변위 크로마토그래피

변위 크로마토그래피란 표본을^{[n 1]} 기둥머리에 올린 다음 원래 혼합물의 성분보다 더 강하게 흡착된 용액에 의해 치환되는 크로마토그래피 기법이다. 그 결과 부품은 용제로 분리된 "피크"가 아닌 고농축 순수 물질의 연속적인 "직사각형" 구역으로 분해된다.^[1] 그것은 주로 준비 기법이다; 다른 크로마토그래피 모드에 비해 높은 제품 농도, 높은 순도 및 처리량 증가를 얻을 수 있다.

디스커버리

변위 크로마토그래피의 등장은 1943년에 처음으로 크로마토그래피 모드를 전두엽, 용출, 변위로 분류한 아르네 티셀리우스의 덕분이라고 할 수 있다.^[2] 변위 크로마토그래피는 초우라늄 원소와^[3] 생화학적 실체의 격리를 포함한 다양한 용도를 발견했다.^[4] 이 기술은 현대식 고압기둥과 장비를 ^[5]채용한 Csaba Horvath에 의해 재개발되었다. 그것은 그 이후로 특히 생물학적 고분자 정화의 영역에서 많은 응용을 발견했다.

원리

변위 크로마토그래피의 기본 원리는 매트릭스(정지 단계)에 용액에 대한 결합 부위가 한정되어 있을 뿐이며, 한 부위가 한 분자에 의해 점유되는 경우에는 다른 사람이 사용할 수 없다. 다른 크로마토그래피에서와 같이, 균형은 매트릭스에 묶인 주어진 종류의 분자와 용액에 자유로운 같은 종류의 분자 사이에 확립된다. 결합 부위의 수는 한정적이기 때문에, 용액에 자유로운 분자의 농도가 부위의 분화 상수에 비해 클 때, 그러한 부위는 대부분 채워질 것이다. 이것은 Langmuir isotherm을^{[n 2]} 제공하는 가장 단순한 경우에서 바운드 대 자유 솔루트 플롯에서 하향 곡선을 그린다. 매트릭스에 대한 친화력이 높은 분자(불레이서)는 결합 부위에서 더 효과적으로 경쟁할 것이며, 이동 위상은 저선호도 용액에서 농축된다. 기둥을 통한 이동 단계의 흐름은 우선 저선호도 용액을 방출하므로 고선호도 용액은 결국 친화력이 낮은 모든 분자를 대체하게 된다.

운전모드

싣고 있는

실행이 시작될 때 높은 보존을 촉진하기 위해 선택된 조건 하에서 분리될 용액의 혼합물이 기둥에 적용된다.^{[n 3]} 고선량 용액은 기둥 머리 근처에 우선적으로 보존되며, 저선량 용액은 더 먼 하류로 이동한다. 가장 빠르게 움직이는 구성 요소는 하류에서 순수한 구역을 형성하기 시작한다. 다른 구성 요소도 영역을 형성하기 시작하지만, 기둥 머리부분에서 혼합 사료를 계속 공급하면 완전한 분해능을 방해한다.

변위

전체 샘플이 로드된 후, 피드는 어떤 샘플 구성 요소보다 높은 친화력을 갖도록 선택된 디스플레이서로 전환된다.^{[n 4]} 디스플레이서는 기둥의 머리 부분에 날카로운 모서리의 영역을 형성하여 다른 구성 요소를 하류로 밀어낸다. 각 샘플 구성 요소는 이제 낮은 선인도의 용해제 역할을 하며, 용해제는 일련의 연속 대역("변위 열차")으로 분류되며, 모두 디스플레이서가 설정한 속도로 하류로 이동한다. 열의 크기와 로딩은 구성 요소가 열의 바닥에 도달하기 전에 이 정렬 프로세스가 완료되도록 선택된다. 용액은 각 개별 구역 내의 농도가 사실상 균일하게 한 가지 정제된 구성 요소로 구성된 일련의 연속 구역으로 기둥 하단에 나타난다.

재생

마지막 용액이 용출된 후에는 칼럼에서 디스플레이서를 벗길 필요가 있다. 디스플레이서는 높은 친화력을 위해 선택되었기 때문에, 이것은 도전을 제기할 수 있다. 역상 소재의 경우 유기용제 비율이 높은 세척제로 충분할 수 있다. 대규모 pH 교대조도 채용되는 경우가 많다. 한 가지 효과적인 전략은 화학 반응에 의해 디스플레이서를 제거하는 것이다. 예를 들어, 수소 이온이 디스플레이서로 사용된 경우 수산화물과의 반응에 의해 제거될 수 있고, 다발성 금속 이온은 킬레이트 화합물과의 반응에 의해 제거될 수 있다. 일부 행렬의 경우, 고정 단계의 반응성 그룹을 적정화하여 결합 부위를 일시적으로 제거할 수 있다. 예를 들어 약한 산화물 이온 교환기 또는 킬레이트 레진은 양성자 형태로 변환될 수 있다. 젤 타입의 이온 교환기의 경우, 매우 높은 이온 강도의 선택성 역전도 해결책을 제공할 수 있다. 때때로 디스플레이서는 그것의 친화력을 이동시키기 위해 적정한 기능 그룹으로 특별히 설계된다. 디스플레이서를 세척한 후, 컬럼을 다음 주행을 위한 초기 상태로 복원하기 위해 필요에 따라 세척한다.^[6][7][8]

용출 크로마토그래피와 비교

공통 펀더멘털

어떤 형태의 크로마토그래피에서, 솔루트가 칼럼 아래로 이동하는 속도는 솔루트가 모바일 단계에서 보내는 시간의 비율을 직접적으로 반영한다. 용출 또는 변위 크로마토그래피에서 분리를 달성하려면 정지 단계에 대한 각 용액의 친화력에 상당한 차이가 있어야 한다. 두 방법 모두 기둥의 아래쪽으로의 움직임에 의존하여 두 단계 사이의 분포에서 작은 차이가 미치는 영향을 증폭시킨다. 이동 위상과 정지 위상 사이의 분포는 이동 위상의 집중 함수로서 정지 위상에 결합(또는 정지 위상으로 분할)된 용액의 플롯인 결합 이소템에 의해 설명된다. 이소템은 낮은 농도에서는 선형 또는 대략적으로 선형이지만, 정지 위상이 포화 상태가 되면 일반적으로 높은 농도에서는 곡선(콘카브 다운)이 발생한다.

용출 모드의 특성

용출 모드에서는 좁은 밴드로 칼럼에 솔루트를 적용하고, 낮은 농도로 칼럼을 약 가우스 피크로 아래로 이동시킨다. 이러한 봉우리들은 이동 거리의 제곱근에 비례하여 이동하면서 계속 넓어진다. 두 물질이 분해되려면 충분히 다른 비율로 기둥을 아래로 이동시켜 밴드 확산의 영향을 극복해야 한다. 등심(등심)이 곡선인 고농도에서 작동하면 용출 크로마토그래피에서 불리하게 작용하는데, 이때 이동률이 농도에 따라 달라져 봉우리가 번지고 왜곡되기 때문이다.

용출 크로마토그래피에서의 보유는 일반적으로 사용되는 고정 단계의 유형과 분리될 특정 용액의 종류에 따라 이동 단계의 구성(용제 구성, pH, 이온 강도 등)을 조정하여 제어된다. 이동식 위상 구성요소는 일반적으로 용액이 분리되는 것보다 정지 단계에 대한 친화력이 낮지만, 더 높은 농도에 존재하며 대량 작용으로 인해 그 효과를 얻는다. 용출 크로마토그래피에서의 분해능은 일반적으로 피크가 강하게 유지될 때 더 낫지만, 초기 피크의 분해능을 좋게 하는 조건은 구배 용출을 사용하지 않는 한 런타임이 길고 후기 피크가 지나치게 넓어진다. 그라데이션 장비는 특히 대규모로 복잡성과 비용을 가중시킨다.

변위 모드의 장단점

용출 크로마토그래피와는 달리 변위 모드로 분리된 용액은 피크를 확산시키기보다는 날카로운 모서리의 영역을 형성한다. 변위 크로마토그래피에서 구역 경계는 자기반복적이다: 어떤 이유로 분자가 그것의 띠보다 앞서면, 그것은 더 강하게 유지되는 구역으로 들어가고, 그리고 나서 그것의 구역이 따라잡을 때까지 더 천천히 달릴 것이다. 또한 변위 크로마토그래피는 등가물의 비선형성을 이용하기 때문에 적재량이 의도적으로 높으며, 주어진 시간 내에 정제된 구성품을 상당히 높은 농도로 회수하여 주어진 열에 더 많은 물질을 분리할 수 있다. 보존 조건은 여전히 조정될 수 있지만, 디스플레이서는 솔루트의 이동 속도를 제어한다. 디스플레이서는 분리되는 용액의 어느 하나보다 정지 단계에 대한 친화력이 더 높은 것으로 선택되며, 그 농도는 정지 단계의 포화도에 접근하여 원하는 농도파 이동률을 제공하도록 설정된다. 디스플레이서는 설계 실행 시간에 모든 관심 용액의 제거를 보장하므로 구배 작동 없이 고수위 조건을 사용할 수 있다.^[6][7][8]

높은 보존 조건에서 칼럼을 적재하는 집중 효과 때문에 변위 크로마토그래피는 희석된 공급 흐름에서 구성품을 정화하는 데 매우 적합하다. 그러나 묽은 하천에서 나온 물질을 크로마토그래픽 기둥머리에 농축한 다음 조건을 전환하여 흡착된 물질을 기존의 이소크라틱 또는 그라데이션 모드에서 용출하는 것도 가능하다. 따라서 하중 용량이 크고 희석도가 낮을수록 변위 모드의 농도가 높아지지만 이 접근방식은 변위 크로마토그래피에만 국한되지 않는다.

변위 크로마토그래피의 단점은 비이상성이 항상 각 요소 쌍 사이의 중복 영역을 발생시킨다는 것이다. 이 혼합 구역은 분리 물질의 순도를 보존하기 위해 재활용을 위해 별도로 수집하거나 폐기해야 한다. 성분들 사이의 구역을 형성하기 위해 스페이서 분자를 추가하는 전략(때로는 "캐리어 변위 크로마토그래피"라고도 함)이^[9] 조사되었으며, 적절하고 쉽게 탈착할 수 있는 스페이서가 발견되었을 때 유용할 수 있다. 또 다른 단점은, 특히 변위 열차가 완전히 개발되지 않은 경우, 연속 구역의 경우, 예를 들어 흡수성 또는 굴절률 대 용출량의 플롯과 같은 원시 크로마토그램이 해석하기 때문이다. 문서화 및 문제해결에는 주어진 성분의 분포를 확립하기 위한 추가 화학적 분석이 필요할 수 있다. 재생에 필요한 시간이 처리량을 제한하는 것도 단점이다.

존 C에 따르면. 포드의 크로마토그래피 백과사전에 실린 이론적 연구들은 최소한 일부 시스템의 경우, 변위 크로마토그래피가 변위 크로마토그래피보다 더 높은 처리량을 제공하지만, 제한된 실험 테스트는 변위 크로마토그래피가 (적어도 재생성을 고려하기 전에) 우월하다는 것을 시사한다.정시에^[7]

적용들

역사적으로 변위 크로마토그래피는 아미노산과 희토류 원소의 준비 분리에 적용되었고 동위원소 분리에 대해서도 조사되었다.^{[9][10][11][12]}

단백질

복합 혼합물에서 단백질의 크로마토그래픽 정화는 특히 혼합물이 유사하게 유지되는 단백질을 포함하거나 사료에서 미량 성분을 농축하고자 할 때 상당히 어려울 수 있다. 또한 전통적인 크로마토그래피 모드(예: 선형 그라데이션, 이소크라테스 크로마토그래피)를 사용하여 높은 해상도를 요구하는 경우 칼럼 하중이 제한되는 경우가 많다. 이 경우 변위 크로마토그래피는 다양한 용도의 높은 기둥 적재 시 복합 혼합물로부터 단백질을 정화하는 효율적인 기법이다.

변위 크로마토그래피 기술의 중요한 발전은 이온 교환 시스템에서 단백질 정화를 위한 저분자 질량 디스플레이서의 개발이었다.^[13][14][15] 이번 연구는 이온교환 시스템에서 단백질을 대체하기 위해서는 대형 폴리전자 폴리머가 필요하다는 통념에서 크게 벗어난다는 점에서 의미가 컸다.

저분자 질량 디스플레서는 대형 폴리일렉트로이트 디스플레서에 비해 상당한 운영상의 이점이 있다. 예를 들어, 관심 단백질과 디스플레이서 사이에 겹치는 부분이 있는 경우, 이러한 저분자 질량 물질은 표준 크기 기반 정화 방법(예: 크기 제외 크로마토그래피, 초유도화)을 사용하여 변위 후 처리 시 정제 단백질과 쉽게 분리할 수 있다. 또한 이러한 낮은 MW 디스플레서의 염분에 의존하는 흡착 작용은 칼럼 재생에 크게 도움이 된다. 이러한 디스플레서는 이온 교환 시스템에서 매우 다양한 고해상도 분리를 위해 사용되어 왔다.^{[16][17][18][19][20][21][22]} 또한 재조합 성장인자의 정화를 위한 변위 크로마토그래피,^[23] 항원백신 단백질^[24], 항산 올리고뉴클레오티드^[25] 등의 효용성도 입증되었다. 변위 크로마토그래피를 이온 교환을 이용한 단백질 정화에 적용한 사례, 소수성 상호작용, 역상 크로마토그래피 등이 있다.^[26]

변위 크로마토그래피는 벤치 눈금의 표준 분석 크로마토그래피 기둥을 사용하여 복잡한 혼합물에서 정제된 단백질의 mg량을 얻는 데 매우 적합하다. 또한 피드의 미량 성분을 풍부하게 하는 데 특히 적합하다. 변위 크로마토그래피는 이온 교환, HIC 및 RPLC를 포함한 다양한 수지 시스템을 사용하여 쉽게 수행할 수 있다.

2차원 크로마토그래피

2차원 크로마토그래피는 프로테오메의 평가에 가장 철저하고 엄격한 접근법을 나타낸다. 이전에 수용된 접근방식은 역상 HPLC에 대한 양이온 교환과 같은 용출 모드 크로마토그래픽 접근방식을 활용했지만, 수율은 피코몰라 ~ 대퇴골 범위에서 분석적 민감성을 요구하는 것이 보통 매우 낮다.^[28] 변위 크로마토그래피는 미량 구성요소의 농도의 이점을 제공하므로, 업스트림 크로마토그래피 단계에서 용출 모드보다는 변위를 활용하는 2차원 크로마토그래피는 미량 구성요소의 분석, 수정 및 소량 표현 구성요소의 식별을 위한 잠재적으로 강력한 도구를 나타낸다. 단백질의

메모들

참조