 사용하여 분리를 최적화합니다.

칼럼 준비

원통형 유리 또는 플라스틱 튜브에 고체 흡착제를 충전하여 기둥을 만든다.크기는 분리되는 화합물의 양에 따라 달라집니다.튜브의 밑면에는 필터, 면 또는 유리 양털 플러그 또는 고체상을 제자리에 고정하기 위한 유리 프릿이 있습니다.칼럼 상단에 용제 탱크를 부착할 수 있다.

컬럼 작성에는 일반적으로 건식법과 습식법의 두 가지 방법이 사용됩니다.건식방법은 먼저 건식고정상분말을 채운 후 이동상을 추가하여 완전히 젖을 때까지 칼럼을 플러싱하고 이 시점부터 [1]건식하지 않도록 한다.습식방법은 고정상분말을 용리액으로 제조한 후 기둥에 조심스럽게 주입한다.실리카의 상단은 평평해야 하며, 실리카의 상단은 모래 층으로 보호될 수 있습니다.용리액을 천천히 기둥에 통과시켜 유기물을 전진시킨다.

개별 구성 요소는 용리액이 있는 칼럼을 통해 서로 다른 속도로 작동하는 동안 정지상에 의해 다르게 유지되고 서로 분리됩니다.기둥의 끝에서 그들은 한 번에 하나씩 빠져나간다.전체 크로마토그래피 과정 동안 용리액은 일련의 분율로 수집됩니다.분수는 분수 수집기를 통해 자동으로 수집될 수 있습니다.크로마토그래피의 생산성은 한 번에 여러 개의 컬럼을 실행함으로써 향상될 수 있습니다.이 경우 멀티스트림 수집기가 사용됩니다.용리액 흐름의 구성을 모니터링할 수 있으며 각 분율은 분석 크로마토그래피, 자외선 흡수 스펙트럼 또는 형광을 통해 용해된 화합물에 대해 분석됩니다.유색 화합물(또는 UV 램프의 도움을 받아 형광 화합물)은 유리 벽을 통해 움직이는 띠로 볼 수 있습니다.

정지상

크로마토그래피 기술을 위한 자동화된 프랙션 수집기 및 샘플러

컬럼 크로마토그래피에서 고정상 또는 흡착제는 고체이다.컬럼 크로마토그래피의 가장 일반적인 정지상은 실리카겔이며 다음으로 일반적인 것은 알루미나입니다.셀룰로오스 가루는 과거에 자주 사용되어 왔다.이온교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피(RP), 어피니티 크로마토그래피 또는 확장층 흡착(EBA)을 실행하기 위해 광범위한 정지상을 이용할 수 있다.정지상은 일반적으로 미세 분쇄 분말 또는 겔이며/또는 증가된 표면을 위한 미세 구멍이지만, EBA에서는 유동 침대가 사용된다.칼럼에 적용할 수 있는 분석물질 혼합물의 정상중량과 건조중량 사이에는 중요한 비율이 있습니다.실리카 컬럼 크로마토그래피의 경우 분석물 성분이 [2]용출되는 정도에 따라 이 비율은 20:1 ~ 100:1이다.

모바일 단계(용리엔트)

컬럼 크로마토그래피는 일련의 단계로 진행됩니다.

이동상 또는 용리액은 컬럼을 통해 화합물을 이동하는 데 사용되는 용제 또는 혼합 용제입니다.크로마토그래피 실행에 소요되는 시간과 용리액의 양을 최소화하기 위해 관심 화합물의 유지인자 값이 대략 0.2~0.3이 되도록 선택한다.용리액 또한 다른 화합물을 효과적으로 분리할 수 있도록 선택되었다.용리액은 소규모 사전 테스트에서 최적화되며, 종종 동일한 정지상의 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용합니다.

각각의 특정 분리에는 최적의 유량이 있습니다.용리액의 유속이 빠를수록 칼럼의 주행에 필요한 시간을 최소화하고 확산을 최소화하여 보다 나은 분리를 얻을 수 있다.그러나 분석물이 정지상과 이동상을 평형하기 위해서는 한정된 시간이 필요하기 때문에 최대 유량이 제한된다.단순한 실험실 기둥은 중력의 흐름에 의해 움직인다.이러한 컬럼의 유량은 신규 용리액 충전 컬럼을 정지상 상단 위로 연장하여 증가시키거나 탭 컨트롤로 감소시킬 수 있습니다.펌프를 사용하거나 압축 가스(예: 공기, 질소 또는 아르곤)를 사용하여 용제를 컬럼(플래시 컬럼 크로마토그래피)[3][4]에 밀어 넣어 더 빠른 유속을 달성할 수 있습니다.

컬럼 크로마토그래피 사진 시퀀스

정지상의 입자 크기는 일반적으로 중력 컬럼 크로마토그래피보다 플래시 컬럼 크로마토그래피에서 더 미세하다.예를 들어, 전자의 기술에서 가장 널리 사용되는 실리카 겔 등급 중 하나는 메쉬 230 – 400(40 – 63 µm)이며, 후자의 기술에는 일반적으로 메쉬 70 – 230(63 – 200 µm)의 실리카 [5]겔이 필요하다.

플래시 컬럼의 성공적인 개발을 지원하는 스프레드시트가 개발되었습니다.스프레드시트는 분석물의 보존 부피와 밴드 부피, 각 분석물을 포함할 것으로 예상되는 분율 수치 및 인접한 피크 사이의 분해능을 추정합니다.이 정보를 통해 사용자는 플래시 컬럼 자체를 [6]시도하기 전에 준비 스케일 분리에 최적의 파라미터를 선택할 수 있습니다.

자동 시스템

자동 이온 크로마토그래피 시스템.

컬럼 크로마토그래피는 모든 실험실에서 매우 많은 시간이 걸리는 단계이며, 모든 프로세스 실험실에서 빠르게 병목현상이 될 수 있습니다.Biotage, Buchi, Interchim 및 Teledyne Isco와 같은 많은 제조업체는 정제 프로세스에 대한 인간의 개입을 최소화하는 자동화된 플래시 크로마토그래피 시스템(일반적으로 LPLC, 저압 액체 크로마토그래피, 약 350-525kPa 또는 50.8-76.1psi)을 개발했습니다.자동 시스템에는 일반적으로 고가의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에서 볼 수 있는 구성 요소(예: 경사 펌프, 샘플 주입 포트, 자외선 감지기 및 용리액을 수집하기 위한 프랙션 수집기)가 포함됩니다.일반적으로 이러한 자동 시스템은 몇 밀리그램에서 산업용 몇 kg 눈금으로 샘플을 분리할 수 있으며, HPLC 준비 시스템에 여러 번 주입하는 데 훨씬 저렴하고 빠른 솔루션을 제공합니다.

LPLC 시스템의 분해능(또는 혼합물을 분리하는 능력)은 HPLC에 비해 항상 낮습니다.HPLC 컬럼의 패킹 재료는 훨씬 작을 수 있기 때문입니다.일반적으로 5마이크로미터에 불과하기 때문에 정지상 표면적이 증가하여 표면 상호작용이 증가하고 분리가 개선됩니다.그러나 이 작은 패킹 매체를 사용하면 배압이 높아지기 때문에 고압 액체 크로마토그래피라고 불립니다.LPLC 칼럼은 일반적으로 약 50마이크로미터의 실리카로 채워져 있기 때문에 배압과 분해능이 감소하지만 고가의 고압 펌프가 필요하지 않습니다.제조업체는 이제 고압 플래시 크로마토그래피 시스템으로 전환하기 시작했으며 이를 1MPa(150psi) 이상에서 작동하는 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 시스템이라고 부릅니다.

컬럼 크로마토그램 분해능 계산

주요 기사: 해상도(크로마토그래피)
컬럼 크로마토그래피용 분말 실리카겔

일반적으로 컬럼 크로마토그래피는 칼럼 상단을 통과하는 연동 펌프, 플로우 버퍼 및 용액 샘플로 설정됩니다.솔루션과 버퍼는 컬럼 설정 끝에 있는 fraction collector가 용출된 샘플을 수집하는 컬럼을 통과합니다.프랙션 채취 전에 컬럼에서 용출된 시료는 시료용액 혼합물 중 분리된 시료의 농도를 결정할 수 있도록 분광광도계나 질량분석계 등의 검출기를 통과한다.

예를 들어, 컬럼에 대한 결합 용량이 다른 두 개의 서로 다른 단백질을 용액 샘플에서 분리하는 경우, 좋은 유형의 검출기는 280 nm의 파장을 사용하는 분광 광도계가 될 것입니다.용출액을 통과하는 단백질 농도가 높을수록 해당 파장의 흡광도는 높아집니다.

컬럼 크로마토그래피는 다양한 농도로 검출기를 통과하는 용출액의 흐름이 일정하기 때문에 검출기는 일정 시간 경과에 따른 용출 샘플의 농도를 표시해야 한다.이러한 표본 농도 대 시간 그래프를 크로마토그램이라고 합니다.

크로마토그래피의 궁극적인 목적은 용액 혼합물에서 다른 성분들을 분리하는 것이다.분해능은 혼합물에서 성분 간의 분리 정도를 나타냅니다.크로마토그램의 분해능이 높을수록 컬럼이 주는 시료의 분리 정도가 좋다.이 데이터는 특정 표본에 대한 열의 분리 특성을 결정하는 좋은 방법입니다.분해능은 크로마토그램에서 계산할 수 있습니다.

다이어그램의 개별 곡선은 컬럼 수지에 대한 친화력을 바탕으로 시간에 따른 다양한 샘플 용출 농도 프로파일을 나타냅니다.분해능을 계산하려면 유지 시간과 곡선 폭이 필요합니다.

유지 시간은 검출기에 의한 신호 검출 시작부터 각 시료의 용출 농도 프로파일의 피크 높이까지의 시간입니다.

Curve width는 크로마토그램에 있는 여러 시료의 농도 프로파일 곡선의 폭(시간 단위)이다.

크로마토그램 분해능을 계산하는 간단한 방법은 플레이트 [7]모델을 사용하는 것입니다.플레이트 모델에서는 칼럼이 특정 수의 섹션 또는 플레이트로 분할될 수 있으며 각 플레이트에 대해 질량 밸런스를 계산할 수 있다고 가정합니다.이 접근방식은 일반적인 크로마토그램 곡선을 가우스 분포 곡선으로 근사한다.이를 통해 곡선폭을 곡선표준편차 4µ의 4배로 추정한다.유지 시간은 신호 검출 시작부터 가우스 곡선의 피크 높이까지의 시간입니다.

위 그림의 변수에서 다음과 같은 방정식을 사용하여 기둥 플레이트 모델의 분해능, 플레이트 번호 및 플레이트 높이를 계산할 수 있습니다.

해상도(Rs)

Rs = 2(tRB – tRA)/(wB + wA)
장소:

tRB = 용질 B의 유지 시간
tRA = 용질 A의 유지 시간
wB = 용질 B의 가우스 곡선 폭
wA = 용질 A의 가우스 곡선 폭
플레이트 번호(N):
N = (tR)/(2w/24)
플레이트 높이(H):
H = L/N
여기서 L은 [7]열의 길이입니다.

기둥 흡착 평형

흡착칼럼은 기둥수지(정지상)를 마이크로비드로 구성한다.단백질, 탄수화물, 금속 이온, 또는 다른 화학 화합물과 같은 더 작은 입자들도 마이크로 비드에 결합됩니다.마이크로비드에 부착된 각 결합입자는 정제 또는 분리가 필요한 컬럼을 통해 보내지는 용질시료와 1:1 비율로 결합하는 것으로 가정할 수 있다.

K는 평형상수, [C]는 타깃 분자의 농도, [S]는 컬럼 수지의 결합 분자의 농도를 나타내는 단순eq 평형반응 Keq=[CS]/(C][S])를 이용하여 분리 대상 분자와 컬럼 비즈상의 결합 분자와의 결합을 모델화할 수 있다.[CS]는 컬럼 [7]수지에 결합된 표적 분자의 복합체 농도이다.

이를 기준으로 컬럼 크로마토그래피의 결합역학을 설명하기 위해 선형, 랭뮤어 및 프룬드리히의 세 가지 다른 등온도를 사용할 수 있다.

선형 등온선은 정제에 필요한 용질 농도가 결합 분자에 비해 매우 작을 때 발생한다.따라서 평형은 다음과 같이 정의할 수 있다.

[CS] = Keq[C]

산업용도의 경우 비어 있는 부지를 고려해야 하므로 기둥 수지 비즈의 총 결합 분자를 고려해야 합니다.Langmuir 등온선과 Freundlich 등온선은 이 평형을 설명하는 데 유용하다.Langmuir Isotherm:
[CS] = (KSeqtot[C])/(1 + Keq[C]) 여기서tot S는 구슬의 총 결합 분자입니다.

Freundlich 등온도:

[CS] = Keq[C]1/n

Freundlich Isotherm은 Column이 정제되어야 하는 용액 내의 많은 다른 샘플과 결합할 수 있을 때 사용됩니다.많은 샘플이 구슬에 대한 결합 상수를 가지고 있기 때문에 K는 매우eq 다양합니다.따라서 이 경우 [7]Langmuir Isotherm은 바인딩에 적합하지 않습니다.

「 」를 참조해 주세요.

  • 고압을 이용한 컬럼 크로마토그래피용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC).
  • 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 분리하기 위한 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC).

레퍼런스

  1. ^ Shusterman, AJ; McDougal, PG; Glasfeld, A (1997). "Dry-Column Flash Chromatography". J Chem Educ. 74 (10): 1222. Bibcode:1997JChEd..74.1222S. doi:10.1021/ed074p1222. ISSN 0021-9584.
  2. ^ "How to set-up a flash chromatography silica column and actually succeed at separation". reachdevices.com. REACH Devices, LLC. Retrieved 3 Jan 2019.
  3. ^ Still, WC; Kahn, M; Mitra, A (1978). "Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution". J Org Chem. ACS. 43 (14): 2923–2925. doi:10.1021/jo00408a041.
  4. ^ Harwood LM, Moody CJ (13 Jun 1989). Experimental organic chemistry: Principles and Practice (Illustrated ed.). London: Blackwell. pp. 180–185. ISBN 978-0-632-02017-1. OCLC 1079261960.
  5. ^ "Material Harvest Silica Gel for Normal Phase Column Chromatography". Material Harvest. 2008. Retrieved 3 Jan 2019.
  6. ^ Fair, JD; Kormos, CM (2008). "Flash column chromatograms estimated from thin-layer chromatography data". J Chromatogr A. 1211 (1–2): 49–54. doi:10.1016/j.chroma.2008.09.085. ISSN 0021-9673. PMID 18849041.
  7. ^ a b c d Harrison RG, Todd PW, Rudge SR, Petrides DP (2003). Bioseparations science and engineering (2nd ed.). New York, NY: Oxford University Press. ISBN 9780190213732. OCLC 899240244.

외부 링크