면역 침강

Immunoprecipitation

면역침강(IP)은 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 단백질 항원을 용액 밖으로 침전시키는 기술이다.이 과정은 수천 개의 다른 단백질을 포함하는 샘플에서 특정 단백질을 분리하여 농축하는 데 사용될 수 있습니다.면역침강은 시술의 어느 시점에서 항체가 고체 기질에 결합되어야 합니다.

종류들

개별단백질면역침강(IP)

많은 다른 단백질을 포함한 용액에서 특정 단백질을 분리하기 위해 알려진 단백질에 특정한 항체를 사용하는 것을 포함한다.이러한 용액은 종종 식물이나 동물 조직의 조용액 형태일 것이다.다른 샘플 유형은 체액이나 생물학적 기원의 다른 샘플일 수 있습니다.

단백질복합체면역침강(Co-IP)

온전한 단백질 복합체(즉, 결합된 단백질 또는 리간드와 함께 항원)의 면역 침강은 공동 면역 침강(Co-IP)으로 알려져 있다.Co-IP는 더 큰 단백질 복합체의 구성원으로 여겨지는 알려진 단백질을 표적으로 하는 항체를 선택함으로써 작용한다.이 알려진 부재를 항체로 표적화함으로써 전체 단백질 복합체를 용액 밖으로 끌어낼 수 있고, 따라서 복합체의 알려지지 않은 부재를 식별할 수 있다.

이것은 복합체에 포함된 단백질이 서로 단단히 결합할 때 작용하며, 항체로 하나의 구성원에 달라붙음으로써 복합체의 여러 구성원을 용액 밖으로 끌어낼 수 있게 한다.단백질 복합체를 용액에서 끌어내는 이러한 개념을 "풀다운"이라고 부르기도 합니다.Co-IP는 분자생물학자들이 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위해 정기적으로 사용하는 강력한 기술이다.

  • 특정 항체는 종종 에피토프를 노출시킨 표적 단백질의 하위 집단을 선택하기 때문에 에피토프를 숨기는 복합체의 단백질을 식별하지 못한다.이는 항체를 다량 사용하더라도 단일 항체로 주어진 단백질의 절반이라도 침전시키는 것이 거의 불가능하다는 점에서 볼 수 있다.
  • 표적화 및 면역침수가 연속적으로 이루어짐에 따라 확인된 단백질의 수는 계속 증가할 수 있다.확인된 단백질은 주어진 시간에 단일 복합체에 존재하지 않을 수 있지만, 대신에 다른 목적을 위해 서로 다른 시간에 상호작용하는 단백질의 네트워크를 나타낼 수 있다.
  • 단백질 복합체의 다른 구성원을 대상으로 실험을 반복하면 연구자가 결과를 다시 확인할 수 있다.풀다운을 할 때마다 원래 알려진 단백질뿐만 아니라 이전에 확인된 복합체의 다른 구성 요소(그리고 새로운 추가 구성 요소)가 모두 회복되어야 한다.이러한 방법으로 면역 침투를 반복함으로써, 연구원은 단백질 복합체의 확인된 각 구성원들이 유효한 식별이었다는 것을 검증한다.특정 단백질이 알려진 구성원 중 한 명을 대상으로만 회수될 수 있고 알려진 구성원 중 다른 구성원을 대상으로 하지 않을 경우 복합체의 구성원으로서의 해당 단백질의 지위에 의문이 제기될 수 있다.

염색질면역침강(ChIP)

ChIP 시퀀스 워크플로우

염색질면역침강(ChIP)은 특정 단백질에 대한 게놈의 DNA 결합부위 위치를 결정하기 위해 사용되는 방법이다.이 기술은 단백질의 그림을 보여준다-살아있는 세포나 조직의 핵 안에서 일어나는 DNA 상호작용.이 방법의 생체 내 특성은 동일한 질문에 대답하기 위해 전통적으로 채택된 다른 접근법과 대조적이다.

이 분석을 뒷받침하는 원리는 살아있는 세포에서 DNA 결합 단백질(전사인자와 히스톤 포함)이 결합하고 있는 DNA와 가교될 수 있다는 것이다.추정 DNA 결합 단백질에 특정한 항체를 사용함으로써 단백질을 면역 침강시킬 수 있다.세포 용해액에서 나온 DNA 복합체.가교 작용은 종종 세포(또는 조직)에 포름알데히드를 도포함으로써 이루어지지만, 때로는 디메틸 3,3µ-디티오비스프로피오니데이트-2 HCl(DTBP)[1]과 같이 보다 정의되고 일관된 가교 작용제를 사용하는 것이 유리하다.가교 후 세포는 용해되고 음파 처리를 통해 0.2~1.0kb 길이의 조각으로 DNA가 분해된다.이 시점에서 면역침착이 수행되어 단백질이 정제된다.DNA 콤플렉스정제단백질-그 후 DNA 복합체를 가열하여 단백질과 DNA 복합체의 포름알데히드 가교 작용을 역전시켜 DNA가 단백질로부터 분리되도록 한다.분리된 DNA 조각의 동일성과 양은 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 결정될 수 있다.분리된 단편에서 PCR을 실행하는 제한은 올바른 PCR 프라이머를 생성하기 위해 어떤 게놈 영역이 대상이 되는지 알아야 한다는 것입니다.때때로 이러한 제한은 분리된 게놈 DNA를 플라스미드 벡터로 복제하고 그 벡터의 복제 영역에 특정한 프라이머를 사용함으로써 회피된다.또는 단백질이 게놈 전체에 걸쳐 결합하는 위치를 찾고 싶을 때 ChIP 염기서열처리가 사용되며, 최근에는 단백질 결합 부위를 높은 처리량과 비용 효율이 높은 방법으로 국소화할 수 있는 표준 기술로 부상하고 있으며, 또한 Cistrome의 특성화를 가능하게 하고 있다.이전에는 DNA 마이크로 어레이(ChIP-on-chip 또는 ChIP-chip)도 사용되었습니다.

RNP면역침강(RIP)

위에서 설명한 염색질 면역침강(ChIP)과 유사하지만 ChIP에서와 같이 DNA 결합 단백질을 목표로 하는 것이 아니라 RNP 면역침강은 리보핵단백질(RNPs)[2]을 목표로 한다.살아있는 세포를 먼저 용해시킨 후 대상 단백질 및 관련 RNA를 대상 단백질을 대상으로 하는 항체를 사용하여 면역침투한다.정제된 RNA-단백질 복합체는 RNA 추출을 통해 분리될 수 있으며, RNA의 동일성은 cDNA 염기서열결정[3] 또는 RT-PCR로 결정될 수 있다.PAR-CLIP와 같은 RIP의 일부 바리안트에는 가교 스텝이 포함되어 있기 때문에 주의할 필요가 없습니다.

태그 부착 단백질

태그 부착 단백질을 사용한 풀다운 검사

면역 침강에 대한 주요 기술적 장애물 중 하나는 특별히 알려진 단일 단백질을 목표로 하는 항체를 생성하는 데 큰 어려움이다.이 장애를 피하기 위해, 많은 그룹은 관심 단백질의 C 또는 N 말단 중 하나에 태그를 엔지니어링합니다.여기서의 장점은 같은 태그를 많은 다른 단백질에 계속해서 사용할 수 있고 연구자는 매번 같은 항체를 사용할 수 있다는 것이다.태그 부착 단백질을 사용하는 것의 이점은 매우 커서 이 기술은 위에서 설명한 모든 유형의 IP를 포함한 모든 유형의 면역 침강에 대해 보편화되었습니다.사용되는 태그의 예로는 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 글루타티온-S-전달효소(GST) 태그 및 FLAG 태그가 있습니다.풀다운을 가능하게 하는 태그의 사용은 편리하지만, 태그 자체가 네이티브 상호작용을 모호하게 하거나 새롭고 부자연스러운 상호작용을 일으킬 수 있기 때문에 생물학적 관련성에 대한 우려를 제기한다.

방법들

면역강화를 위한 두 가지 일반적인 방법은 직접포착법과 간접포착법이다.

직접적인

특정 단백질(또는 단백질군)에 특유한 항체는 초파라매틱 마이크로비드 등의 고체상 기질 또는 현미경 아가로스(비자성) 비즈에 고정된다.결합된 항체를 가진 구슬은 단백질 혼합물에 첨가되고, 항체에 의해 표적이 된 단백질은 항체를 통해 구슬에 포착된다; 다시 말해, 그들은 면역 침강화된다.

간접적인

특정 단백질 또는 단백질 그룹에 특정한 항체는 단백질의 혼합물에 직접 첨가된다.항체는 아직 고체상 지지대에 부착되지 않았다.항체는 단백질 혼합물 주위를 자유롭게 떠다니며 표적들을 결합합니다.시간이 지남에 따라 항체와 단백질의 혼합물에 단백질 A/G로 코팅된 비즈가 첨가된다.이 시점에서 항체는 표적에 결합되어 있으며, 구슬에 달라붙게 됩니다.

이 시점부터 샘플의 성분이 같기 때문에 직접 및 간접 프로토콜이 수렴됩니다.두 방법 모두 단백질 또는 단백질 복합체가 비즈에 고정되는 항체에 결합되어 동일한 최종 결과를 얻을 수 있다.

선택.

단백질 타겟의 농도가 낮거나 단백질에 대한 항체의 특이적 친화력이 약할 때 간접적인 접근이 바람직할 수 있다.단백질에 대한 항체의 결합 동력이 여러 가지 이유로 느린 경우에도 간접법을 사용한다.대부분의 경우 직접 방식이 기본이고 선호되는 선택입니다.

테크놀로지의 진보

아가로스

역사적으로 대다수의 과학자들이 사용하는 면역 침강에 대한 고상 지원은 고다공성 아가로스 비즈(아가로스 수지 또는 슬러리라고도 함)였습니다.이 기술의 이점은 매우 높은 잠재적 결합 능력입니다. 왜냐하면 실질적으로 아가로스 입자의 전체 스펀지 같은 구조(크기 50~150μm)가 항체 결합과 IP 프로토콜의 모든 측면에 대한 표준 실험실 장비를 사용할 수 있기 때문입니다.r 모든 특수 장비.매우 높은 결합력의 장점은 연구자가 아가로스 비즈를 코팅하기 위해 사용할 수 있는 항체의 양과 신중하게 균형을 이루어야 한다.항체는 비용 제한 요인이 될 수 있기 때문에 캡처해야 하는 단백질의 양(하류에서 수행되어야 하는 분석에 따라 다름)에서 해당 단백질의 양을 결합하는 데 필요한 항체의 양(시스템 비효율성을 설명하기 위해 약간의 과잉이 추가됨)으로 역산하는 것이 최선이다.m) 및 그 특정 양의 항체를 결합하는 데 필요한 아가로스의 양으로 더 거슬러 올라간다.항체포화가 필요하지 않은 경우, 이 기술은 포획된 표적 단백질을 매우 다량 포착하는 능력에서 타의 추종을 불허합니다.여기서 주의할 점은 "대용량 이점"이 "대용량 단점"이 될 수 있다는 것입니다. 이는 세팔로스/아가로스 비즈의 엄청난 결합 용량이 항체로 완전히 포화되지 않았을 때 나타납니다.면역침착 실험에 사용할 수 있는 항체의 양이 면역침착에 사용될 아가로스 비즈를 포화시키기에 충분하지 않은 경우가 종종 발생한다.이러한 경우에, 연구자는 항체로 부분적으로만 코팅된 아가로스 입자로 끝날 수 있으며, 항체로 코팅되지 않은 아가로스 비즈의 결합 능력의 부분은 부착할 수 있는 어떤 것이든 자유롭게 결합할 수 있으며, 결과적으로 용해산 성분의 비특이적인 결합으로 인해 높아진 배경 신호를 초래합니다.데이터를 해석하기 어려울 수 있습니다.이러한 이유로 인해 면역침투를 위해 결합하기를 원하는 항체의 양에 아가로스의 양을 맞추는 것이 신중하다고 주장할 수 있지만, 아가로스 비즈에 대한 비특이적 결합의 문제를 줄이고 특이성을 높이는 간단한 방법은 용해액을 미리 제거하는 것이다.munopreciptation을 강력히 권장합니다.[4][5]

프리클리어

리세이트는 단백질, 지질, 탄수화물 및 핵산의 복합 혼합물이며, IP 항체, 단백질 A/G 또는 비즈 서포트에 대한 비특이적 결합이 일정량 발생하고 면역중복 대상 검출에 부정적인 영향을 미친다고 가정해야 한다.대부분의 경우, 각 면역 침강 실험 시작 시 리산염 사전 제거([6]아래 "프로토콜" 섹션의 2단계 참조)는 면역 침강 전에 세포 리산염에서 잠재적으로 반응하는 성분을 제거하여 IP 비즈 또는 항체에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하는 방법입니다.기본적인 사전 클리어 절차는 아래에 설명되어 있습니다. 여기서 용해액은 비즈만으로 배양된 다음 면역 [6]침강 전에 제거 및 폐기됩니다.단, 이 접근방식은 IP 항체에 대한 비특이적인 결합을 설명하지 않으며, 이는 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.따라서 다른 사전 클리어 방법은 IP 항체 [5]자체 대신 IP 항체와 동일한 항체 서브클래스의 비표적 관련 항체를 사용하는 것을 제외하고 면역 침강에 사용되는 것과 정확히 동일한 성분으로 단백질 혼합물을 배양하는 것이다.이 접근법은 표적 단백질을 포착하지 않고 비특이적 세포 성분을 제거하기 위해 실제 면역 침강만큼 정확한 IP 조건과 성분을 사용하려고 시도합니다(물론 표적 단백질이 비특이적으로 다른 IP 성분과 결합하지 않는 한, 원반을 분석함으로써 적절하게 제어되어야 합니다).용액을 사전 클리어하는 데 사용되는 전용 비즈).표적 단백질은 데이터 해석을 방해하는 비특이적 결합의 위험을 감소시키면서 면역 침강될 수 있다.

초파라매틱 비즈

면역침착의 대부분은 아가로스 비즈로 이루어지지만, 면역침착을 위한 초파라미네틱 비즈의 사용은 IP용 아가로스 비즈의 대안으로 인기를 끌고 있는 새로운 접근법이다.마그네틱 비즈는 아가로스와 달리 고체이며 구슬의 종류에 따라 구형이 될 수 있으며, 각 구슬의 표면에 항체 결합이 제한된다.이들 비즈는 결합능력을 높이는 다공질 중심의 장점이 없지만 자성 비즈는 아가로스 비즈(1~4μm)보다 현저히 작고, 아가로스 비즈보다 부피당 자성 비즈의 수가 많아 자성 비즈의 표면적 대 부피비가 높아 최적의 항체 결합을 실현한다.

시판되는 자성 비즈는 크기 균일성에 따라 단분산 비즈와 다분산 비즈로 분리할 수 있다.마이크로비드라고도 불리는 단분산 비즈는 정확한 균일성을 나타내며, 따라서 모든 비즈는 자석에 대한 결합 능력이나 끌어당기는 정도를 포함한 동일한 물리적 특성을 보인다.다분산 비즈는 단분산 비즈와 크기가 비슷하지만 결합능력과 자기포착에 영향을 미칠 수 있는 크기 변동(1~4μm)이 크다.두 가지 유형의 비즈 모두 면역 침강 용도로 상용화되어 있지만, 일관된 크기, 모양 및 성능으로 인해 고품질의 단분산 초파라매틱 비즈가 자동 프로토콜에 더 이상적입니다.Invitrogen, Thermo Scientific, Millipore를 포함한 많은 회사에서 단분산 및 다분산 초파라매틱 비즈를 제공합니다.

아가로스 대 마그네틱 비즈

마그네틱 비즈의 지지자들은 표준적인 아가로스 비즈 기반 면역침투가 [5]1시간 만에 이루어졌지만, 면역침투 응용을 위한 아가로스 비즈에 비해 단백질[7][8][9] 결합 속도가 더 빠르다고 주장한다.또한 마그네틱 비즈가 매우 큰 단백질 복합체를 면역 침강시키는 데 더 좋다는 주장도 제기되었지만, 이러한 [7][8][10]복합체에 대한 상한이 완전히 없기 때문이다.자기 비드 기술의 특성으로 인해 자기 분리 시료에 대한 물리적 응력이 감소되고 아가로스 사용 시 반복적인 원심 분리 시료[8] 취급이 감소하여 유연한(취약성) 단백질 [8][9][10]복합체의 수율을 높이는 데 크게 기여할 수 있습니다.단, 면역강화 지원 선택 시 결합 능력, 시약 비용, 추가 장비 요구 및 IP 프로세스 자동화 능력 등의 추가 요소를 고려해야 한다.

바인딩 용량

아가로스와 마그네틱 비즈의 지지자들은 두 구슬의 결합 용량의 큰 차이가 특정 유형의 구슬을 선호하는지 여부를 논할 수 있다.비드 대 비드 비교에서 아가로스 비즈는 큰 비드 사이즈와 스펀지 모양 구조로 인해 자성 비즈보다 표면적이 현저하게 크고 결합능력이 크다.그러나 아가로스의 가변적인 모공 크기는 매우 큰 단백질 또는 단백질 복합체의 내부 결합 부위에 결합하는 데 영향을 줄 수 있는 잠재적 상한 크기를 야기합니다. 따라서 자석 구슬은 독립성이 부족하지만 아가로스 구슬보다 면역 촉진 큰 단백질 또는 단백질 복합체에 더 적합할 수 있습니다.두 가지 경우를 모두 입증하는 비교 증거.

일부에서는 비특이적 결합 용량이 크기 때문에 아가로스 비즈의 결합 용량이 현저하게 클 경우 단점이 될 수 있다고 주장한다.다른 사람들은 아가로스의 총 결합 용량을 포화시키는 데 필요한 항체의 양이 더 많기 때문에 자성 구슬의 사용을 주장할 수 있는데, 이는 분명히 아가로스의 경제적 단점이 될 것이다.이러한 주장들은 실제 사용의 맥락 밖에서는 옳지만, 이러한 추론 행들은 면역 침강 원리의 두 가지 주요 측면을 무시합니다. 면역 침강 원리는 아가로스 또는 자기 구슬을 사용하는 결정이 단순히 결합 용량에 의해 결정되는 것이 아니라는 것을 보여줍니다.

첫째, 비특이적 결합은 고정지지체상의 항체결합부위에 한정되지 않으며, 항체의 표면이나 면역침착반응의 성분은 비특이적 리세이트 성분과 결합할 수 있으므로 완전 포화 비즈를 사용해도 비특이적 결합이 여전히 발생한다.따라서 면역 침강을 수행하기 전에 검체를 사전 클리어하는 것이 중요합니다.

둘째, 표적단백질포착능력은 사용하는 고정화항체량에 직접 의존하기 때문에 아가로스와 자성구슬 면역침강의 나란히 비교에서 어느 한쪽이 포집할 수 있는 단백질은 첨가된 항체량에 의해 제한된다.따라서 서포트를 포화시키는 결정은 위의 Agarose 섹션에서 설명한 바와 같이 필요한 단백질의 양에 따라 달라집니다.

비용.

면역침전 응용에 아가로스 또는 마그네틱 비즈를 사용할 때 어느 한 가지 유형의 지지대 사용 가격이 중요한 결정 요인입니다.세파로스 비즈에 비해 마그네틱 비즈의 비용을 먼저 계산하면 세파로스 비즈의 가격이 저렴해 보일 수 있습니다.그러나 마그네틱 비즈는 사용하는 IP 방법 및 IP 반응당 필요한 비즈의 양에 따라 분석 규모의 면역 침전용 Agarose에 비해 가격이 저렴할 수 있다.

IP 반응 시 모든 성분을 튜브에 첨가하는 기존의 면역침강법을 이용하여 각 IP 실험마다 최소량의 비즈(일반적으로 IP당 25~50μl의 비즈 범위)가 필요하다.세파로스 비즈는 원심분리를 통해 튜브 바닥에 농축하고 배양, 세척 등을 한 후 상등액을 제거해야 하기 때문이다.따라서 25~50μl 미만의 아가로스 비즈 알갱이는 튜브 바닥에서 육안으로 식별이 불가능하지 않으면 어렵기 때문에 공정에 절대적인 물리적 제약을 가한다.마그네틱 비즈는 자기 취급에 의해 최소한의 비즈가 필요 없기 때문에 대상 항원 및 IP 항체에 따라 상당히 적은 마그네틱 비즈를 사용할 수 있다.

반대로 일반 마이크로퓨지 튜브 대신 스핀 칼럼을 사용하여 반응당 필요한 아가로스 비즈의 양을 크게 줄일 수 있다.스핀 칼럼에는 간단한 원심분리를 사용하여 비즈를 제외한 모든 IP 성분이 흐를 수 있도록 하는 필터가 포함되어 있으므로 손실을 최소화하면서 훨씬 적은 양의 아가로스 비즈를 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

장비.

앞서 설명한 바와 같이 면역침강용 아가로스 비즈의 사용에는 표준 실험실 장비만 필요하며, 자기 비즈 기반의 IP 반응에는 고출력 자석이 필요합니다.자기포착장비는 비용 대비 효과가 높을 수 있지만, 자성구슬을 사용한 면역침투의 신속한 완료는 재정적으로 이득이 될 수 있다. 왜냐하면 자성구슬을 사용한 30분 프로토콜은 아가로스 구슬을 사용한 하룻밤 배양에 비해 더 많은 데이터가 생성될 수 있기 때문이다.gth of time.[7][8][9] 시간의 gth.

자동화

마그네틱 비즈를 사용하는 것의 추가적인 장점은 자동화된 면역 침강 장치를 더 쉽게 사용할 수 있게 되었다는 것입니다.이러한 디바이스는 IP를 실행하기 위한 작업량과 시간을 줄일 뿐만 아니라 높은 스루풋애플리케이션에도 사용할 수 있습니다.

요약

마그네틱 비즈 사용의 분명한 이점은 반응 속도 향상, 샘플 취급 완화와 자동화 가능성을 포함하지만, 서포트 매체의 결합 용량 및 제품 비용에 기초한 아가로스 또는 마그네틱 비즈 사용 선택은 관심 단백질 및 사용된 IP 방법에 따라 달라질 수 있습니다.모든 검사와 마찬가지로, 어떤 방법이 특정 용도에 최적인지를 판단하기 위해서는 경험적 테스트가 필요하다.

프로토콜

배경

일단 고체 기판 비드 기술이 선택되면, 항체가 비드에 결합되고 항체가 코팅된 비드가 이종 단백질 샘플(예를 들어 균질화된 조직)에 첨가될 수 있다.이 시점에서, 구슬에 고정된 항체는 그들이 특별히 인식하는 단백질에 결합할 것이다.일단 이것이 발생하면, 관심 있는 특정 단백질이 비즈에 고정된 항체에 결합되기 때문에, 프로토콜의 면역 침강 부분은 실제로 완성됩니다.비결합 단백질을 제거하고 배경을 줄이기 위해 세척 단계에서 단백질이 서로(co-IP의 경우) 결합 상태를 유지하고 항체에 결합해야 하기 때문에 리세이트에서 면역콤플렉스의 분리는 매우 중요한 일련의 단계이다.

아가로스 비즈를 사용할 때는 600~3,000 x g(표준 중력보다 두 배)의 힘으로 원심분리기에서 잠시 회전하여 샘플에서 구슬을 발사해야 합니다.이 단계는 표준 마이크로 원심분리 튜브에서 수행될 수 있지만, 보다 빠른 분리, 보다 높은 일관성 및 높은 회수를 위해 종종 액체가 통과하지만 아가로스 비즈가 통과하지 않는 모공 크기의 작은 스핀 칼럼에서 수행됩니다.원심분리 후 아가로스 비즈는 튜브 바닥에서 매우 느슨한 솜털 펠릿을 형성합니다.오염물질이 함유된 상등액은 비즈를 방해하지 않도록 조심스럽게 제거할 수 있습니다.그런 다음 워시 버퍼를 비드에 추가할 수 있으며 혼합 후 원심 분리를 통해 다시 비드를 분리합니다.

초파라매틱 비즈를 사용하면 샘플은 자기장에 배치되어 비즈가 튜브 측면에 모일 수 있습니다.이 절차는 일반적으로 약 30초 안에 완료되며, 나머지(불필요한) 액체는 파이프로 배출됩니다.세척은 (자석으로부터) 비즈를 세척액으로 다시 현탁한 다음 튜브를 다시 자석 위에 올려놓음으로써 이루어집니다.일반적으로 오염 물질을 적절히 제거하기 위해 세척을 여러 번 반복합니다.초파라미네틱 비즈의 크기가 균일하고 자석이 적절히 설계되어 있으면 구슬이 튜브 측면에 균일하게 집중되어 세척액을 쉽고 완전하게 제거할 수 있습니다.

세척 후 침전단백질을 용출시켜 겔전기영동, 질량분석, 웨스턴블로팅 또는 복합체 내 성분을 동정하기 위한 다른 몇 가지 방법으로 분석한다.면역침투에 대한 프로토콜 시간은 다양한 요인에 의해 크게 달라지며, 필요한 세척 횟수 또는 다공질 아가로스 비즈의 느린 반응 속도론에 따라 프로토콜 시간이 증가한다.

순서

  1. 세포를 용해하고 면역침착을 위한 샘플을 준비한다.
  2. 샘플을 비즈 위에 단독으로 전달하거나 관련 없는 항체에 결합하여 IP 구성요소에 특이적으로 결합하지 않는 단백질을 흡수하여 샘플을 미리 제거합니다.
  3. 해당 단백질에 대해 항체로 용액을 배양한다.본 공정 전(직접법) 또는 본 공정 후(간접법) 고체 지지체에 항체를 부착할 수 있다.항체-항원복합체가 형성되도록 배양한다.
  4. 관심 복합체를 벌크 솔루션에서 제거하여 침전시킵니다.
  5. 침전된 복합체를 여러 번 세척한다.아가로스 비즈를 사용할 때는 세척 간격마다 회전시키고, 초파라매틱 비즈를 사용할 때는 자석에 튜브를 씌운 후 상등액을 제거한다.최종 세척 후에는 상등액을 가능한 한 많이 제거한다.
  6. 저pH 또는 SDS 시료 로딩 버퍼를 사용하여 고체에서 단백질을 용출한다.
  7. 관심 있는 복합체 또는 항원을 분석합니다.이것은, 다양한 방법으로 실시할 수 있습니다.
    1. SDS-PAGE(황산나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동)에 이어 겔염색.
    2. SDS-PAGE에 이어 겔염색, 개별 착색단백질 밴드 제거 및 매트릭스 지원 레이저 탈리/이온화(MALDI) 질량 분석법에 의한 밴드 내 단백질 배열 분석.
    3. 항원과 상호작용하는 단백질에 대해 다른 항체를 사용한 전이 및 웨스턴 블롯, 화학 발광 또는 형광 2차 항체를 사용한 검출.

레퍼런스

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