전자현미경은 전자빔을 조명의 근원으로 사용하는 현미경입니다.광학광현미경의 유리렌즈와 유사한 전자광학을 사용하여 전자빔을 제어하는데, 예를 들어 확대된 이미지나 전자 회절 패턴을 생성하기 위해 초점을 맞추는 것입니다.전자의 파장이 가시광선의 파장보다 최대 10만 배 더 작을 수 있기 때문에, 전자 현미경은 약 0.1 nm의 훨씬 더 높은 해상도를 가지고 있는데, 이는 빛 현미경의 경우 약 200 nm에 비교됩니다.전자현미경의 다른 뜻은 다음과 같습니다.
많은 발전이 현미경에 사용되는 전자 광학의 기초를 놓았습니다.[1]중요한 단계 중 하나는 1883년[2]헤르츠의 연구로, 정전기와 자기 편향이 있는 음극선관을 만들어 전자빔의 방향 조작을 증명했습니다.다른 것들은 1899년 에밀 비허트에 의한 축방향 자기장에 의한 전자의 집속,[3] 1905년[4]아서 웨넬트에 의한 더 많은 전자를 생산한 산화물 코팅 음극, 1926년 한스 부쉬에 의한 전자기 렌즈의 개발이었습니다.[5]데니스 가보르에 따르면, 물리학자 레오 질라르는 1928년에 그가 전자 현미경을 만들도록 설득하려고 시도했고, 질라르는 이에 대해 특허를 냈습니다.[6]
현재까지도 누가 투과전자현미경을 발명했는지에 대한 문제는 논란의 여지가 있습니다.[7][8][9][10]1928년 베를린 공과대학에서 아돌프 마티아스(Adolf Matthias)는 맥스 놀을 전자빔과 음극선 오실로스코프에 대한 연구를 발전시키기 위한 연구팀을 이끌도록 임명했습니다.그 팀은 에른스트 루스카를 포함한 몇몇 박사과정 학생들로 구성되었습니다.1931년, Max Knoll과 Ernst Ruska는[11][12] 양극 조리개 위에 놓여진 그물망의 확대 이미지를 성공적으로 만들어냈습니다.그림에 나와 있는 복제품인 이 장치는 더 높은 배율을 얻기 위해 두 개의 자기 렌즈를 사용했는데, 이것이 최초의 전자 현미경입니다. (맥스 놀은 1969년에 사망했고, 그래서 1986년에 전자 현미경 발명으로 노벨상의 몫을 받지 못했습니다.)
분명히 이러한 노력과는 무관한 것이 라인홀드 뤼덴베르크의 지멘스 슈케르트 작업이었습니다.특허법(미국 특허 제2058914호[13] 및 제2070318호,[14] 모두 1932년 출원)에 따르면, 그는 전자 현미경의 발명자이지만, 그가 언제 작업 기구를 가졌는지는 명확하지 않습니다.그는 1932년[15] 아주 짧은 기사에서 지멘스가 1932년 특허가 출원되기 전까지 몇 년 동안 이 문제를 연구해 왔으며, 그의 노력이 대학 발전과 병행된다고 주장했습니다.그는 맥스 놀과 매우 유사한 1961년에 사망하여 1986년 노벨상의 몫을 받을 자격이 없었습니다.
이듬해인 1933년, 루스카와 놀은 광학 현미경의 해상도를 초과하는 최초의 전자 현미경을 만들었습니다.[16]4년 후인 1937년, 지멘스는 에른스트 루스카와 보도 폰 보리스의 연구에 자금을 지원했고, 에른스트의 동생인 헬무트 루스카를 이용해 현미경, 특히 생물학적 표본을 이용한 현미경의 응용을 개발했습니다.[16][17]또한 1937년 만프레드 폰 아르덴은 주사 전자 현미경을 개척했습니다.[18]지멘스는 1938년에 최초의 상업용 전자현미경을 생산했습니다.[19]최초의 북미 전자 현미경은 1930년대에 앤더슨과 피츠시몬스에 의해 워싱턴 주립 대학에서, 일라이 프랭클린 버튼과 세실 홀, 제임스 힐리어, 알버트 프레버스에 의해 토론토 대학에서 만들어졌습니다.지멘스는 1939년 투과전자현미경(TEM)을 생산했습니다.[21]현재의 투과전자현미경은 1배 확대에 2백만 번의 확대가 가능하지만, 과학적인 도구로서 그것들은 비슷하지만 향상된 광학을 가지고 있습니다.
전자현미경의 원형인 투과전자현미경(TEM)은 고압의 전자빔을 사용하여 시편을 비추고 이미지를 만듭니다.전자빔은 전자총에 의해 만들어지며, 전자는 일반적으로 40~400keV로 전자기 렌즈에 의해 집속되고, 시료를 통해 전달됩니다.그것이 표본으로부터 나올 때, 전자빔은 현미경의 렌즈에 의해 확대되는 표본의 구조에 대한 정보를 운반합니다.이 정보의 공간적 변화("이미지")는 확대된 전자 이미지를 디텍터에 투영하여 볼 수 있습니다.예를 들어, 형광체 또는 아연 설파이드와 같은 신틸레이터 물질로 코팅된 형광 시청 화면을 사용하여 작업자가 직접 영상을 볼 수 있습니다.고해상도 형광체는 렌즈 광학계 또는 광섬유 도광체를 통해 디지털 카메라의 센서에 연결될 수도 있습니다.직접 전자 검출기는 신틸레이터가 없고 전자빔에 직접 노출되며, 신틸레이터 결합 카메라의 일부 한계를 해결합니다.[23]
TEM의 해상도는 주로 구면 수차에 의해 제한되지만, 새로운 세대의 하드웨어 보정기는 구면 수차를 줄여 고해상도 투과 전자 현미경(HRTEM)의 해상도를 0.5 옹스트롬(50 피코미터) 이하로 증가시켜 [24]5천만 배 이상의 확대를 가능하게 할 수 있습니다.[25]HRTEM이 물질 내 원자의 위치를 결정하는 능력은 나노 기술 연구 개발에 유용합니다.[26]
STEM은 표본에 대한 집중적인 사건 조사를 수행합니다.따라서 TEM의 고해상도는 STEM에서 가능합니다.집속 작용(및 수차)은 전자가 STEM에서 검체에 닿기 전에 발생하지만, 그 후에는 TEM에서 발생합니다.SEM 유사 빔 래스터링의 STEM 사용은 환형 다크 필드 이미징 및 기타 분석 기술을 단순화할 뿐만 아니라 이미지 데이터가 병렬 방식이 아닌 직렬 방식으로 획득됨을 의미합니다.[citation needed]
SEM은 검체를 가로질러 스캔되는 집속 전자 빔으로 검체를 조사하여 이미지를 생성합니다(래스터 스캔).전자빔이 시편과 상호작용할 때, 다양한 메커니즘에 의해 에너지를 잃습니다.손실된 에너지는 열, 저에너지 2차 전자 및 고에너지 후방 산란 전자의 방출, 발광(캐소드 발광) 또는 X선 방출과 같은 대체 형태로 변환되며, 이들은 모두 시료 표면의 지형 및 조성과 같은 특성에 대한 정보를 전달하는 신호를 제공합니다.[citation needed]SEM에 의해 표시되는 영상은 이러한 신호들 중 임의의 신호의 변화하는 세기를 신호가 생성될 때 시편 상의 빔의 위치에 대응하는 위치에 영상으로 매핑합니다.표시된 개미의 SEM 이미지에서 이미지는 대부분의 SEM에서 정상 또는 기존의 이미징 모드인 2차 전자 검출기에 의해 생성된 신호로 구성되었습니다.[citation needed]
일반적으로, SEM의 영상 해상도는 TEM의 영상 해상도보다 낮습니다.그러나 SEM은 내부가 아닌 샘플의 표면을 이미지화하기 때문에 전자가 샘플을 통과할 필요가 없습니다.이를 통해 검체를 전자 투명도로 얇게 만들기 위해 광범위한 검체 준비의 필요성이 줄어듭니다.SEM은 또한 매우 깊은 필드를 가지고 있으므로 샘플의 3차원 표면 모양을 잘 표현하는 이미지를 생성할 수 있습니다.[citation needed]
가장 일반적인 구성에서 전자 현미경은 픽셀당 단일 밝기 값으로 이미지를 생성하며, 결과는 일반적으로 회색 스케일로 렌더링됩니다.[27]그러나 종종 이러한 이미지는 특징 탐지 소프트웨어를 사용하거나 그래픽 편집기를 사용하여 손으로 편집하는 방식으로 채색됩니다.이는 구조를 명확히 하거나 미적 효과를 위해 수행될 수 있으며, 일반적으로 시편에 대한 새로운 정보를 추가하지 않습니다.[28]
냉동 고정 – 물이 유리체 얼음을 형성하도록 시편을 얼립니다.이렇게 하면 표본이 원래 상태의 스냅샷으로 보존됩니다.이러한 유리화를 달성하기 위한 방법으로는 액체 에탄에서의 급속한 급속 동결 및 고압 동결이 있습니다.극저온 전자 현미경이라 불리는 전체 분야가 이 기술로부터 분기되었습니다.유리체 단면의 극저온 전자 현미경(CEMOVIS)[30]과 라멜라의 극저온 이온 빔 밀링의 개발로 이제 원산지에 가까운 거의 모든 생물학적 표본의 샘플을 관찰할 수 있습니다.[31]
내장, 생물학적 표본 – 탈수 후 투과전자현미경에서 관찰할 수 있는 조직이 내장되어 있어 관찰할 수 있습니다.이를 위해 조직은 프로필렌 옥사이드(에폭시프로판) 또는 아세톤과 같은 '전이 용매'를 통과한 다음 아랄다이트, 에폰 또는 더큐판과 같은 에폭시수지로 침투합니다.[32] 조직은 물과 혼합 가능한 아크릴 수지에 직접 내장될 수도 있습니다.수지가 중합(경화)된 후 샘플은 초음파로 절단되고 염색됩니다.[citation needed]
내장, 재료 – 수지에 내장된 후 시편은 보통 초미세 연마재를 사용하여 거울과 같은 마무리로 연마되고 연마됩니다.[citation needed]
동결-파쇄 또는 동결-에칭 – "페이스 온" 관점에서 지질막 및 지질막에 포함된 단백질을 검사하는 데 특히 유용한 제조 방법[33][34][35].[36][37][38]동결-파쇄를 통해 열린 막을 벗겨 내부를 시각화할 수 있습니다.단백질이 갈라진 작은 구멍을 보여주는 베이커 효모 막의 외부 표면, 때로는 작은 고리 패턴.신선한 조직이나 세포 현탁액은 급속하게 동결되고(크라이오픽션), 액체 질소 온도로 유지된 상태에서 부서져[39](또는 마이크로톰을 사용하여)[38] 골절됩니다.차가운 균열이 생긴 표면(때로는 얼음을 숭고하게 만들기 위해 몇 분 동안 -100 °C까지 온도를 높임으로써 "에칭"되기도 함)[38]은 고진공 증발기에서 평균 45°의 각도로 증발된 백금 또는 금으로 그림자를 드리웁니다.평균 표면면에 수직으로 증발된 두 번째 탄소 코팅은 복제 코팅의 안정성을 향상시키기 위해 종종 수행됩니다.검체는 실온과 압력으로 되돌아간 다음, 산, 차아염소산염 용액 또는 SDS 세제를 사용한 세심한 화학적 소화에 의해 파괴 표면의 극도로 취약한 "그림자 표시 전" 금속 복제물이 기초 생물학적 물질로부터 방출됩니다.여전히 떠 있는 복제품은 잔류 화학물질이 전혀 없는 상태로 깨끗이 세척된 후 미세한 격자 위에서 조심스럽게 건져낸 후 건조시켜 TEM에서 관찰합니다.[citation needed]
동결-파절 복제 면역금 라벨링(FRIL) – 동결-파절 방법이 면역금 라벨링을 통해 골절면의 구성 요소를 식별할 수 있도록 수정되었습니다.현미경으로 보기 전 마지막 단계로 해동된 복제품의 모든 하부 조직을 제거하는 대신 조직 두께는 골절 과정 중 또는 이후에 최소화됩니다.조직의 얇은 층은 금속 복제물에 묶여 있기 때문에 선택한 구조에 대한 항체로 면역 골드 레이블을 지정할 수 있습니다.금이 부착된 복제품의 원래 표본의 얇은 층은 파괴면의 구조를 식별할 수 있게 해줍니다.[40]식각된 셀의[41] 표면에 레이블을 지정하는 관련 방법 및 기타 복제본 레이블을 지정하는 방법도 있습니다.[42]
이온 빔 밀링 – 표면에서 이온(일반적으로 아르곤)을 발사하고 표면에서 물질을 스퍼터링하여 전자에 투명해질 때까지 샘플을 제거합니다.이 중 하위 클래스는 집속 이온 빔 밀링(focused ion beam milling)으로, 갈륨 이온은 예를 들어 마이크로프로세서 또는 집속 이온 빔 SEM 내의 장치를 통해 샘플의 특정 영역에서 전자 투명 멤브레인 또는 '라멜라'를 생성하는 데 사용됩니다.기계적 연마를 이용하여 준비하기 어려운 재료를 분석하기 전에 단면 연마를 위해 이온 빔 밀링을 사용할 수도 있습니다.[citation needed]
음성 얼룩 – 나노 입자 또는 미세한 생물학적 물질(바이러스 및 박테리아 등)을 포함하는 현탁액은 암모늄 몰리브데이트, 우라닐 아세테이트(또는 포름산) 또는 인텅스텐산과 같은 전자 불투명 용액의 희석 용액과 짧게 혼합됩니다.[citation needed]이 혼합물을 EM 그리드에 도포하고 폼바와 같은 플라스틱 필름으로 사전 코팅한 다음 블롯팅한 다음 건조할 수 있습니다.TEM에서 이 준비 상황을 보는 것은 최상의 결과를 얻기 위해 지체 없이 수행되어야 합니다.이 방법은 미생물학에서 빠르지만 조잡한 형태학적 식별을 위해 중요하지만 탄소막이 지지체에 사용될 때 EM 단층 촬영 방법론을 사용하여 고해상도 3D 재구성의 기초로 사용될 수도 있습니다.음성 염색은 나노 입자 관찰에도 사용됩니다.[citation needed]
절편 – 전자에 반투명한 시편의 얇은 조각을 만듭니다.이것들은 유리나 다이아몬드 나이프로 초음파 로톰에 초음파 로톰을 이용하여 절단하여 약 60~90 nm 두께의 초박형 단면을 만들 수 있습니다.일회용 유리칼은 실험실에서 만들 수 있고 훨씬 저렴하기 때문에 또한 사용됩니다.섹션은 또한 이온 빔(Focused Ion Beam SEM)에서 밀링(milling)에 의해 현장에서 생성될 수 있으며, 여기서 섹션은 라멜라(lamella)로 알려져 있습니다.[31]
염색 – 납, 우라늄 또는 텅스텐과 같은 중금속을 사용하여 이미징 전자를 산란시켜 서로 다른 구조 사이에 대비를 제공합니다. 많은 (특히 생물학적) 물질이 전자(약한 위상 물체)에 대해 거의 "투명"하기 때문입니다.생물학에서, 표본은 내장되기 전에, 그리고 나중에 절편된 후에 "전체" 염색될 수 있습니다.일반적으로 얇은 부분은 몇 분 동안 유라닐 아세테이트의 수용액 또는 알코올 용액으로 얼룩지고 이어서 시트르산 납 수용액으로 얼룩집니다.[43]
EM 워크플로우
생물학적 표본의 초기 전자 현미경은 새로 사용할 수 있는 고해상도를 사용하여 종종 설명적이었습니다.[44]이는 진단 전자 현미경 검사와 같은 다양한 응용 분야에서 여전히 해당됩니다.
그러나 전자 현미경은 현재 더 복잡한 워크플로우에서 자주 사용되며, 각 워크플로우는 샘플에 대한 더 복잡한 및/또는 더 많은 정량적 분석을 가능하게 하기 위해 일반적으로 여러 기술을 사용합니다.아래에 몇 가지 예시가 요약되어 있지만, 이는 포괄적인 목록으로 간주되어서는 안 됩니다.워크플로우의 선택은 애플리케이션과 해당 과학적 질문(예: 해상도, 부피, 대상 분자의 특성 등)의 요구사항에 크게 좌우됩니다.
예를 들어, 샘플의 동일한 영역에 대한 빛 및 전자 현미경 이미지를 겹쳐 두 양식의 데이터를 상관시킬 수 있습니다.이것은 일반적으로 형광 라벨이 부착된 구조물에 대한 고해상도 상황별 EM 정보를 제공하는 데 사용됩니다.이 빛과 전자 현미경(CLEM)[45]은 현재 사용 가능한 다양한 상관 워크플로우 중 하나입니다.또 다른 예로는 고해상도 질량 분석(이온 현미경)이 있는데, 이는 세포하 항생제 국소화에 관한 상관 정보를 제공하는 데 사용되었으며,[46] 다른 방법으로는 얻기 어려운 데이터입니다.[citation needed]
2차원 슬라이스(TEM) 또는 검체 표면(2차 전자가 있는 SEM)을 이미징하는 전자 현미경의 초기 역할도 점점 더 샘플의 깊이로 확장되고 있습니다.[47]이러한 '볼륨 EM' 워크플로우의 초기 예는 단순히 샘플을 통해 절단된 일련 섹션의 TEM 이미지를 쌓는 것이었습니다.다음 개발은 서로 다른 경사각에서 촬영된 이미지 세트 - TEM 단층 촬영의 역투영에 의한 두꺼운 단면(200-500 nm) 볼륨의 가상 재구성이었습니다.[48]
볼륨 EM에 대한 시리얼 이미징
TEM 단층 촬영(z축의 마이크로미터 또는 밀리미터)보다 더 큰 깊이의 볼륨 EM 데이터 세트를 획득하기 위해 샘플 깊이를 통해 촬영된 일련의 영상을 사용할 수 있습니다.예를 들어, 상술한 바와 같이 직렬 섹션의 리본을 TEM으로 이미지화할 수 있으며, 두꺼운 섹션을 사용할 경우 z-해상도를 높이기 위해 직렬 TEM 단층 촬영을 사용할 수 있습니다.보다 최근에, 후방 산란 전자(BSE) 이미지는 SEM 어레이 단층 촬영이라고 알려진 실리콘 웨이퍼 상에 수집된 더 큰 일련의 섹션의 획득될 수 있습니다.[49][50]각 섹션을 제거한 후 BSE SEM을 사용하여 섹션 대신 블록 표면을 이미지화하는 방법도 있습니다.이 방법을 통해 SEM 챔버에 설치된 울트라 마이크로톰은 작업 흐름의 자동화를 높일 수 있습니다. 검체 블록은 챔버에 적재되고 검체를 통해 연속적으로 절단 및 이미지화되도록 시스템이 프로그래밍됩니다.이를 시리얼 블록 페이스 SEM이라고 합니다.[51]이와 관련된 방법은 초음파 로톰 대신 포커싱 이온 빔 밀링을 사용하여 단면을 제거합니다.이러한 직렬 이미징 방법에서, 출력은 본질적으로 샘플 블록을 통한 이미지의 시퀀스이며, 이는 순차적으로 디지털 정렬될 수 있고 따라서 볼륨 EM 데이터 세트로 재구성될 수 있습니다.이러한 방법에서 사용할 수 있는 양이 증가함에 따라 뇌의 신경 연결 및 [52]소기관 사이의 막 접촉 부위를 매핑하는 것과 [47]같은 새로운 질문을 해결할 수 있는 전자 현미경의 기능이 확장되었습니다.[53]
전자 현미경은 만들고 유지하는 데 비용이 많이 듭니다.고해상도를 달성하도록 설계된 현미경은 자기장 제거 시스템과 같은 특별한 서비스가 있는 안정적인 건물(때로는 지하)에 보관되어야 합니다.[citation needed]
공기를 구성하는 분자가 전자를 산란시키기 때문에 샘플은 주로 진공에서 봐야 합니다.예외는 폐쇄된 액체 셀 또는 환경 챔버를 사용하는 액상 전자 현미경입니다[54]. 예를 들어, 낮은 압력(최대 20 Torr 또는 2.7 kPa)의 습윤 환경에서 수화된 샘플을 볼 수 있게 해주는 환경 주사 전자 현미경에서 말입니다.가스 샘플의 현장 전자 현미경에 대한 다양한 기술이 개발되었습니다.[55]
종래의 고진공 모드에서 작동하는 주사 전자 현미경은 보통 전도성 시편을 이미지화하기 때문에 비전도성 재료는 전도성 코팅(금/팔라듐 합금, 탄소, 오스뮴 등)이 필요합니다.현대 현미경의 저전압 모드는 코팅 없이 비전도성 시료의 관찰을 가능하게 합니다.비전도성 물질은 가변 압력(또는 환경) 주사 전자 현미경으로도 이미지화할 수 있습니다.[citation needed]
탄소 나노튜브, 규조류 패스트풀 및 작은 광물 결정(예: 석면 섬유)과 같은 작고 안정적인 표본은 전자 현미경으로 검사하기 전에 특별한 처리가 필요하지 않습니다.거의 모든 생물학적 표본을 포함한 수화된 물질의 샘플은 안정화, 두께 감소(초박단절편), 전자 광학 대비 증가(염색)를 위해 다양한 방법으로 준비해야 합니다.이러한 과정에서 인공물이 생성될 수 있지만, 이러한 과정은 일반적으로 근본적으로 다른 검체 준비 방법을 사용하여 얻은 결과를 비교함으로써 확인할 수 있습니다.1980년대 이후, 동결 고정되고 유리화된 표본의 분석 또한 과학자들에 의해 점점 더 많이 사용되고 있으며, 이 기술의 타당성을 더욱 확인시켜 주고 있습니다.[56][57][58]
^"The Scale of Things". Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. 2006-05-26. Archived from the original on 2010-02-01. Retrieved 2010-01-31.
^Humbel, Bruno M; Schwarz, Heinz; Tranfield, Erin M; Fleck, Roland A (February 15, 2019). "Chapter 10: Chemical Fixation". In Fleck, Roland A; Humbel, Bruno M (eds.). Biological Field Emission Scanning Electron Microscopy, First Edition. John Wiley & Sons Ltd. pp. 191–221. ISBN9781118663233.
^Al-Amoudi A, Norlen LP, Dubochet J (October 2004). "Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues". J Struct Biol. 148 (1): 131–5. doi:10.1016/j.jsb.2004.03.010. PMID15363793.
^Luft, J.H. (1961). "Improvements in epoxy resin embedding methods". The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. Vol. 9, no. 2. p. 409. PMC2224998. PMID13764136.
^메리먼 H.T.와 카피그 E. (1955).전자현미경에 의한 냉동 표본, 얼음 결정 및 얼음 결정 성장에 대한 연구.해군 의학박사님.Ints. 파충류 NM 000 018.01.09 Vol. 13 pp 529–544
^Rash, J. E.; Johnson, T. J.; Hudson, C. S.; Giddings, F. D.; Graham, W. F.; Eldefrawi, M. E. (1982-11-01). "Labelled-replica techniques: post-shadow labelling of intramembrane particles in freeze-fracture replicas". Journal of Microscopy. 128 (Pt 2): 121–138. doi:10.1111/j.1365-2818.1982.tb00444.x. PMID6184475. S2CID45238172.
^Kolotuev I (August 2023). "Work smart, not hard: How array tomography can help increase the ultrastructure data output". J Microsc. doi:10.1111/jmi.13217. PMID37626455.
^Abbott LF, Bock DD, Callaway EM, Denk W, Dulac C, Fairhall AL, Fiete I, Harris KM, Helmstaedter M, Jain V, Kasthuri N, LeCun Y, Lichtman JW, Littlewood PB, Luo L, Maunsell JH, Reid RC, Rosen BR, Rubin GM, Sejnowski TJ, Seung HS, Svoboda K, Tank DW, Tsao D, Van Essen DC (September 2020). "The Mind of a Mouse". Cell. 182 (6): 1372–1376. doi:10.1016/j.cell.2020.08.010. PMID32946777.
^Prinz WA, Toulmay A, Balla T (January 2020). "The functional universe of membrane contact sites". Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (1): 7–24. doi:10.1038/s41580-019-0180-9. PMID31732717.
^Gai, P.L.; Boyes, E.D. (2009). "Advances in atomic resolution in situ environmental transmission electron microscopy and 1A aberration corrected in situ electron microscopy". Microsc Res Tech. 72 (3): 153–164. arXiv:1705.05754. doi:10.1002/jemt.20668. PMID19140163. S2CID1746538.