줄기세포 분화의 후생유전학

이 기사의 일부(기사와 관련된 것)는 갱신할 필요가 있다. 최근 이벤트 또는 새로 사용 가능한 정보를 반영하도록 이 문서를 업데이트하십시오. (2018년 9월)

배아줄기세포는 체내의 위치에 따라 스스로 재생하고 원하는 운명에 따라 분화시킬 수 있다. 줄기세포의 전진은 특정한 유전자 전사 프로그램뿐만 아니라 염색체 구조를 조절하는데 있어서 매우 역동적인 후생유전학적 메커니즘을 통해 유지된다.^[1] 후생유전학은 유전자 발현의 변화를 언급하기 위해 사용되어 왔는데, 유전자 발현의 변화는 DNA 서열에 영향을 미치지 않는 수정을 통해 유전된다.^[2]

포유류의 후생유전자는 줄기 세포 개발 초기에 전지구적 리모델링을 거치게 되는데, 이를 위해서는 원하는 혈통에만 세포가 제한되어야 한다. 줄기 세포의 혈통 약속의 유지가 DNA 메틸화, 히스톤 수정, 염색질 구조의 ATP 의존적 리몰딩의 조절과 같은 후생유전학적 메커니즘에 의해 제어된다는 것을 암시하는 여러 증거가 있었다.^[1][3] 히스톤 코드 가설에 근거하여, 뚜렷한 공밸런트 히스톤 수정은 세포의 운명에 영향을 미치는 기능적으로 구별되는 염색질 구조를 초래할 수 있다.

후생유전적 수정을 통한 이러한 염색질의 조절은 세포가 원하는 운명으로 계속 분화되는지 여부를 결정하는 분자 메커니즘이다. 리 외 연구진에 의한 연구는 무린 배아줄기(ES) 세포의 시험관내 분화를 통해 줄기세포 분화 중 후생유전학적 변화가 염색체 구조에 미치는 영향과 이러한 후생유전학적 표지의 변조를 조사했다.^[4]

실험 배경

배아줄기세포는 전지구적 색소구조와 특정 부위별 색소구조 모두에 극적이고 복잡한 변화를 보인다. 리 외 연구진은 히스톤 사이트 H3K9 및 H3K4에서 특정 사이트별 수정 시 전지구적 아세틸화 및 메틸화 수준을 검토하여 줄기세포 분화에 대한 제산화와 아세틸화의 중요성을 판단하기 위한 실험을 수행했다. 후생유전학적 개조에 의해 조절되는 이러한 히스톤의 유전자 발현은 배아줄기세포를 원하는 세포 선으로 제한하고 세포 기억력을 발달시키는데 매우 중요하다.

포유류 세포의 경우, 시토신 메틸화의 유지관리는 DNA 메틸전달물질에 의해 촉진되며, 이러한 메틸전달물질에 대한 어떠한 붕괴도 배아에 치명적인 표현형을 야기할 것이다. 사이토신 메틸화는 H3K9에서 검사되는데, 이는 활성 이염색체와 관련이 있고 CpG 디뉴클레오티드에서 주로 발생하며, 전지구 아세틸화는 활성 유크롬염과 연관된 H3K4에서 검사된다. 포유류의 지유전 게놈은 수정 후 능동적이고 수동적인 글로벌 시토신 디메틸화를 거쳐 배반포시스트 단계에서 최소 지점인 20% CpG 메틸화에 도달하며, 이후 전지구적 수준의 CpG 메틸화를 60%^[4]로 복원하기 위해 염색체 구조를 재프로그래밍하는 메틸화 파동을 겪는다. 메틸화의 감소 또는 고도 수준을 포함하는 배아줄기세포는 실행 가능하지만 분화가 불가능하므로 포유류 발달을 위한 시토신 메틸화의 중요한 조절이 필요하다.

배아줄기세포 분화시 전지구적 히스톤변형 효과

체외 배아 줄기세포 분화의 시작에 따라 염색질의 히스톤 수정은 다양한 시간 간격(6일 기간)으로 분석되었다. 백혈병 억제 인자(LIF)의 제거는 분화를 유발한다. Western Blotting을 사용하여 평가된 LIF 제거 후 특정 현장의 히스톤 수정의 대표 데이터는 하루 후 히스톤 H3의 H3K4 및 H3K9 위치에서 강한 탈산성을 확인하며, 이후 2일째에 이르러 아세틸화가 약간 증가한다.^{[citation needed]}

히스톤 H3K4의 메틸화도 LIF 제거 하루 만에 감소했지만 분화 2~4일 사이에 반등을 보여 결국 5일째 메틸화 감소로 끝났다. 이러한 결과는 배아줄기세포 분화의 시작과 후생유전자의 재프로그래밍을 통해 즉시 이어지는 활성 유색체 후생유전학적 마크의 수준이 감소했음을 나타낸다.

H3K9 위치의 히스톤 수정은 미분화 배아줄기세포의 디-메틸화 감소와 시험관 분화의 6일 과정 동안 메틸화의 점진적인 증가를 보여, 이 히스톤 마크에서 비활성 이질색체 수치가 전세계적으로 증가하고 있음을 보여주었다.^{[citation needed]}

배아줄기세포가 분화를 겪으면서 활성 유로마틴(히스토네 아세틸화, H3K4 메틸화)의 마커가 감소해 실제로 세포가 분화되고 있음을 보여준다. 이러한 각각의 표시에서 약간의 반등은 표지를 다시 한 번 감소시킬 수 있는 또 다른 기회를 허용하여 세포가 성숙 상태에 가까워지게 함으로써 추가적인 분화가 일어날 수 있게 한다. 활성 이염색체의 표식인 H3K9me에서도 6일 동안 증가가 있기 때문에 일단 분화가 일어나면 세포가 원하는 운명으로 분화되면서 이염색질의 형성이 발생하여 세포가 더 이상의 분화를 방지하기 위해 비활성화된다는 결론이 내려진다.

분화 대 미분화 세포의 DNA 메틸화

5-메틸시토신의 전지구적 수치는 체외에서 미분화 배아줄기세포와 분화된 배아줄기세포 사이에서 비교되었다. 글로벌 시토신 메틸화 패턴은 배아줄기세포의 체외 분화에 따라 발생하는 히스톤 코드의 재프로그래밍에 앞서 확립된 것으로 보인다.

배아줄기세포가 분화를 겪으면서 DNA 메틸화의 수준이 높아진다. 이는 분화 중에 비활성 이질 색소 침착이 증가함을 나타낸다.

DNMT를 사용한 메틸화의 추가 효과

포유류에서, DNA 메틸화는 다중의 핵심 요소인 급속한 자기 재생 능력을 조절하는 역할을 한다. 카바리 외 연구진은 DNA 메틸화의 근본적인 메커니즘과 분화를 조절하는 여러 경로와의 상호작용을 논의했다.^[5] 다양한 분화 상태에서 DNA 메틸화의 유전학적 상태를 연구하는 새로운 접근방식은 이 과정에서 Putative Enhancer와 관련된 CpG 현장의 메틸화가 중요하다는 것을 보여주었다. DNA 메틸화는 메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 함유한 시퀀스에 대한 결합 특이성을 나타내는 MeCP2와 같은 억제기를 모집함으로써 전사 인자의 결합 친화성을 변조할 수 있다. DNA 메틸화는 특정 메틸전달효소인 DMNT에 의해 제어되며, 각각에 따라 다른 기능을 수행한다. DNMT3A와 DNMT3B는 둘 다 줄기세포의 초기 개발에서 DNA 메틸화 패턴의 확립에 관한 역할과 연결되어 있는 반면, DNMT1은 후생유전적 규제 상태를 유지하기 위해 세포가 복제를 거친 후 새로 합성된 DNA 가닥을 메틸화해야 한다. 수많은 단백질들이 물리적으로 DNMTs 자체와 상호작용을 할 수 있으며, 이는 Hemi-methylated DNA에 대한 DNMT1의 표적을 돕는다.

몇 가지 새로운^[when?] 연구는 구별되지 않은 상태를 유지하기 위해 세포 주기 및 DNA 수리 경로의 조절과 상호작용하는 DNA 메틸화의 중심적 역할을 지적한다. 배아줄기세포에서 DNMT1는 미분화 조제세포 구획 내의 고갈로 인해 세포 주기억제, 조기 분화, 조직 자가 재생의 실패로 이어졌다. DNMT1의 상실은 분화 유전자의 활성화 및 세포 주기 진행을 촉진하는 유전자의 상실과 관련된 심오한 영향에서 발생하여 DNMT1과 다른 DNMT가 분화를 지속적으로 억제하지 않고 따라서 전지전능 상태를 유지함을 나타낸다.

이러한 연구는 줄기세포 상태를 유지하기 위해 DNMT의 상호작용이 중요하다는 점을 지적하여 이질 색색의 추가 분화와 형성을 허용한다.

ESC 분화 중 조절된 유전자의 후유전학적 수정

오카모토 외 연구진은 앞서 배아줄기세포 분화에 따라 감소하는 104 유전자의 발현 수준을 문서화했다.^[6] Lee 외 연구진은 배아줄기세포 분화 중 발달을 진행 중인 조절된 유전자의 후유전적 변화를 조사하기 위해 미분화 세포와 관련된 10월4일 촉진자의 Chip 분석을 수행했다. 이 프로모터 부위는 H3K4 메틸레이션과 H3K9 아세틸레이션 부위에서 감소하였고, 분화 중에 H3K9 메틸레이션 부위에서 증가하였다. 10월 4일 유전자 촉진제의 CpG 모티브를 분석한 결과 DNA 메틸화의 점진적 증가가 나타났으며, 앞서 기드켈과 버그만에서 보고된 바와 같이 분화 10일째에 완전히 메틸화되었다.^[7]

이러한 결과는 H3K4의 아세틸화가 감소하고 H3K9Me가 증가함에 따라 활성 유크롬화에서 비활성 헤테로마틴으로의 이동이 있었음을 나타낸다. 이는 104유전자에서 세포가 분화되고 있다는 뜻으로, 104유전자 발현의 침묵과 일치한다.

히스톤 수정을 위해 시험한 또 다른 특정 유전자는 브라키우리 유전자로, 중간자 분화의 표식이며 미분화 배아줄기세포에서 약간만 발현된다. "Brachyury"는 분화 5일째에 유도되었고 분화 마지막 날에 해당하는 10일째에 완전히 침묵되었다.^[8] 'Brachyury' 유전자 프로모터의 Chip 분석 결과 0일과 5일차 배아줄기세포 분화에서 H3K4의 모노메틸화와 디메틸화가 증가했으며, 10일차에는 유전자 발현이 상실됐다. H3K4 트리메틸화는 5일차에만 유전자 발현이 있었기 때문에 브라큐리 유전자 발현이 가장 높은 시기와 일치한다. 모든 형태의 H3K4 메틸화는 분화 10일째에 부재하며, 이는 브라키우리 유전자 발현의 침묵과 관련이 있다. 0일차에서 생성된 두 히스톤의 모노메틸화는 염색체 구조에 유용하지 않은 마커를 나타낸다. H3K9의 Acetlyation은 분화의 유도에서 하향 조절되었기 때문에 Bracchyury 유전자 발현과 상관관계가 없다. DNA 메틸화 발현을 검사한 결과, 이 현장에 시토신 메틸화가 없는 상태에서 프로모터 지역 상류 CpG 모티브가 메틸화되지 않음을 시사하는 남부 분석에서는 중간 크기의 불량 형성이 없었다.

이러한 연구를 통해 H3K9 di-methylation과 tri-methylation은 모두 DNA 메틸레이션과 유전자 발현과 상관관계가 있다는 것을 입증하는 반면, H3K4 tri-methylation은 브라큐리 유전자의 가장 높은 유전자 발현단계와 연관되어 있다. 산토스-로사의 이전 보고서는 활성 유전자가 효모 속의 H3K4 3-메틸화와 연관되어 있다는 것을 보여주는 이 자료와 일치한다.^[9]

이 데이터는 브라키우리 유전자 발현의 침묵과 맞물려 다시 분화가 일어나면서 헤테로크로마틴이 형성되고 있다는 점에서 10월4일 유전자와 동일한 결과를 나타냈다.

유지 접지 상태의 후생성 교차점 ESC가 프라이밍 상태로 들어가지 않음

미에로 외 연구진이 수행한 연구에서는 H3K27me3와 PCR2 폴리콤프 억제 콤플렉스의 독특한 패턴을 제안하는 데이터를 입수하여 ESC가 지상 상태에서 벗어나거나 원시 상태로 들어가는 것을 막았다.^[10] 이들은 지상주 ESC가 LIF나 2i에 의해 유지된다는 관찰에서 출발하여 지상주 후생유전자가 어떻게 생겼는지 조사하기 시작했다. Chip-seq 프로파일링을 사용하여, 그들은 H3K27me3의 기준선 수준이 혈청(기본)의 기준 수준보다 2i ESC에서 더 높다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결론은 기능적 PRC2 복합체를 제거한 후 2i ESC가 영장류 같은 품질을 얻었다는 같은 논문에서 발견되어 H3K27me3를 무용지물로 만들었다는 사실이 더욱 뒷받침되었다.^[10]

TSA가 줄기세포 분화에 미치는 영향

백혈병 억제 인자(LIF)는 모든 세포 라인에서 제거되었다. LIF는 세포 분화를 억제하고, 그 분리를 통해 세포 라인이 세포 분화를 거치게 한다. 세포 라인은 히스톤 제산제 억제제인 트리코스타틴 A(TSA)로 6일 동안 처리되었다. 한 그룹의 셀 라인은 TSA 10nM으로 처리되었다. 서양의 분석은 배아줄기세포 분화의 제어에서 관찰된 1일차 초기 탈산성의 부족을 보여주었다. 히스톤 디아세틸라제 활성이 부족하여 H3K9과 히스톤 H4의 아세틸화가 가능했다. 배아줄기세포도 세포 분화의 척도 중 하나로 태아체 형성을 관찰하기 위해 형태학적으로 분석하였다. 10nM TSA 처리된 세포는 제어 셀 라인에서 관찰된 바와 같이 6일까지 발생 체를 형성하지 못했다. 이는 TSA로 처리된 ES 세포가 1일차에는 탈산화가 부족했고 LIF 제거 후 분화하지 못했음을 의미한다. 두 번째 그룹 '-TSA 데이4'는 3일 동안 TSA와 함께 치료를 받았다. TSA 치료가 중단되자마자 4일차에는 탈산화가 관찰되었고 5일차에는 아세틸화가 회복되었다. 형태학적 검사 결과 6일차에 의해 발생체 형성이 나타났다. 또 발생체 형성이 제어세포선보다 빨랐다. 이는 '-TSA Day4' 라인이 LIF 제거에 대응하고 있었지만 어떠한 차별화 표현형식도 획득할 수 없었음을 시사한다. 그들은 TSA 치료 중단 후 빠른 속도로 분화 표현형을 획득할 수 있었다. 세 번째 그룹의 형태학적 검사 '5nM TSA'는 대조군과 10nM-TSA군 사이의 중간 효과를 보여주었다. TSA의 낮은 선량은 어떤 발생체 형성을 가능하게 했다. 이 실험은 TSA가 히스톤 디아세틸라제를 억제하고 배아줄기세포 분화를 위해 히스톤 디아세틸라제의 활성화가 필요하다는 것을 보여준다. 1일차에 초기 탈산화가 없으면 ES세포는 분화를 거치지 못한다.^{[citation needed]}

알칼리성인산화효소 활성

인간에게서 발견되는 알칼리성 인산염은 단인산 에스테르의 가수분해를 촉진하는 기능을 하는 막 결합 당단백질이다. 맥케나 외 연구진(1979)은 알칼리성 인산염, 신장, 간, 뼈 알칼리성 인산염의 세 가지 종류가 있으며, 모두 동일한 구조 유전자에 의해 코딩되지만 비식별성 탄수화물 모이티스를 함유하고 있다는 사실을 발견했다. 따라서 알칼리성 인지효소 다양성은 단백질의 변환 후 글리코실화에서 효소 작용의 고유한 보완을 표현한다.^[11]

정상 줄기세포에서는 알칼리성 인산염 활성도가 분화에 따라 낮아진다. 트리코스타틴 A는 세포가 알칼리성 인산염의 활동을 유지하도록 한다. 트라이코스타틴 A는 포유류 히스톤 디아세틸라아제의 가역적 억제를 유발하여 세포 성장 억제로 이어질 수 있음 트라이코스타틴 A가 3일 후 철수되었을 때 알칼리성 인산아제 멸종이 유의하게 증가하였다. 알칼리성 인산염 활성도는 형태학 변화와 관련이 있다. 배아줄기세포 분화를 위해서는 히스톤의 초기 탈산화가 필요하다.^[12]

HDAC1(HDAC2는 아님)으로 차별화 제어

도베리 외 연구진(2010년)은 HDAC KOUT 마우스를 사용하여 HDAC1 또는 HDAC2가 배아 줄기세포 분화에 중요한지 여부를 입증했다. HDAC 1이 없는 상태에서 글로벌 히스톤 아세틸화를 검사한 결과 아세틸화의 증가가 나타났다. HDAC2의 손실로 인해 글로벌 히스톤 아세틸화 수준은 변하지 않았다. HDAC 녹아웃 생쥐의 과정을 자세히 분석하기 위해 녹아웃 생쥐 배아줄기세포를 이용해 발생체 생성을 했다. 그것은 배아줄기세포가 위식 직전 또는 배아줄기세포에 HDAC1이 결핍되어 눈에 보이는 발달 결함을 획득했다는 것을 보여주었다. HDAC1 녹아웃 배아줄기세포의 지속적인 배양으로 형성된 태아 체질이 일반 생쥐처럼 균일하게 구형이 되기보다는 불규칙해지고 크기가 줄어든다는 것을 알 수 있었다. 배아줄기세포 증식은 HDAC1이나 HDAC2의 손실에는 영향을 받지 않았지만, 배아줄기세포의 분화는 HDAC1이 부족하여 영향을 받았다. 이는 분화 중 세포 운명 결정에 HDAC1이 필요함을 보여준다.^[13]

크로니스 외 연구진(2017년)의 연구에서는 체세포를 전능줄기세포로 재프로그래밍하는 과정에서 OSK(야마나카 4인자 중 3인 - 10월4일, 삭스2, KLF4, c-Myc)가 다른 전사요소와 함께 작용하여 엔핸서(enhancer) 지형을 변화시켜 분화의 상실과 플뤼포텐시(plurpenc)의 획득으로 이어진다는 사실이 밝혀졌다. 그들은 OSKM 결합 염색체 상태를 재프로그래밍 단계에서 매핑하고 기능 실험의 손실과 이득을 수행함으로써 이것을 결정할 수 있었다. 또 OSK가 Hdac1을 통해 ME(MEF-enhancers)를 부분적으로 침묵시켰다는 결론을 내릴 수 있었는데, 이는 Hdac1이 체세포를 재프로그래밍하는 과정에 역할을 한다는 것을 시사한다.^[14]

전염병

후생유전학은 분화의 유전자 발현 규제에 중요한 것으로 알려져 있다. 이와 같이 분화 중에 후생유전학적 메커니즘을 억제하는 작은 분자나 약물에 대해 행해지는 연구는 중피줄기세포의 뼈 재생과 같은 임상적 응용에 큰 잠재력을 가질 수 있다.^[15]그러한 응용의 한 예는 멜라노마 맥락에서 DNA 메틸전달효소 1(DNMT1)을 고갈시키기 위한 데시타빈(데옥시티딘 아날로그)의 사용이다.^[16] 알카자르 외 연구진은 (DNMT1 고갈로 인해) 멜라노사이트의 분화를 초래하여 종양 성장을 억제할 수 있는 유전자 발현 변화를 일으키려는 의도로 이렇게 했다. 이러한 (약물)과 같은 작은 분자는 치료적 사용 잠재력이 크면서도 위험과도 관련이 있다. DNMTi(Decitabine)로 돌아가면 다른 예상치 못한 오프타깃 효과 외에도 빈혈과 같은 부작용이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다.^[15] 이것은 전염병 대상의 특수성을 개선하고, 새롭고 개선된 약물 전달 방법을 고안하는 것의 중요성을 강조한다.^[15]

와딩턴 풍경 정량화

C. 와딩턴은 대리석이 육지의 지형에 의해 결정되는 경치, 그 진로가 결국 더 낮은 지점을 향해 작용하는 '유전적 풍경'의 은유를 만들어냈다. 서로 다른 지점에서 이 길이 갈라지고, 대리석은 한 길로 내려간다. 이 은유에서 공은 발달 중의 세포로, 이 은유는 세포 분화의 기초가 되는 유전자 조절의 역학(유전유전학)으로 확장될 수 있다. ^[17] 왕 외 연구진(2011년). 이를 위한 이론/수학적 프레임워크를 개발했는데, 이는 데이터 중심 방식으로 Waddington 경관 아이디어와 유전자 규제 네트워크를 연결하려는 최초의 시도 중 하나이기 때문에 의미가 크다. 이것은, 그들 자신의 말로, "두 개의 세포 운명 중 하나로 다발성 세포의 운명 결정과 헌신의 글로벌 본질을 연구하기 위한 틀"을 제공하는데, 이것은 세포 재프로그래밍을 하거나 단지 분화를 촉진할 수 있는 것에 대해 더 배우는 데 매우 가치 있는 도구가 될 수 있다.

미래

DNA 메틸화에 의해 매개되는 유전자 발현에 대한 안정된 후생유전적 규제의 방해는 암을 포함한 여러 인간 질환과 관련이 있으며, 각각 변형된 메틸화 기반 각인에 의해 발생하는 사이비혈포자병증형 IA, 벡위드위데만, 프라더윌리, 엔젤만 신드롬과 같은 선천성 질환도 포함된다.특정 장소에.

히스톤 디아세틸화는 감수분열 동안 난모세포에서 핵 재프로그래밍의 중요한 특징인 반면, 전지구적 패턴과 유전자 고유의 세포 메틸화 양쪽에 대한 섭동은 암에서 흔히 관찰된다.^[18]

최근의 연구는 DNA 메틸화에 의한 적절한 후생유전적 규제를 부여하기 위해 서로 협력하는 일련의 다른 경로가 있다는 것을 밝혀냈다. DNA 메틸화를 조절해 분화를 억제하고 표피와 다른 조직의 체세포에서 자가 재생이 지속되도록 하기 위해 DNA 결합 단백질, DNA 수리, 비코딩 RNA와 같은 특정 메커니즘 경로를 더욱 명확히 하기 위한 향후 연구가 필요할 것이다. 이러한 질문들을 해결하면 배아 줄기세포 분화를 제어하는 데 있어 DNA 메틸화의 후생유전학 규제기관의 중심적 역할에 대한 최근 연구 결과에 대한 통찰력을 넓히는 데 도움이 될 것이다.^[5]

참조