에피토프 매핑

Epitope mapping
Epitope maps provide MOA information
에볼라글리코프로틴(GP)에 대한 항체의 고해상도 상피 지도, 산탄총 돌연변이 유발 상피 매핑을 사용하여 결정.에피토프 맵은 MOA(Mechanism of Action Mechanism)를 결정하기 위한 데이터를 제공한다.

에피토프 매핑은 표적항원(일반적으로 단백질)에 있는 항체의 결합 부위, 즉 "에피토프"를 실험적으로 확인하는 과정이다.[1][2][3]항체 결합 부위의 식별과 특성화는 새로운 치료법, 백신 및 진단법의 발견과 개발에 도움이 된다.[4][5][6][7][8]또한 에피토프 특성화는 항체에[9] 대한 결합 메커니즘을 해명하는 데 도움을 줄 수 있으며 지적 재산(특허) 보호를 강화할 수 있다.[10][11][12]실험용 에피토프 매핑 데이터는 강력한 알고리즘에 통합되어 시퀀스 및/또는 구조 데이터에 기반한 B-셀 에피토프의 실리콘 예측을 용이하게 할 수 있다.[13]상피들은 일반적으로 선형, 순응형, 불연속형의 세 종류로 나뉜다.선형 에피포프는 단백질에 있는 아미노산의 연속적인 순서에 의해 형성된다.적합성 상피에서 결합 잔여물은 헬리컬, 루프 또는 베타 시트와 같은 특정 핵심 단백질 구조 적합성 내에 포함된다.비문의 순응은 결합 잔여물을 올바른 위치에 가져오는데 중요하다.마지막으로 불연속성 상피들은 단백질 순서에서 가깝지는 않지만 3차원 단백질 접힘에 의해 합쳐지는 항원의 부분으로 구성된다.불연속적인 별자리에는 선형적이고 순응적인 부분이 있을 수 있다.B 세포 별자리 매핑 연구는 항원과 항체, 특히 자동항체 및 보호항체(예: 백신) 사이의 대부분의 상호작용이 불연속 별자리 결합에 의존한다는 것을 시사한다.null

항체 특성화 중요성

작용기전에 대한 정보를 제공함으로써 에피토프 매핑은 치료용 단핵항체(mAb) 개발에서 중요한 요소다.예를 들어, 리간드의 결합을 막거나 단백질을 비기능 상태로 가두어 mAb가 그 기능적 효과를 발휘하는 방법을 밝혀낼 수 있다.단백질이 고유(적절하게 접혀진) 상태에 있을 때만 존재하는 많은 치료용 mAbs 표적 순응형 상피들이 상피 매핑을 어렵게 만들 수 있다.[14]에피토프 지도는 오래 지속되는 면역 효과를 주는 항원소자(에피토프)를 결정함으로써 치쿤구냐, [15]뎅기, [16]에볼라,[5][17][18] 지카 바이러스 등 만연하거나 치명적인 바이러스 병원체에 대한 백신 개발에 결정적이었다.[19][20]null

멤브레인 단백질(예: G 단백질 결합 수용체[GPCR])[21]과 다중 단위 단백질(예: 이온 채널)과 같은 복합 표적 항원이 약물 발견의 핵심 대상이다.이러한 복잡한 단백질을 표현하고 정화하는 것이 어렵기 때문에 이러한 표적에 대한 표적을 매핑하는 것은 어려울 수 있다.막 단백질은 종종 지질 빌레이어의 맥락에 있을 때만 정확하게 접히는 짧은 항원 부위(에피토프)를 가지고 있다.그 결과, 이러한 막 단백질에 있는 mAb 상피들은 종종 일치하기 때문에 지도 제작이 더 어렵다.[14][21]null

지적재산권(IP) 보호를 위한 중요성

Epitope maps support IP
HER2에 대한 항체의 산탄총 돌연변이 유발 상피 지도는 새로운 상피(오렌지 구)를 드러냈다.에피토프 맵은 지적재산권(특허권) 청구에 대한 지원 데이터를 제공한다.

치료용 mAbs의 지적재산권(IP)을 보호하는 데 에피토프 매핑이 보편화됐다.항체의 특정 결합 사이트에 대한 지식은 현재와 이전(기존) 항체를 구분하여 특허와 규제 제출을 강화한다.[10][11][22]여러 경쟁 항체에 의해 약물을 투여할 수 있는 잘 검증된 치료 대상(예: PD1과 CD20)에 대해 항체를 특허화할 때 항체를 구별할 수 있는 능력은 특히 중요하다.[23]항체 특허성 검증과 더불어 미국 특허청에 제출된 광범위한 항체 청구를 지원하기 위해 에피토프 지도 데이터가 사용되어 왔다.[11][12]null

에피토프 데이터는 치료용 항체가 표적이 된 특정 단백질 부위에 대한 분쟁과 관련된 몇몇 유명한 법적 사례의 중심이었다.[22]이와 관련하여 암겐 대 사노피/레게논 제약 PCSK9 억제제 사례는 암겐 대 사노피/레게논 치료용 항체가 PCSK9 표면에서 겹치는 아미노산에 결합되어 있음을 보여주는 능력에 달려 있었다.[24]null

방법들

표적 항원의 항체 별자리 매핑에는 다음과 같은 몇 가지 방법이 있다.

  • X선 공동결정법과 극저온 전자현미경 검사(cryo-EM). X선 공동결정학은 항원과 항체 사이의 상호작용을 직접 시각화할 수 있기 때문에 역사적으로 비포프 매핑에 대한 금본위 접근법으로 간주되어 왔다.크라이오-EM은 유사하게 항체-항체-항체-유전 상호작용의 고해상도 지도를 제공할 수 있다.[25]그러나 두 가지 방법 모두 기술적으로 도전적이고, 시간이 많이 걸리며, 비용이 많이 들며, 모든 단백질이 결정화에 순응할 수 있는 것은 아니다.더욱이 이러한 기법은 올바르게 접혀 가공된 단백질의 충분한 양을 얻기 어렵기 때문에 항상 실현 가능한 것은 아니다.마지막으로, 어느 기술도 동일한 아미노산 그룹에 결합되는 mAbs의 주요 에피토프 잔류물(에너제틱 "핫 스폿")[26]을 구별할 수 없다.
  • 어레이 기반 올리고-펩타이드 스캔.중첩 펩타이드 스캔 또는 펩스캔 분석으로도 알려진 이 기법은 대상 단백질의 겹침 및 겹침 없는 세그먼트에서 나오는 올리고펩타이드 시퀀스 라이브러리를 사용하여 관심 항체를 결합하는 능력을 검사한다.이 방법은 빠르고, 비교적 저렴하며, 특히 정의된 대상에 대해 많은 수의 후보 항체를 프로파일링하는 데 적합하다.[20][27]에피토프 매핑 분해능은 사용되는 겹치는 펩타이드의 수에 따라 달라진다.이 접근방식의 주요 단점은 불연속성 에피토프가 더 작은 펩타이드로 분해되어 결합 친화력을 낮출 수 있다는 것이다.그러나 제한된 펩타이드와 같은 기술로 발전이 이루어졌는데, 이는 불연속적인 별자리뿐만 아니라 순응적인 흉내를 내는 데 사용될 수 있다.예를 들어 CD20에 대한 항체는 대상 단백질의 다른 부분에서 추출한 비인접 펩타이드 시퀀스를 결합하고 이 결합 펩타이드에 순응 강성을 가함으로써(예: CLIP scapstolds[29] 사용) 배열 기반 올리고펩타이드 스캐닝을 사용한 연구에서[28] 매핑되었다.펩타이드에 대한 대체 분석은 또한 단일 아미노산 분해능을 허용하며, 따라서 주요 에피토프 잔류물을 정확히 파악할 수 있다.
  • 사이트 지향 돌연변이 유발 매핑.현장지휘 돌연변이 유발(SDM)의 분자생물학적 기법을 사용하여 에피포프 매핑을 가능하게 할 수 있다.SDM에서는 대상 단백질의 순서에 아미노산의 체계적 돌연변이가 도입된다.각 돌연변이 단백질에 대한 항체의 결합을 검사하여 비피를 구성하는 아미노산을 식별한다.이 기법은 선형 및 정합성 형상을 모두 매핑하는 데 사용할 수 있지만, 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며, 일반적으로 소수의 아미노산 잔류물로 분석을 제한한다.[2]
  • 고투과 산탄총 [2][10][30]돌연변이 유발원소 매핑산탄총 돌연변이 유발은 mAbs의 별자리 매핑을 위한 높은 처리량 접근법이다.[30]엽총 돌연변이 유발 기법은 각 복제본이 고유한 아미노산 돌연변이(일반적으로 알라닌 대체)를 포함하고 있는 전체 표적 항원의 돌연변이 라이브러리를 만드는 것으로 시작된다.도서관에서 추출한 수백 개의 플라스미드 클론은 384웰의 미세플라스틱으로 개별적으로 배열되어 인간 세포로 표현되며 항체 결합 여부를 검사한다.항체 결합에 필요한 대상의 아미노산은 면역활동의 상실로 확인된다.이러한 잔여물은 대상 단백질의 구조에 매핑되어 상피를 시각화한다.고투과 엽총 돌연변이 유발상피 매핑의 이점으로는 1) 선형상피와 순응상피질을 모두 식별할 수 있는 기능, 2) 다른 방법보다 검사 시간이 짧은 기능, 3) 적절하게 접혀진 후 변형된 단백질의 표시, 4) 활력 있는 상호작용을 촉진하는 주요 아미노산을 식별할 수 있는 능력 등이 있다.ons (비문의 "핫 스팟"으로 표시.[26][31]
  • 수소-중수소 교환(HDX).이 방법은 항원과 항체의 다양한 부분의 용제 접근성에 대한 정보를 제공함으로써 단백질-단백질 상호작용 영역에서 용제 접근성이 감소되었음을 입증한다.[32]그 장점 중 하나는 본래의 용액에서 항원-항체 복합체의 상호작용 부지를 결정하고, 항원이나 항체에 어떠한 수정(예: 돌연변이)도 도입하지 않는다는 점이다.HDX 에피토프 맵핑은 또한 에피토프 구조에 대한 완전한 정보를 신속하게 제공하는 효과적인 방법이라는 것이 입증되었다.[33]보통 아미노산 수준의 데이터를 제공하지 않지만, 이러한 한계는 신기술 진전에 의해 개선되고 있다.[34]최근에는 복합 단백질 시스템 인플루엔자 헤마글루틴을 예로 [35]들어 빠르고 비용 효율적인 에피포프 매핑 접근법으로 추천되고 있다.
  • 교차 링크 결합 질량 분석.[36]항체와 항원은 라벨이 붙어 있는 교차 링커에 묶여 있으며, 고질량 MALDI 검출로 복잡한 형성이 확인된다.항원에 대한 항체의 결합 위치는 질량분석(MS)으로 확인할 수 있다.교차연계단지는 안정성이 뛰어나 다양한 효소 및 소화조건에 노출될 수 있어 다양한 펩타이드 옵션을 통해 검출이 가능하다.MS 또는 MS/MS 기법은 라벨로 표시된 크로스 링크와 바운드 펩타이드의 아미노산 위치를 검출하는 데 사용된다(상피와 파라토프 모두 하나의 실험에서 결정된다).이 기법의 핵심 장점은 MS 검출의 고감도인데, 이는 재료가 거의 필요하지 않다는 것을 의미한다(마이크로그램 이하).

효모 표시, 페이징 표시 [37]및 제한된 단백질 분해와 같은 다른 방법들은 항체 결합에 대한 높은 투과량 모니터링을 제공하지만 특히 순응적 상피에 대해서는 분해능이 부족하다.[38]null

참고 항목

참조

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외부 링크