단일 입자 분석

Single particle analysis
단일 입자 분석을 통해 샘플의 많은 입자를 분할하고 평균화함으로써 컴퓨터 알고리즘이 개별 이미지를 조합된 "대표적인" 이미지로 처리할 수 있습니다.이를 통해 신호 대 노이즈를 개선할 수 있으며 디콘볼루션과 결합하여 영상의 공간 분해능을 제한적으로 개선할 수 있습니다.

단일 입자 분석은 투과 전자 현미경(TEM)[1]에서 이미지를 분석하는 데 사용되는 관련된 컴퓨터화된 이미지 처리 기술 그룹입니다.이러한 방법은 입자 샘플, 전형적으로 단백질 또는 바이러스와 같은 다른 큰 생물학적 실체의 TEM 영상에서 얻을 수 있는 정보를 개선하고 확장하기 위해 개발되었다.얼룩진 입자나 잡히지 않은 입자의 개별 이미지는 매우 시끄럽고 해석하기가 매우 어렵습니다.유사한 입자의 여러 디지털 이미지를 함께 결합하면 더 강하고 쉽게 해석할 수 있는 이미지를 얻을 수 있습니다.이 기술의 확장은 입자의 3차원 재구성을 구축하기 위해 단일 입자 방법을 사용합니다.극저온전자현미경법을 사용하면 우선 대칭성이 높은 바이러스의 경우 서브나노미터 분해능과 근원자[2][3] 분해능으로 재구성을 발생시킬 수 있으며, 이제는 더 작은 비대칭 단백질로도 [4]재구성이 가능해졌다.단일 입자 분석은 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(ICP-MS)에 의해서도 실시할 수 있다.

기술

단일 입자 분석은 음의 착색 및 유리 얼음 내장 투과 전자 극저온 현미경(CryoTEM) 샘플 모두에 대해 수행할 수 있습니다.단일 입자 분석 방법은 일반적으로 균질한 표본에 의존하지만, 구조 이질성을 다루기 위한 기술이 개발되고 있다.

화상(마이크로그래프)은 형광층에 결합된 하전결합소자(CCD) 검출기를 사용하여 전자현미경으로 촬영된다(과거에는 대신에 필름에 수집되어 고품질 스캐너를 사용하여 디지털화되었다).이미지 처리는 특수한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행되며, 종종 멀티프로세서 컴퓨터 클러스터에서 실행됩니다.샘플 또는 원하는 결과에 따라 다양한 단계의 2차원 또는 3차원 처리를 수행할 수 있습니다.

또, ICP-MS 유닛을 이용해 개별 입자 모드에서도 단일 입자 해석을 실시할 수 있다.

정렬 및 분류

생물학적 샘플, 특히 얇은 유리 얼음에 내장된 샘플은 방사선에 매우 민감하기 때문에 낮은 전자 선량만 샘플 이미지에 사용할 수 있다.이러한 낮은 선량과 사용된 금속 얼룩의 변화(사용된 경우)는 관찰 중인 입자가 제공하는 신호에 비해 이미지에 노이즈가 높다는 것을 의미합니다.복수의 유사 화상을 서로 레지스터에 배치해 평균화하는 것으로, 신호 대 잡음비가 높은 화상을 얻을 수 있다.노이즈는 대부분 랜덤하게 분포되어 있고 기본 화상의 특징은 일정하기 때문에 여러 화상에 걸쳐 각 화소의 강도를 평균화함으로써 일정 특징만 강화된다.일반적으로 한 영상을 다른 영상으로 매핑하기 위한 최적의 정렬(변환 및 평면 내 회전)은 교차 상관에 의해 계산됩니다.

단, 마이크로그래프는 종종 복수의 다른 방향 및/또는 구성의 입자를 포함하므로 보다 대표적인 이미지 평균을 얻기 위해 유사한 입자상을 여러 세트로 그룹화하는 방법이 필요하다.이는 보통 다변수 통계 분석 및 계층적 상승 분류 또는 k-평균 클러스터화 같은 여러 데이터 분석 및 이미지 분류 알고리즘 중 하나를 사용하여 수행됩니다.

종종 수만 개의 입자 화상의 데이터 세트가 사용되며, 최적의 솔루션에 도달하기 위해 정렬 및 분류의 반복 절차가 사용됩니다. 따라서 분류에 의해 생성된 강력한 화상 평균이 전체 데이터 세트의 후속 정렬을 위한 참조 화상으로 사용됩니다.

이미지 필터링

화상 필터링(밴드 패스 필터링)은, 얼라인먼트 및 분류 순서의 결과에 영향을 줄 가능성이 있는, 화상내의 높은 공간 주파수 정보 및/또는 낮은 공간 주파수 정보의 영향을 줄이기 위해서 자주 사용됩니다.이것은 특히 네거티브 얼룩 이미지에 유용합니다.알고리즘은 고속 푸리에 변환(FFT)을 사용하며, 종종 특정 주파수 범위를 억제하기 위해 상호 공간에 가우스 모양의 소프트 에지 마스크를 사용합니다.하이패스 필터는 낮은 공간 주파수(예: 램프 또는 그라데이션 효과)를 제거하여 높은 주파수를 그대로 유지합니다.저역 통과 필터는 높은 공간 주파수 특징을 제거하여 미세한 디테일에 흐릿한 효과를 줍니다.

콘트라스트 전송 기능

전자현미경에서의 화상형성의 성질에 의해, 현저한 저초점을 이용해 밝은 영역의 TEM 화상을 얻을 수 있다.이것은, 현미경의 렌즈 시스템에 고유의 특징과 함께, 포인트 스프레드 기능으로서 볼 수 있는 수집 화상을 흐리게 합니다.영상 조건의 결합된 효과는 CTF(콘트라스트 전송 함수)로 알려져 있으며, 수학적으로 상호 공간의 함수로 근사할 수 있습니다.위상 플립, 진폭 보정/위너 필터링과 같은 특수 영상 처리 기술을 사용하여 CTF를 수정할 수 있으며(적어도[5] 부분적으로) 고해상도 재구성이 가능합니다.

입체 재구성

투과 전자 현미경 이미지는 물체를 통한 밀도 분포를 보여주는 물체의 투영으로 의료용 X선과 유사합니다.투영 슬라이스 정리를 이용하는 것으로, 시야각의 범위로부터 촬영한 물체의 많은 화상(2D 투영)을 조합하는 것으로, 물체의 3차원 재구성을 생성할 수 있다.유리 얼음의 단백질은 방향(또는 시야각)의 무작위 분포를 이상적으로 채택하여 많은 입자 이미지를 사용할 경우 상당히 등방성을 재구성할 수 있다.이는 검체/이미지 설정으로 인해 시야각이 제한되어 이방성 재구성을 제공하는 전자 단층 촬영과 대조됩니다.필터링된 역투영은 많은 대체 알고리즘이 [3]존재하지만 단일 입자 분석에서 3D 재구성을 생성하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다.

재구성을 수행하려면 먼저 각 영상에서 개체의 방향을 추정해야 합니다.각 이미지의 상대적인 오일러 각도를 산출하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다.공통 선(공통 1D 투영 및 시노그램)을 기반으로 하는 것도 있고 반복 투영 일치 알고리즘을 사용하는 것도 있습니다.후자는 단순하고 저해상도인 3D 시작 모델로 시작하여 실험 이미지를 모델의 투영과 비교하고 솔루션을 향해 부트스트랩할 새로운 3D를 만듭니다.

또한 고유한 나선 대칭을 이용하여 나선 샘플(담배 모자이크 바이러스 등)의 3D 재구성을 위한 방법도 이용할 수 있다.이러한 샘플에는 실제 공간법(나선의 단면을 단일 입자로 취급)과 상호 공간법(회절 패턴을 사용)을 모두 사용할 수 있습니다.

틸트 방식

현미경의 시료 단계를 기울일 수 있으며(일반적으로 단일 축을 따라), 무작위 원뿔 [6]기울기라고 알려진 단일 입자 기술을 사용할 수 있습니다.시료의 영역을 0도 및 고각도(~60~70도)로 촬영하거나 직교 틸트 재구성의 관련 방법의 경우 +45도 및 -45도로 촬영한다.같은 물체에 대응하는 입자쌍을 2개의 다른 경사(틸트쌍)로 선택하고, 이후의 얼라인먼트 및 분류 스텝에서 사용하는 파라미터를 따르는 것으로, 비교적 간단하게 3차원 재구성을 생성할 수 있다.이는 각 입자의 시야각(3개의 오일러 각도로 정의됨)이 기울기 기하학에서 알려져 있기 때문입니다.

무작위 원추형 기울기에서 3D 재구성은 제한된 방향 범위로 인해 누락된 정보로 인해 어려움을 겪습니다.이는 (상호 공간의 모양 때문에) 누락된 원뿔이라고 알려져 있으며, 3D 지도에서 왜곡을 일으킵니다.그러나 여러 틸트 재구성을 결합하면 종종 원뿔 누락 문제를 해결할 수 있습니다.틸트 방법은 음극 착색 검체에 가장 적합하며 탄소 지지 필름에 선호하는 방향으로 흡착하는 입자에 사용할 수 있습니다.충전 또는 빔에 의한 움직임으로 알려진 현상은 유리 얼음에서 시료의 높은 기울기 이미지를 수집하는 것을 어렵게 만듭니다.

지도 시각화 및 맞춤

3D 지도를 볼 수 있는 다양한 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있습니다.이를 통해 사용자는 서브유닛의 단백질 좌표(X선 결정학 또는 NMR의 구조)를 전자 밀도에 수동으로 도킹할 수 있습니다.또한 여러 프로그램이 계산상 서브유닛에 적합할 수 있습니다.

단립자 ICP-MS

단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(SP-ICP-MS)은 환경 유체 샘플의 부유 입자를 검출 및 정량화하고, 이동 평가, 입자 크기와 분포 평가 및 주어진 환경에서의 안정성 결정이 가능한 여러 영역에서 사용된다.nt. SP-ICP-MS는 2000년 Claude Deguledre에 의해 입자 현탁용으로 설계되었다.그는 제네바 대학의 포렐 연구소에서 이 새로운 방법론을 처음 테스트했고, 2002년 봄 EMRS 회의 중 '콜로이드 2oo2' 심포지엄과 [7]2003년 절차에서 이 새로운 분석 접근법을 발표했다.본 연구는 SP ICP-MS 이론과 점토 입자(몬트리요나이트)에 대한 시험 결과와 콜로이드 현탁액을 제시한다.이 방법은 Deguledre & Favarger(2004)[8]에 의해 이산화토륨 나노입자에 대해, Deguledre([9]2004)에 의해 나노약리학에서 기질로 사용되는 이산화지르코늄(2004) 및 금 나노입자에 대해 시험되어 Deguledre(2006)[10]에 의해 발표되었다.이후 이산화우라늄 나노입자 및 미세입자 연구는 상세한 출판물을 만들었다.Deguledre et al (2006)[11]2010년 이후 SP ICP-MS에 대한 관심이 폭발적으로 증가하고 있습니다.

예

  • 단백질 합성, 리간드 결합 및 RNA 상호작용에 대한 중요한 정보는 7.5~[12]25Ω의 중간 분해능에서 이 새로운 기술을 사용하여 얻을 수 있다.
  • Methanoccus maripaludis [13]chaperonin, 분해능 [14]0.43나노미터로 재구성.이 박테리아 단백질 복합체는 껍질 안에 갇힌 다른 단백질을 접는 기계입니다.
  • 0.59나노미터 [16]분해능의 효모 지방산 합성효소[15].이 거대한 효소 복합체는 세포 생활에 필수적인 긴 사슬 지방산을 만드는 데 책임이 있다.
  • 아쿠아레오바이러스의 0.[17][18]33나노미터 재구성.이 바이러스들은 물고기와 다른 수중 동물들을 감염시킨다.재구성은 아미노산 측쇄 밀도를 쉽게 볼 수 있을 만큼 높은 분해능을 가지고 있다.

프라이머리 데이터베이스

레퍼런스

  1. ^ Frank, Joachim (2006). Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies: visualization of biological molecules in their native state. Oxford: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-518218-7.[페이지 필요]
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외부 링크

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