평형 전개

생화학에서 평형 전개는 온도나 압력을 변화시키거나 pH, 화학적 불포화물을 첨가하거나 원자력 현미경 팁과 같이 힘을 가하는 등 점차 환경을 변화시켜 단백질이나 RNA 분자를 전개하는 과정이다.^[1][2] 모든 단계에서 평형을 유지했다면, 이론적으로 평형 폴딩 중 공정을 되돌릴 수 있어야 한다. 평형 펼침은 단백질이나 RNA 구조의 열역학적 안정성, 즉 접힘 상태와 펼침 상태 사이의 자유 에너지 차이를 결정하는 데 사용될 수 있다.

이론적 배경

가장 단순한 형태에서 평형팽창은 분자가 접힌 상태(일반적으로 "원형" 상태를 나타내는 N)와 펼쳐진 상태(일반적으로 U를 나타내는 U)의 두 열역학적 상태에만 속할 수 있다고 가정한다. 단백질 접힘의 이 "전원 또는 단원" 모델은 1945년 팀 앤슨에 의해 처음 제안되었지만,^[3] 작은 단일 구조 영역의 단백질만을 수용하는 것으로 믿어진다(잭슨, 1998). 더 큰 영역과 다중 도메인 단백질은 종종 중간 상태를 나타낸다. 통계 역학에서 흔히 볼 수 있듯이 이러한 상태는 하나의 순응만이 아니라 분자 순응의 앙상블에 해당한다.

분자는 단순한 운동모델에 따라 토착상태와 펼침상태 사이에서 전환될 수 있다.

N ⇌ U

접이식( N ${\$ {$U -$> N 및 펼침( U ${\$displaystyle {\n -> U에 대한$$ 비율 상수 ${\displaystyle k_{}}$${\$$u$$}}$와 반응(: N ${\deplaysty$}). The dimensionless equilibrium constant ${\displaystyle K_{eq}\ {\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{u}}{k_{f}}}={\frac {\left[{\ce {U}}\right]_{eq}}{\left[{\ce {N}}\right]_{eq}}}}$ can be used to determine the conformational stability $$${\displaystyle \mathrm{\Delta }}$ ${\displaystyle {}^{}}$ ${\displaystyle o^{}}$ ${\$ G$^{o}$ 등식 기준$$

${\displaystyle \Delta G^{o}=-RT\ln K_{eq}}}$

여기서 $R{\displaystyle }$ ${\displaystyle R}$은(는) 기체 상수이고 $T{\displaystyle }$ ${\displaystyle T}$은 켈빈 단위의 절대 온도다. 따라서 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle {}^{}}$ ${\displaystyle o^{}}$ ${\$은(는) 펼침 상태가 토착 상태에 비해 덜 안정적(즉, 바람직하지 않은) 경우 양성이 된다$$.

2상태 접이식 분자의$$ 순응 안정성 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle {}^{}}$ ${\displaystyle o^{}}$ ${\$ G$^{o}}}$을(를) 가장 직접적으로 측정하는 방법은 관심 솔루션 조건에서 운동$$ 속도 ${\displaystyle {상수}_{}}$ k ${\$ 및$$ $k{\displaystyle {}_{}}$ ${\$를 측정하는 것이다. 그러나 단백질 폴딩은 일반적으로 밀리초 내에 완료되기 때문에 그러한 측정은 수행하기가 어려울 수 있으며, 일반적으로 값비싼 정지 유량 또는 (더 최근에는) 연속 흐름 혼합기가 높은 시간 분해능으로 폴딩을 자극해야 한다. 이중 편광 간섭측정법은 ${\displaystyle {}^{}}$ G ${\displaystyle o^{}}${\$displaystyle \Delta$ G$^{o}}$를 직접 측정하는 신흥 기법이다$.$

화학 변성

덜 광범위한 평형 전개 기법에서는 접었다 펴졌다 하는 분자의 분율(${\displaystyle p_{}}$N {\$displaystyle p_{$N$$} ${\displaystyle {및}_{}}$ p$$U {\$displaystyle p_{{$N}로 표시됨)이 나타난다.$각각$ U$\})$는 구아니디늄 염산염이나 요소와 같은 디나포렌트를 첨가하여, 토착 상태를 선호하는 것에서 전개 상태를 선호하는 것으로 용액 조건이 점차 변경됨에 따라 측정한다(평형 폴딩에서는 역 과정을 수행한다). 분수의 합이 1이어야 하고 그 비율이 볼츠만 인자에 의해 주어져야 한다는 점을 고려하면, 우리는 다음과 같다.

${\displaystyle p_{N}={\frac {1}{1+e^{-\Delta G/RT}}}}}}$

${\displaystyle p_{U}=1-p_{{N}={\frac {e^{-\Delta G/RT}{1+e^{-\Delta G/RT}}={\frac {1}{1+e^{\\델타 G/RT}}$

단백질 안정성은 일반적으로 불포화성 농도에 따라 선형적으로 변화하는 것으로 확인된다. 이 관찰에 대해 설명하기 위해 다수의 모델이 제안되었다. 여기에는 변성제 결합 모델, 용제 교환 모델(둘 다 John Schellman에^[4] 의한)과 선형 외삽 모델(LEM; Nick^[5] Pace에 의한)이 포함된다. 모든 모델은 변성 시 두 개의 열역학적 상태만 채워지거나 채워지지 않는다고 가정한다. 그들은 더 복잡한 대응 계획을 해석하기 위해 확장될 수 있다.

변성체 결합 모델은 변성체가 유효(평균) 결합 상수 k로 결합하는 단백질 분자(접히거나 펴짐)에 특이하지만 독립적인 부위가 있다고 가정한다. 평형은 접힌 상태에 비해 불포화도에 대한 결합 부위가 더 많기 때문에 높은 불포화도로 펼쳐지는 상태로 이동한다(${\displaystyle \mathrm{\Delta n}}$ ${\displaystyle \Delta n}).$ 즉, 펼쳐진 상태에서 노출되는 잠재적 사이트 수가 증가하는 것은 변성 전환의 원인으로 보인다. 기본적인 치료는 다음과 같은 기능적 형태를 띤다.

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\ln \left(1+k[D]\오른쪽)}$

여기서 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle w_{}}$ w ${\$는 물에 있는 단백질의 안정성이고$$ [D]는 변성제 농도다. 따라서 이 모델을 사용한 변성 데이터의 분석에는 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ G ${\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle w_{}}$ ${\$ ${\displaystyle \mathrm{\Delta n}}${\$displaystyle \Delta$ n$\},$ k의 7개 매개변수가 필요하다.

셸먼의 용제 교환 모델('약한 결합 모델' 또는 '선택적 용해'라고도 함)은 단백질 상의 독립된 부지에 묶인 물 분자와 용액의 불포화 분자 사이의 평형 개념을 환기시킨다. 형식은 다음과 같다.

${\displaystyle \Delta G=\Delta G_{w}-RT\Delta n\\ln \left(1+(K-1)X_{D}\right)}$

여기서 $K{\displaystyle }$ ${\displaystyle K}$은(는) 교환 반응에 대한 평형 상수이고 X ${\displaystyle d_{}}${\displaystyle $X_{d}}$은 용액 내 변성제의 몰 굴절이다. 이 모델은 불포화성 분자가 실제로 단백질에 결합하는지, 아니면 단지 불포화물이 실험에 사용되는 고농도, 즉 비특정 효과에서 총 용액 부피의 약 20~30%를 점유하고 있기 때문에 '약한 결합'이라는 용어에 대한 질문에 답하려고 한다. 변성제 결합 모델에서와 같이, 이 모델에 적합하려면 7개의 매개변수도 필요하다. 이 두 모델에서 얻은 하나의 일반적인 테마는 요소와 구아니디늄 염산염의 결합 상수(어금 눈금)가 작다는 것이다: ~ 0.$2M{\displaystyle {}^{}}$- ${\displaystyle 1^{}}$ ${\$ 스타일 $M^{-1},$ GuHCL의 경우$$$$ 0.$6M{\displaystyle {}^{}}$- ${\displaystyle 1^{}}$ ${\$ M$^{-1}.$

직관적으로 접힌 상태와 펼쳐진 상태의 결합부위 수 차이는 접근 가능한 표면적의 차이에 정비례한다. 이것은 변성체 농도에 대한 안정성의 단순한 선형 의존을 가정하는 LEM의 기초를 형성한다. 안정성 그림 대 불포화도 농도의 결과 기울기를 m-값이라고 한다. 순수한 수학적 용어로 m-값은 변성화합물을 첨가함에 따른 안정화 자유 에너지 변화의 파생물이다. 그러나, 펼 때 노출되는 접근 가능한 표면적(ASA) 사이의 강한 상관관계, 즉 연구된 단백질(dASA)의 펼침과 접힘 상태 사이의 ASA의 차이와 m-값은 Pace와 동료에 의해 문서화되었다.^[5] 이러한 관측에 비추어 볼 때 m-값은 일반적으로 dASA에 비례하는 것으로 해석된다. LEM에 대한 물리적 근거는 없으며 용제 부조화 데이터를 해석하는 데 널리 사용되지만 순수하게 경험적이다. 일반적인 형태:

${\displaystyle \Delta G=m\left([D]_{1/2}-[D]\right)}$

어디 산 비탈 m{m\displaystyle}라고 부른다"m-value"(위의 정의로 사용하여<>;0)과[D]1/2{\displaystyle \left[D\right]_{1/2}}(또한 Cm을 불렀다)는 분자의 50%이 겹치는 변성제 집중력 전환하는 자세한 내용은 변성 중간점,p N)pU=1/를 나타냅니다. 2${\displaystyle p_{N}=p_{$$U}=1/2$} $$.

실제로 서로 다른 변성체 농도에서 관측된 실험 데이터는 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle G}$ ${\displaystyle \Delta G$에 대한 이 기능적 형식을 가진 2-상태 모델과 접힘 및 펼침 상태의 선형 기준선에 적합하다. $m{\displaystyle }$ ${\displaystyle m}$과$({\displaystyle {와)}_{}}$ [${\displaystyle {\mathrm{}}_{}}$] ${\displaystyle {1\mathrm{}}_{}}$/ 2 {\$displaystyle \좌측[D\우측]_{1/2$}}은 선형 기준선(각 라인에 대한 기울기와 절편)에 대한 다른 4개와 함께 두 개의 적합 매개변수로 되어$$ 있으며, 경우에 따라 기울기는 0으로 가정하여 총 4개의 적합 매개변수를 제공한다. 적합성 안정성 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle G}$ ${\displaystyle \Delta G}$은(는) 적합 $매개변수{\displaystyle }$ m ${\displaystyle m}$ 및$$${\displaystyle {}_{}}$[${\displaystyle D_{}}$ ${\displaystyle {]}_{}}$ ${\displaystyle {\mathrm{}}_{}}$/ ${\displaystyle {2\mathrm{}}_{}}$ ${\$ 모든 불포화성 농도에 대한 값을 계산할 수 있다$$$.$ 접이식 전환 상태에서 매립 소수성 표면의 양을 대략 추정하는 데 사용된다.

구조 탐침

불행히도 p ${\displaystyle N_{}}$ ${\$ $확률$과 ${\displaystyle p_{}}$ U$${\$displaystyle p_{{}$$U}}$은(는) 직접 측정할 수 없다$$. 대신 다양한 구조 탐침을 사용하여 접힌 분자의 상대적 모집단을 분석한다. 예를 들어 흡광도는 287nm(트립토판과 티로신의 용매 노출을 보고함), 극초선 원형 이분법(단백질의 이차 구조를 보고함), 이중 편광 간섭계(반복)분자 크기와 접히는 밀도)와 근사치 형광(트립토판과 티로신 환경의 변화를 보고한다). 그러나 거의 모든 접힌 구조물에 대한 탐침이 작동할 것이다. 평형 상태에서 측정하기 때문에 고시간 분해능이 필요하지 않다. 따라서 NMR 화학적 이동, 내인성 점성, 시스테인과 같은 사이드 체인의 용제 노출(화학 반응도), 프로테아제에 대한 백본 노출 및 다양한 유체역학 측정으로 측정할 수 있다.

이러한 관측치를 확률 ${\displaystyle p_{}}$ N ${\$ 및 ${\displaystyle p_{}}$ U ${\$로 변환하려면$U$ 일반적으로 관찰 $가능$한 A ${\displaystyle A}$이(가) $두{\displaystyle {}_{}}$ 값 중 하나를 채택한다고$$ 가정함. A N ${\$ 또는$$ ${\displaystyle A_{}}$ $U{\displaystyle {}_{}}$ ${\$$U$ 각각 원시 상태 또는 펼쳐진 상태에 해당된다. 따라서 관측값은 선형 합과 같다.

${\displaystyle A=A_{N}p_{N}+A_{{N}U}p_{U}}}$

다양한 솔루션 조건에서$$ $A{\displaystyle }$ ${\displaystyle A}$의 관측치를 이 기능 양식에 맞추면 $A{\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle N_{}}$ ${\$ 및 A ${\displaystyle U_{}}$ ${\$N}를$$ 추정할 수 있다.$U}}$, as well as the parameters of ${\displaystyle \Delta G}$. The fitting variables ${\displaystyle A_{N}}$ and ${\displaystyle A_{U}}$ are sometimes allowed to vary linearly with the solution conditions, e.g., temperature or denaturant concentration, when the asymptotes of ${\displaystyle A}$ are ob강하게 접히거나 강하게 펼쳐지는 조건에서 선형적으로 변화하도록 제공된다.

열변성

Assuming a two state denaturation as stated above, one can derive the fundamental thermodynamic parameters namely, ${\displaystyle \Delta H}$, ${\displaystyle \Delta S}$ and ${\displaystyle \Delta G}$ provided one has knowledge on the ${\displaystyle \Delta C_{p}}$ of the system under investigation.

변성의 열역학적 관측 가능성은 다음과 같은 방정식으로 설명할 수 있다.

${\displaystyle {\begin{aligned}\Delta H(T)&=\Delta H(T_{d})+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT\\&=\Delta H(T_{d})+\Delta C_{p}[T-T_{d}]\\\Delta S(T)&={\frac {\Delta H(T_{d})}{T_{d}}}+\int _{T_{d}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&={\frac {\delta H(T_{d}}}}}}}}{T}}\Delta C_{p}d}\Delta C_{p}\ln T\&}}}}}}}}}}}}}}}}}T_{d}}}+\Delta C_{p}\ln {\frac {T}{T_{d}}}\\\Delta G(T)&=\Delta H-T\Delta S\\&=\Delta H(T_{d}){\frac {T_{d}-T}{T_{d}}}+\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}dT-T\int _{T_{d}}^{T}\Delta C_{p}d\ln T\\&=\Delta H(T_{d})\left(1-{\frac {T}{T_{d}}\오른쪽)-\Delta C_{p}\왼쪽[]T_{d}-T+T\ln \left({\frac {T}){T_{d}}\오른쪽)\오른쪽]\끝{정렬}}$

여기서 ${\displaystyle \Delta \mathrm{}}$ ${\displaystyle H}$ ${\displaystyle \Delta$ H$},$${\displaystyle \Delta }$ S ${\displaystyle \Delta$ ${\displaystyle S}$$}$ 및$$ ${\displaystyle \Delta \mathrm{}}$ G ${\displaystyle \Delta G}$은 일정한 pH 및 압력 하에서 펼쳐지는 엔탈피, 엔트로피 및 깁스 자유 에너지를 나타낸다$$. 온도 ${\displaystyle T}$ ${\displaystyle$\$T}$은(는) 시스템의 열 안정성을 조사하기 위해 변화하며$$, ${\displaystyle T{}_{}}$ ${\displaystyle d_{}}$ ${\$\$T_{d}$는 시스템 내 분자의 절반이 펼쳐지는 온도다$$. 마지막 방정식은 깁스-헬름홀츠 방정식으로 알려져 있다.

단백질의 열 용량 결정

원칙적으로 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle \text{C}}$ ${\displaystyle \text{p}}$ ${\$이(가) 온도와 무관하다고$$ 가정할 때 시스템의 단일 차동 스캐닝 열측량으로부터 위의 열역학적 관측 가능함을 모두 계산할 수 있다. 단, ${\displaystyle \text{Δ}}$ C ${\displaystyle \text{p}}${\$displaystyle${\$ce${\$Delta C_p}$에 대한 정확한 값을 이런 식으로$$ 구하기는 어렵다. 보다 정확히 말하면 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle \text{C}}$ ${\displaystyle \text{p}}$ p$${\$displaystyle {\ce${\$Delta C_p}}$은(는) ${\displaystyle \text{Δ}}$H (${\displaystyle \text{T}}$ ${\displaystyle \text{d})}$ ${\${\ce {\$ce {\delta$ H$(T_d)}$ 대$$(와)의 차이에서 파생될 수 있다$$. ${\displaystyle }$pH나 단백질 농도의 약간의 변화로 측정하여 얻을 수 있는$$ ${\displaystyle \text{T}}$ ${\displaystyle \text{d}}$ ${\$디스플레이 $스타일 {\ce {T_d}}.$ 선형 적합의 기울기는 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle \text{C}}$ ${\displaystyle \text{p}}$ p$${\$displaystyle {\ce {\Delta C_p}}$과 같다. 참고로$,$ 데이터 점의 비선형성은 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle {}_{}}$ p ${\displaystyle p_{}}${\$displaystyle \Delta C_{p}}}}$가 아마도$$ 온도와 무관할 것이다.

또는 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle \text{C}}$ ${\displaystyle \text{p}}$ p$${\$displaystyle${\$ce${\$Delta C_p}}$은(는) 열변성 전과 후 단백질의 접근 가능한 표면적(ASA)을 계산하여 다음과 같이 추정할 수 있다$$.

${\displaystyle {\ce {\Delta ASA}={\ce {ASA_{unfolded}}-{\ce {ASA_{native}}}}}}:{\ce {ASA_{native}}}}}}}}}}$

알려진 3d 구조를 가진 단백질의 경우 ${\displaystyle {\text{ASA}}_{}^{}}$ ${\displaystyle {\text{네이티브}}_{}^{}}$ $displaystyle {\ce {ASA_{native}}}$은(는) Deepview(스위스 PDB 뷰어라고도 함)와 같은 시스템 프로그램을 통해 계산할 수 있다$$. ${\displaystyle {\text{ASA}}_{}^{}}$ $displaystyle{\ce {ASA_{unfolded}}}}}}}$은(는) 반감기 방정식을 통해 각 아미노산의 표화된 값에서 계산할 수 있다$$.

${\displaystyle {\ce {ASA_{unfolded}}}=\left(a_{{\ce {polar}}}\times {\ce {ASA_{polar}}}\right)+\left(a_{{\ce {aromatic}}}\times {\ce {ASA_{aromatic}}}\right)+\left(a_{{\ce {nonpolar}}}\times {\ce {ASA_{nonpolar}}}\right)}$

여기서 첨자는 극성, 비극성 및 방향족으로 자연적으로 발생하는 20개의 아미노산 부분을 나타낸다.

마지막으로 단백질의 경우 $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle \text{ASA}}$ ${\$과(와) $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ C ${\displaystyle \text{p}}$ ${\ce$ {\$Delta$ C_p$}$ 사이에 다음과 같은 방정식을 통해$$ 선형 상관관계가 있다.^[6]

${\displaystyle {\ce {\Delta C_p}=0.61\time {\ce {\Delta ASA}}$

2-상태 전개 평가

나아가 위에서 설명한 2개 상태 전개에 따라 접기가 진행되는지 여부를 평가할 수 있다. 이는 변성의 열량 엔탈피(calorimetric entalpy) 즉, 피크 아래의 면적, A $피크{\displaystyle {}_{}}$($){\$를 다음과 같이 설명한 밴 't Hoff 엔탈피'와$$ 비교함으로써 차등 스캐닝 칼로리메트로 수행할 수 있다.

${\displaystyle \Delta H_{vH}(T)=-R{\frac {d\ln K}{dT^{-1}$

$at{\displaystyle }$ T${\displaystyle }$= ${\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle d_{}}$ ${\$ $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle v_{}}$ ${\displaystyle H_{}}$( T ${\displaystyle d_{}}$)$${\$displaystyle \Delta H_{vH}(T_{d})$는 다음과 같이 설명할$$ 수 있다.

${\displaystyle \Delta H_{vH}(T_{d})={\frac {RT_{d}^{2}\Delta C_{p}^{\max}{A_{\text{peak}}}}}}}}}}}}}}}}}}$

2-상태 전개가 관찰되면 A ${\displaystyle {\text{피크}}_{}}$= ${\displaystyle \mathrm{\Delta }}$ ${\displaystyle {}_{}}$ ${\displaystyle v_{}}$ H${\displaystyle {}_{}}$(${\displaystyle T_{}}$ d${\displaystyle {}_{}}$) ${\displaystyle A_{\text{peak}}=\Delta H_{vH}(T_{d})}$. $\Delta {\displaystyle \mathrm{}}$ ${\displaystyle {}_{}^{}}$ ${\displaystyle p_{}^{}}$ ${\displaystyle {max}_{}^{}}$ ${\$은 열 용량 피크 높이 입니다.

단백질 복합체 및 다중 도메인 단백질에 대한 일반화

위의 원리를 이용하여 평형상태의 접히는 상태에 해당하는 전지구 단백질 신호와 온도나 화학분자 중 어느 하나에 해당하는 변성제의 가변값과 관련된 방정식을 모노머에서 트리머 및 잠재적으로 테트라머에 이르는 균질하고 이질적인 단백질에 대해 도출해냈다. 이러한 방정식은 복잡한 단백질의 안정성을 측정하고, 야생형 및 돌연변이 단백질의 안정성을 비교하기 위한 강력한 이론적 근거를 제공한다.^[7] 그러한 방정식은 수학적 한계(Abel-Ruffini 정리) 때문에 더 높은 과점자의 펜타머에 대해 도출될 수 없다.

참조

이 글은 일반적인 참고문헌 목록을 포함하고 있지만, 그에 상응하는 인라인 인용구가 충분하지 않기 때문에 대체로 검증되지 않은 상태로 남아 있다. 좀 더 정밀한 인용구를 도입하여 이 기사를 개선할 수 있도록 도와주십시오. (2011년 5월) (이 템플릿 메시지를 제거하는 방법과 시기 알아보기)

추가 읽기

• 페이스 CN(1975) "구체 단백질의 안정성", CRC 생화학 비평, 1-43.
• 산토로 MM과 볼렌 DW.(1988) "선형 외삽법에 의해 결정되는 자유 에너지 변화 1. 다른 변성제를 사용한 페닐메탄네술포닐 α-치모트립신 전개" 생화학, 27, 8063–8068.
• 프리발로프 PL(1992) "단백질 접힘, TE Creighton, Ed, W. H. Freeman, 페이지 83–126"의 "단백질 접힘 순응의 안정성을 위한 물리적 기반".
• 야오 M과 볼렌 DW. (1995) "데나투란트 유도 전개 자유 에너지 측정은 얼마나 유효한가? 리보누클레스 A 안정성 확장 범위에 대한 일반 가정에 대한 적합성 수준," 생화학 34, 3771–3781.
• 잭슨 SE(1998) "작은 단일 도메인 단백질이 어떻게 접히나?", 폴딩 앤 디자인, 3, R81-R91.
• Schwehm JM과 Stites WE.(1998) "단백질 순응 안정성 결정을 위한 자동화된 방법의 적용", 효소법, 295, 150–170.