마이크로 크리스털 전자 회절

Microcrystal electron diffraction

마이크로크리스털 전자회절(Microcrystal electronsolution, MicroED)[1][2]은 2013년 말 하워드휴즈의학연구소 자넬리아 연구캠퍼스에서 고넨 연구소가 개발한 크라이오EM 방식이다.마이크로ED는 전자 회절에 의한 구조 결정에 얇은 3D 결정이 사용되는 전자 결정학의 한 형태다.null

이 방법은 크기 때문에 일반적으로 X선 회절에 적합하지 않은 나노크리스탈의 단백질 구조 결정을 위해 개발되었다.X선 결정학에 필요한 10억분의 1 크기의 결정체는 양질의 데이터를 산출할 수 있다.[3]샘플은 다른 모든 CryoEM 양식에 대해 동결 하이드레이징되지만 영상 모드에서 전송 전자현미경(TEM)을 사용하는 대신 극히 낮은 전자 노출의 회절 모드(일반적으로 < 0.01− e///s2))에서 사용한다.나노 크리스털은 회절빔에 노출돼 영화처럼[2] 빠른 카메라에 회절이 수집되는 동안 계속 회전한다.[2]그런 다음 구조 분석 및 정교화를 위한 전문 소프트웨어가 필요 없이 X선 결정학용 기존 소프트웨어를 사용하여 마이크로ED 데이터를 처리한다.[4]중요한 것은 MicroED 실험에서 사용되는 하드웨어와 소프트웨어 모두 표준적이고 광범위하게 이용 가능하다는 것이다.null

개발

마이크로ED의 첫 번째 성공적인 시연은 2013년 고넨 연구소에 의해 보고되었다.[1]X선 결정학에서 고전적인 시험 단백질인 리소자임(Lysozyme)의 구조.앞서 Abrahams 그룹은 2013년 리소자임 결정체에 대한 메디픽스 양자 면적 검출기를 이용해 3D 전자 회절 데이터를 독자적으로 보고했지만 기술적 한계로 구조를 해결할 수 없었다.[5]null

실험 설정

전자현미경을 설정하고 데이터 수집을 위한 세부 프로토콜이 발표되었다.[6]null

계측

현미경

마이크로ED 데이터는 전송 전자(크리제닉) 현미경을 이용해 수집한다.현미경에는 선택된 영역 회절을 사용하기 위해 선택된 영역 조리개가 장착되어야 한다.null

디텍터

MicroED 실험에서 전자 회절 데이터를 수집하기 위해 다양한 검출기가 사용되어 왔다.충전결합장치(CCD)와 보완금속-산화물-반도체(CMOS) 기술을 활용한 검출기가 활용됐다.CMOS 검출기를 사용하면 개별 전자 계수를 해석할 수 있다.[7]null

데이터 수집

여전히 회절

MicroED에 대한 초기 개념 증명 출판물은 리소자임 결정을 사용했다.[1]단일 나노 결정에서 최대 90도의 데이터를 수집했으며 프레임 사이에 1도 단계를 분리했다.각 회절 패턴은 ~0.01 e−/å2/s의 초저 선량률로 수집되었다.3개의 결정체에서 얻은 데이터를 병합하여 우수한 정교도 통계와 함께 2.9 resolution 분해능 구조를 산출했으며, 극저온 조건에서 3D 마이크로크리스탈에서 용량에 민감한 단백질 구조를 결정하기 위해 전자 회절이 성공적으로 사용된 것은 이번이 처음이다.null

연속 스테이지 회전

원칙 증명서류 마이크로ED가 데이터 수집 방식에서 연속 회전을 적용하여 개선된 직후.[2]여기서 크리스탈은 하나의 방향으로 천천히 회전하는 반면 회절은 영화로 고속 카메라에 기록된다.그 방법론은 X선 결정학의 회전법과 같다.이로 인해 데이터 품질은 몇 가지 향상되었고 표준 X선 결정 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 허용되었다.[2]연속 회전 MicroED의 장점은 동적 산란 감소와 상호 공간 샘플링 개선이다.연속 회전은 2014년부터 마이크로ED 데이터 수집의 표준 방법이다.null

데이터 처리

MicroED 데이터 처리를 위한 세부 프로토콜이 발표되었다.[4]연속 스테이지 회전을 이용해 마이크로ED 데이터를 수집하면 표준 결정판 소프트웨어를 사용할 수 있다.null

마이크로ED와 다른 전자회절법의 차이

무기염과 같은 방사선 무감각 물질의 물질과학을 위해 개발된 다른 전자 회절법으로는 자동 회절단층촬영(ADT)[8]과 회전 전자 회절(RED[9])이 있다.이러한 방법은 MicroED와 크게 다르다.ADT에서 각도계 기울기의 이산 단계는 간격을 채우기 위한 빔 사전 처리와 함께 상호적 공간을 커버하는 데 사용된다.[8]ADT는 수정 추적을 위해 전자현미경을 스캔하고 전처리하는 데 전문 하드웨어를 사용한다.[8]RED는 TEM으로 이루어지지만 각도계는 개별 스텝으로 거칠게 기울어져 있고 빔 기울기는 간격을 채우는 데 사용된다.[9]ADT와 RED 데이터를 처리하기 위해 전문화된 소프트웨어가 사용된다.[9]중요한 것은 ADT와 RED가 방사선 무감각 무기물질과 염분에 대해 개발되고 시험되었으며 냉동 수화 상태에서 연구된 단백질이나 방사선에 민감한 유기물질과 함께 사용하기 위해 입증되지 않았다는 점이다.null

이정표

방법 범위

마이크로ED는 큰 구상 단백질,[10] 작은 단백질,[2] 펩타이드,[11] 막 단백질,[12] 유기 분자,[13][14] 무기 화합물의 구조를 결정하는 데 사용되어 왔다.[15]이러한 많은 예에서 수력발전소와 충전 이온이 관찰되었다.[11][12]null

파킨슨병 α시뉴클레인의 새로운 구조

MicroED가 해결한 최초의 소설 구조물은 2015년 말에 출판되었다.[11]이들 구조물은 파킨슨병을 담당하는 단백질인 α-시크루틴의 독성핵심을 형성하고 집적 메커니즘 독성골재를 통찰하게 하는 펩타이드 파편이었다.구조물은 1.4 å 분해능으로 해결되었다.null

R2lox의 새로운 단백질 구조

마이크로ED가 해결한 단백질의 첫 번째 소설 구조는 2019년에 출판되었다.[16]단백질은 설포오부스 산도칼다리우스에서 추출한 R2형 리간드 결합 산화효소(R2lox)이다.구조는 지식구조를 가진 가장 가까운 호몰로그램에서 구축된 35% 시퀀스 아이덴티티 모델을 이용하여 분자교체에 의해 3.0 å 분해능으로 해결되었다.이 연구는 미지의 단백질 구조를 얻기 위해 MicroED를 사용할 수 있다는 것을 증명했다.null

MicroED 교육 및 서비스에 대한 액세스

MicroED에 대해 자세히 알아보려면 UCLA에서 매년 열리는 MicroED Imaging Center 과정 또는 Diamond Light Source에서 MicroED 과정을 수강하면 된다.극저온 전자 현미경 검사 방법과 관련된 다가오는 회의와 워크샵에 대한 최신 정보는 3DEM 미팅 및 워크샵 페이지를 참조하십시오.null

UCLA의 MENCY – Microcrystal Electron Diffraction Imaging Center와 나노이미징 서비스를 포함한 여러 대학과 회사가 MicroED 서비스를 제공하고 있다.null

또 최근(2021년 5월) 조엘과 리가쿠가 공동 개발한 마이크로ED 전용 상용 전자 확산계도 세계 최초로 마이크로ED 실험을 쉽게 수행할 수 있도록 했다.[17]null

참조

  1. ^ a b c Shi, Dan; Nannenga, Brent L; Iadanza, Matthew G; Gonen, Tamir (2013-11-19). "Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals". eLife. 2: e01345. doi:10.7554/elife.01345. ISSN 2050-084X. PMC 3831942. PMID 24252878.
  2. ^ a b c d e f Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew G W; Gonen, Tamir (2014-08-03). "High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED". Nature Methods. 11 (9): 927–930. doi:10.1038/nmeth.3043. ISSN 1548-7091. PMC 4149488. PMID 25086503.
  3. ^ de la Cruz, M Jason; Hattne, Johan; Shi, Dan; Seidler, Paul; Rodriguez, Jose; Reyes, Francis E; Sawaya, Michael R; Cascio, Duilio; Weiss, Simon C (2017). "Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED". Nature Methods. 14 (4): 399–402. doi:10.1038/nmeth.4178. ISSN 1548-7091. PMC 5376236. PMID 28192420.
  4. ^ a b Hattne, Johan; Reyes, Francis E.; Nannenga, Brent L.; Shi, Dan; de la Cruz, M. Jason; Leslie, Andrew G. W.; Gonen, Tamir (2015-07-01). "MicroED data collection and processing". Acta Crystallographica Section A. 71 (4): 353–360. doi:10.1107/s2053273315010669. ISSN 2053-2733. PMC 4487423. PMID 26131894.
  5. ^ Nederlof, I.; van Genderen, E.; Li, Y.-W.; Abrahams, J. P. (2013-07-01). "A Medipix quantum area detector allows rotation electron diffraction data collection from submicrometre three-dimensional protein crystals". Acta Crystallographica Section D. 69 (7): 1223–1230. doi:10.1107/S0907444913009700. ISSN 0907-4449. PMC 3689525. PMID 23793148.
  6. ^ Shi, Dan; Nannenga, Brent L; de la Cruz, M Jason; Liu, Jinyang; Sawtelle, Steven; Calero, Guillermo; Reyes, Francis E; Hattne, Johan; Gonen, Tamir (2016-04-14). "The collection of MicroED data for macromolecular crystallography". Nature Protocols. 11 (5): 895–904. doi:10.1038/nprot.2016.046. ISSN 1754-2189. PMC 5357465. PMID 27077331.
  7. ^ https://www.gatan.com/ccd-vs-cmos 및 https://www.gatan.com/techniques/imaging을 참조하십시오.
  8. ^ a b c Mugnaioli, E.; Gorelik, T.; Kolb, U. (2009). ""Ab initio" structure solution from electron diffraction data obtained by a combination of automated diffraction tomography and precession technique". Ultramicroscopy. 109 (6): 758–765. doi:10.1016/j.ultramic.2009.01.011. ISSN 0304-3991. PMID 19269095.
  9. ^ a b c Wan, Wei; Sun, Junliang; Su, Jie; Hovmöller, Sven; Zou, Xiaodong (2013-11-15). "Three-dimensional rotation electron diffraction: softwareREDfor automated data collection and data processing". Journal of Applied Crystallography. 46 (6): 1863–1873. doi:10.1107/s0021889813027714. ISSN 0021-8898. PMC 3831301. PMID 24282334.
  10. ^ Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Hattne, Johan; Reyes, Francis E; Gonen, Tamir (2014-10-10). "Structure of catalase determined by MicroED". eLife. 3: e03600. doi:10.7554/elife.03600. ISSN 2050-084X. PMC 4359365. PMID 25303172.
  11. ^ a b c Rodriguez, J.A.; Ivanova, M.; Sawaya, M.R.; Cascio, D.; Reyes, F.; Shi, D.; Johnson, L.; Guenther, E.; Sangwan, S. (2015-09-09). "MicroED structure of the segment, GVVHGVTTVA, from the A53T familial mutant of Parkinson's disease protein, alpha-synuclein residues 47-56". doi:10.2210/pdb4znn/pdb. {{cite journal}}:Cite 저널은 필요로 한다. journal=(도움말)
  12. ^ a b Liu, S.; Gonen, T. (2018-09-12). "MicroED structure of NaK ion channel reveals a process of Na+ partition into the selectivity filter". doi:10.2210/pdb6cpv/pdb. {{cite journal}}:Cite 저널은 필요로 한다. journal=(도움말)
  13. ^ Gallagher-Jones, Marcus; Glynn, Calina; Boyer, David R.; Martynowycz, Michael W.; Hernandez, Evelyn; Miao, Jennifer; Zee, Chih-Te; Novikova, Irina V.; Goldschmidt, Lukasz (2018-01-15). "Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp". Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2): 131–134. doi:10.1038/s41594-017-0018-0. ISSN 1545-9993. PMC 6170007. PMID 29335561.
  14. ^ Jones, Christopher; Martynowycz, M; Hattne, Johan; Fulton, Tyler J.; Stoltz, Brian M.; Rodriguez, Jose A.; Nelson, Hosea; Gonen, Tamir (2018). "The CryoEM Method MicroED as a Powerful Tool for Small Molecule Structure Determination" (PDF). doi:10.26434/chemrxiv.7215332.v1. PMC 6276044. {{cite journal}}:Cite 저널은 필요로 한다. journal=(도움말)
  15. ^ Vergara, Sandra; Lukes, Dylan A.; Martynowycz, Michael W.; Santiago, Ulises; Plascencia-Villa, Germán; Weiss, Simon C.; de la Cruz, M. Jason; Black, David M.; Alvarez, Marcos M. (2017-10-31). "MicroED Structure of Au146(p-MBA)57 at Subatomic Resolution Reveals a Twinned FCC Cluster". The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (22): 5523–5530. doi:10.1021/acs.jpclett.7b02621. ISSN 1948-7185. PMC 5769702. PMID 29072840.
  16. ^ Xu, Hongyi; Lebrette, Hugo; Clabbers, Max T. B.; Zhao, Jingjing; Griese, Julia J.; Zou, Xiaodong; Högbom, Martin (7 August 2019). "Solving a new R2lox protein structure by microcrystal electron diffraction". Science Advances. 5 (8): eaax4621. doi:10.1126/sciadv.aax4621.
  17. ^ 쇼, 이토, 프레이저 J, 화이트 L, 에이지, 오쿠니시, 요시타카, 아오야마,야마노 아키히토, 요셉 D, 페라라, 자스노프스키, 마티아스, 마이어(Mathias, 11-19) 3D ED/MicroED에 대한 전자 확산계로 작은 분자 화합물의 구조 결정 https://doi.org/10.1039/D1CE01172C

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