스트렙태그

Strep-tag

스트렙태그 시스템은 친화력 크로마토그래피에 의한 단백질의 정화와 검출이 가능한 방법이다.스트렙-태그 II는 8개의 아미노산(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phen-Glu-Lys)으로 구성된 합성 펩타이드다.이 펩타이드 순서는 특별히 설계된 스트렙타비딘인 스트렙타빈에 대한 내인적 친화력을 보이며 재조합 단백질에 N- 또는 C-단말적으로 융합될 수 있다.매우 구체적인 상호작용을 이용하여 스트렙 태그가 붙은 단백질은 조잡한 세포 라이스로부터 한 번에 격리될 수 있다.스트렙 태그는 온화하고 생리적인 조건 하에서 용출되기 때문에 특히 기능적인 단백질의 생성에 적합하다.[1][2]

스트렙태그 개발 및 생화학

Streptavidin은 Streptomyces avidinii로 표현되는 사선 단백질이다.스트렙타비딘은 비타민 H(바이오틴)에 대한 친화력이 높기 때문에 분자생물학과 생명공학 분야에서 흔히 사용된다.Strep-tag는 원래 유전 도서관에서 특별히 단백질이 잘린 "핵심" 버전의 Streptavidin에 결합하기 위해 선택되었다.수년간, Strep-tag는 시스템적으로 최적화되어 첨부 사이트 선택에 있어 더 큰 유연성을 허용했다.또한, 상호 작용 파트너인 스트렙타비딘도 펩타이드 바인딩 능력을 증가시키기 위해 최적화되었고, 그로 인해 스트렙-탁틴이 개발되었다.Strep-Tactin에 대한 Strep-tag의 결합 친화력은 Streptavidin에 비해 거의 100배 높다.스트렙-태그와 스트렙-탁틴으로 구성된 이른바 스트렙-태그 시스템은 프로테오메 연구에서의 단백질 복합체의 기능적 격리 및 분석에 특히 유용한 것으로 입증되었다.[3]

스트렙태그 원리

다른 단선호도 태그(His-tag, FlAG-tag)와 마찬가지로, 스트렙 태그는 그것의 cDNA나 유전자의 하위 클론 생성 시 재조합 단백질에 쉽게 융합될 수 있다.그 표현으로 다양한 숙주 유기체(대장균, 효모, 곤충, 포유류 세포)를 위한 다양한 벡터를 사용할 수 있다.[4]Strep-tag의 특별한 이점은 크기가 작다는 것과 생화학적으로 거의 불활성이라는 사실이다.따라서 단백질 접기나 분비물은 영향을 받지 않고 대개 단백질 기능에 지장을 주지 않는다.스트렙 태그는 특히 기능 단백질 분석에 적합하며, 생리학적 조건 하에서 정화 절차를 유지할 수 있기 때문이다.이를 통해 민감한 단백질을 고유 상태에서 격리시킬 수 있을 뿐만 아니라,[5] 한 단위 소단위만 태그를 운반해도 온전한 단백질 복합체를 정화시킬 수 있다.

Strep-tag 정화 주기의 첫 번째 단계에서 Strep-tag 융합 단백질을 함유한 세포 라이세트를 고정된 Strep-Tactin(1단계)으로 기둥에 도포한다.태그가 붙은 단백질이 특별히 스트렙-탁틴과 결합한 후, 생리적 완충제를 사용한 짧은 세척 단계(예: PBS)는 다른 모든 숙주 단백질(2단계)을 제거한다.이는 단백질을 비구체적으로 결합하는 경향이 현저히 낮기 때문이다.그런 다음 정제된 스트렙태그 융접단백질을 데시오비오틴의 저농도로 부드럽게 용출시켜 바이오틴 결합주머니(3단계)를 위해 특별히 경쟁한다.칼럼을 재생하기 위해 데시오비오틴은 용액(노란색 아조 염료)을 함유한 HABA를 적용하여 제거한다.데시오비오틴 제거는 노란색-주황색에서 빨간색(4+5단계)으로 색상이 변경되어 나타난다.마지막으로, HABA 용액은 소량의 실행 버퍼로 세척되어 다음 정화 실행에 사용할 준비가 되어 있다.

Strep-태그 응용 프로그램

Strep-tag 시스템은 생리적 조건 하에서 단백질을 정화하기 위해 고도로 선택적인 도구를 제공한다.얻어진 단백질은 생체 활성이며 매우 높은 순도(95% 이상)를 나타낸다.또한 Strep-tag 시스템은 다양한 검사에서 단백질 검출에 사용될 수 있다.실험 상황에 따라 효소(예: 호세라디시 과산화효소(HRP), 알칼리성 인산염(AP) 또는 형광 단백질(GFP) 마커를 가진 스트렙 태그 항체 또는 스트렙-탁틴.높은 순도가 필요할 경우 먼저 스트렙탁틴을 사용해 리세이트를 정제한 후 스트렙태그에 대한 항체를 이용해 2차 주행을 할 수 있다.이것은 어떤 희귀한 시나리오에서 발생할 수 있는 특정한 결합 단백질로 오염을 감소시킨다.

Strep-tag 감지 시스템을 사용하여 다음과 같은 검사를 수행할 수 있다.

스트렙 태그는 단백질 복합체를 분리할 수 있기 때문에 단백질과 단백질 상호작용 연구를 위한 전략도 수행할 수 있다.또 다른 옵션은 미세플라이트나 바이오칩에 특정 고친화도 항체를 가진 스트렙 태그 단백질의 고정화다.

Strep-Tag/StrepTactin 시스템은 단일 분자 광학 핀셋과 AFM 실험에서도 사용되며, 현재 사용 가능한 가장 강력한 비공용 링크에 필적하는 높은 기계적 안정성을 보인다.[6]

참고 항목

참조

  1. ^ Schmidt, Thomas GM; Skerra, Arne (2007). "The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins". Nature Protocols. 2 (6): 1528–35. doi:10.1038/nprot.2007.209. PMID 17571060. S2CID 25209313.
  2. ^ Skerra, A; Schmidt, TG (2000). Use of the Strep-Tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins. Methods in Enzymology. Vol. 326. pp. 271–304. doi:10.1016/S0076-6879(00)26060-6. ISBN 978-0-12-182227-9. PMID 11036648.
  3. ^ Ostermeier, Christian; Harrenga, Axel; Ermler, Ulrich; Michel, Hartmut (1997). "Structure at 2.7 Å resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome c oxidase complexed with an antibody FV fragment". Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (20): 10547–53. doi:10.1073/pnas.94.20.10547. PMC 23397. PMID 9380672.
  4. ^ https://www.qiagen.com/resources/download.aspx?id=0fadc040-86ad-4e31-bb58-7e83ceb77b72&lang=en[bare URL PDF]
  5. ^ Junttila, Melissa R.; Saarinen, Susanna; Schmidt, Thomas; Kast, Juergen; Westermarck, Jukka (2005). "Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells". Proteomics. 5 (5): 1199–203. doi:10.1002/pmic.200400991. PMID 15761952. S2CID 24773674.
  6. ^ 모예드 F, 마샤기 A, 탄스 SJ(2013) 광학 핀셋을 이용한 단일 분자 나노-기계 측정에 선택적 연결 기능을 적용한 폴리펩타이드-DNA 하이브리드.PLoS ONE 8(1): e54440. doi:10.1371/journal.pone.0054440 [1]

외부 링크