DNA아데닌메틸전달효소 식별

DNA adenine methyltransferase identification

DNA 아데닌 메틸전달효소 식별은 흔히 약칭 DamID로 불리는 분자생물학 프로토콜로,[1] 진핵생물에서 DNA와 염색질을 결합하는 단백질의 결합 부위를 지도화하는 데 사용된다.DamID는 제안된 DNA 결합 단백질을 DNA 메틸전달효소와 융합 단백질로 표현하여 결합 부위를 식별한다.관심 단백질을 DNA에 결합하면 결합 부위 메틸전달효소가 국소화된다.아데닌 메틸화는 eukaryotes에서 자연적으로 발생하지 않으며 따라서 어떤 지역의 아데닌 메틸화는 융합 단백질에 의해 발생했다고 결론 내릴 수 있으며, 이는 해당 지역이 결합 부위 근처에 있음을 암시한다.DamID는 Chip-on-chip 또는 Chip-seq의 대체 방법이다.[2]null

설명

원리

some blabla.
DamID의 원리.이 스케치는 세포의 핵 안에 있는 히스톤을 감싸고 있는 DNA 분자의 이상적인 모습을 보여준다.효소 댐(녹색)은 치메릭 DNA 염기서열의 발현에 의해 관심 단백질(오렌지)과 융합된다.관심의 단백질은 댐을 같은 목표물로 끌고 간다.테더링으로 인해 바인딩 사이트(빨간색) 부근의 GATC가 메틸레이션되지만 거리가 멀지는 않다.

N6-메틸아데닌(m6A)은 아데닌의 위치 6에 메틸그룹(CH3)을 첨가한 제품이다.이 변형된 뉴클레오티드는 C. 에글레조를 제외하고 대부분의 진핵생물에는 없지만,[3] 제한 수정이나 DNA 수리 시스템의 일부로서 박테리아 게놈에 널리 퍼져 있다.[4]대장균에서 아데닌 메틸화효소(DNA 아데닌 메틸화효소)는 아데닌 메틸화효소 댐(DNA 아데닌 메틸화효소)에 의해 촉매되는데, 아데닌 메틸화효소는 팔레드로믹서열 GATC에서만 독점적으로 카탈리시스된다.진핵 세포에서 댐의 외시적 표현은 다른 뚜렷한 부작용 없이 GATC 시퀀스에서 아데닌의 메틸화로 이어진다.null

이를 바탕으로 DamID는 관심 단백질(일반적으로 전사 인자와 같은 DNA와 상호작용하는 단백질)에 댐을 융합하는 것으로 구성된다.따라서 관심 단백질은 댐을 동일한 체내 결합 부위로 표적화하여 인접 GATC의 메틸화를 초래한다.m6A의 존재는 관심 단백질의 결합 부위와 일치하여 메틸 PCR에 의해 밝혀진다.null

메틸 PCR

이 분석에서 게놈은 DpnI에 의해 소화되는데, DpnI는 메틸화된 GATC만 잘라낸다.그런 다음 알려진 시퀀스를 가진 이중 가닥 어댑터는 DpnI에 의해 생성된 끝에 연결된다.이어 레그레이션 제품은 DpnII가 소화한다.이 효소는 비메틸화 GATC를 절단하여 연속 메틸화 GATC에 의해 측면에 있는 파편만 후속 PCR에서 증폭되도록 한다.그런 다음 어댑터에 일치하는 프라이머를 가진 PCR을 수행하며, 메틸화 GATC가 측면에 있는 게놈 파편을 구체적으로 증폭시킨다.

DamID 대 Chromatin Immuno- Precipitation의 특성

크로마틴 면역-선입(Chip)은 게놈의 특정 위치에서 단백질 결합을 분석하는 대안 방법이다.DamID는 Chip과 달리 관심 단백질에 대한 특정 항체가 필요하지 않다.한편, 이것은 그러한 항체가 없는 단백질을 지도화할 수 있게 한다.반면에, 이것은 특별히 변환 후 변형된 단백질을 지도화하는 것을 불가능하게 만든다.null

또 다른 근본적인 차이점은 Chip이 주어진 시간에 관심 단백질이 어디에 있는지 평가하는 반면 DamID는 그것이 어디에 있었는지 평가하는 것이다.그 이유는 m6A가 댐 융합 단백질이 사라진 후에도 DNA에 남아 있기 때문이다.대상 사이트에서 결합되거나 결합되지 않은 단백질의 경우 이것은 큰 그림을 바꾸지 않는다.그러나, 이것은 DNA를 따라 미끄러지는 단백질(예: RNA 중합효소)의 경우에 강한 차이로 이어질 수 있다.null

알려진 편견 및 기술적 문제

플라스미드 메틸화 바이어스

실험을 어떻게 하느냐에 따라 DamID는 플라스미드 메틸화 편향을 받을 수 있다.플라스미드는 보통 댐이 자연적으로 발현되는 대장균에서 증폭되기 때문에 GATC마다 메틸화된다.과도기적인 전이 실험에서, 그러한 플라스미드의 DNA는 전이된 세포의 DNA와 함께 회복되는데, 이것은 플라스미드의 파편이 메틸 PCR에서 증폭된다는 것을 의미한다.따라서 플라스미드와 동종학이나 정체성을 공유하는 게놈의 모든 순서는 관심 단백질에 의해 구속되는 것처럼 보일 수 있다.특히 플라스미드와 게놈에 모두 존재하는 관심 단백질의 개방적인 독서 프레임에 대해서는 그렇다.마이크로 어레이 실험에서 이러한 편향은 적절한 재료가 혼합되었는지 확인하는 데 사용될 수 있다.안정적인 세포선이나 완전 유전자 변형 동물에서는 플라스미드 DNA가 회복되지 않아 이러한 편견이 관찰되지 않는다.null

사멸

세포사다리 패턴에 따라 세포 사다리 세포는 DNA를 분해한다.이를 통해 DamID 절차(van Steensl laboratory, 미발표 관측치) 중에 묶고 증폭할 수 있는 DNA 파편이 생성된다.이러한 핵 조각들이 단백질의 결합 프로필에 미치는 영향은 알려져 있지 않다.null

해상도

DamID의 분해능은 게놈에서 GATC 시퀀스의 가용성의 함수다.단백질은 연속 2개의 GATC 사이트 내에서만 매핑될 수 있다.GATC 조각 사이의 중간 간격은 드로소필라(FlyBase 릴리스 5), 마우스 260(Mm9), 인간 460(HG19)이다.m6A의 면역집중화와 표적지 인지도가 덜한 댐 변종(DamIP)[5]을 결합한 변형 프로토콜(DamIP)을 사용해 고해상도 데이터를 얻을 수 있다.null

세포유형특정방법

Chip seq에 비해 DamID의 주요 이점은 세포의 하위 집단을 물리적으로 분리할 필요 없이 특정 세포 유형에서 단백질 결합 부위의 프로파일링을 검사할 수 있다는 것이다.이를 통해 동물 모델에서 발달 또는 생리학적 과정에 대한 조사를 할 수 있다.null

타겟 댐아이디

표적형 DamID(TaDa) 접근방식은 리보솜 재활성화 현상을 이용하여 DamID에 적절한 낮은 수준의 Dam-Fusion 단백질을 표현한다(즉, 댐은 비포화성이므로 독성을 회피한다).이 구조는 세포형 특정 촉진제와 결합하여 조직 특정 메틸화를 유발할 수 있다.[6][7]이 접근방식은 관심 세포 유형의 전사 인자 결합을 분석하거나 또는 RNA 중합효소의 결합을 결정하기 위해 Pol II 하위 단위에 댐을 융합하여 세포 고유 유전자 발현을 유추하는 데 사용될 수 있다.표적형 DamID는 드로소필라와 마우스[8][9] 세포에서 입증되었다.null

FRT/FLP 출력 댐아이디

또한 댐 용융단백질의 업스트림 전사인 터미네이터 카세트의 재결합 매개 분리를 사용하여 셀 고유 DamID를 달성할 수 있다.[10]터미네이터 카세트는 FRP 재조합의 조직별 표현과 결합할 때 제거할 수 있는 FRT 재조합 현장이 측면에 있다.카세트를 분리할 때 댐 퓨전(Dam-fusion)은 기초적인 추진자의 통제 하에 낮은 수준으로 표현된다.null

변형

DamID는 표준 단백질-DNA 상호작용의 검출뿐만 아니라 염색질 생물학의 다른 측면을 조사하는 데 사용될 수 있다.null

스플릿 댐아이디

이 방법은 동일한 게놈 위치에 대한 두 인자의 공동 결합을 검출하는 데 사용할 수 있다.댐 메틸라아제는 서로 다른 관심 단백질과 융합된 두 부분으로 표현될 수 있다.두 단백질이 DNA의 같은 부위에 결합하면 댐 효소는 다시 재생되어 주변의 GATC 부지를 메틸화 할 수 있다.[11]null

크로마틴 접근성

효소의 높은 활동성으로 인해, 비침습 댐의 발현으로 인해 접근 가능한 염색질의 모든 부위가 메틸화된다.[12][13]이 접근방식은 ATAC-seq 또는 DNA-seq의 대안으로 사용될 수 있다.셀형 특정 DamID 방법과 결합할 경우, 무통행 댐의 표현을 사용하여 셀형 특정 촉진자 또는 촉진자 지역을 식별할 수 있다.null

RNA-DNA 상호작용

RNA-Dam으로 알려진 DamID 변종ID는 RNA 분자와 DNA 사이의 상호작용을 검출하는 데 사용될 수 있다.[14]이 방법은 MS2 스템루프로 수정된 RNA에 결합할 수 있는 Dam-MCP 융합단백질의 표현에 의존한다.댐 핵융합 단백질을 RNA에 결합하면 게놈에 대한 RNA 결합 부위에서 검출 가능한 메틸화가 발생한다.null

장기 규제 상호작용

단백질 결합 부위까지의 DNA 서열은 염색체 고리를 통해 물리적으로 근접할 수 있다.예를 들어, 그러한 상호작용은 촉진제 및 촉진제 기능을 중재한다.이러한 상호작용은 댐 메틸화의 작용을 통해 감지할 수 있다.댐이 특정 알려진 DNA 위치의 표적이 될 경우, DNA의 3D 구성으로 인해 근접하게 유입된 원위부 역시 메틸화되며 기존 DamID처럼 검출될 수 있다.[15]null

싱글 셀 댐아이디

DamID는 보통 약 10,000개의 셀에 대해 수행된다.[16] (적은[6] 수의 셀로 입증되었지만)즉, 얻은 데이터는 해당 세포군 전체에 걸쳐 결합 사건의 평균 결합 또는 확률을 나타낸다.단일 세포에 대한 DamID 프로토콜이 개발되어 인간 세포에도 적용되었다.[17]단일 세포 접근법은 세포들 사이의 염색질 결합의 이질성을 강조할 수 있다.null

참조

  1. ^ van Steensel B, Henikoff S (April 2000). "Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase". Nature Biotechnology. 18 (4): 424–8. doi:10.1038/74487. PMID 10748524.
  2. ^ Aughey GN, Southall TD (January 2016). "Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions". Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 5 (1): 25–37. doi:10.1002/wdev.205. PMC 4737221. PMID 26383089.
  3. ^ Shi, Yang; He, Chuan; Aravind, L.; Hsu, Chih-Hung; Aristizábal-Corrales, David; Liu, Jianzhao; Sendinc, Erdem; Gu, Lei; Blanco, Mario Andres (2015-05-07). "DNA Methylation on N6-Adenine in C. elegans". Cell. 161 (4): 868–878. doi:10.1016/j.cell.2015.04.005. ISSN 0092-8674. PMC 4427530. PMID 25936839.
  4. ^ Brooks JE, Roberts RJ (February 1982). "Modification profiles of bacterial genomes". Nucleic Acids Research. 10 (3): 913–34. doi:10.1093/nar/10.3.913. PMC 326211. PMID 6278441.
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  6. ^ a b Southall TD, Gold KS, Egger B, Davidson CM, Caygill EE, Marshall OJ, Brand AH (July 2013). "Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells". Developmental Cell. 26 (1): 101–12. doi:10.1016/j.devcel.2013.05.020. PMC 3714590. PMID 23792147.
  7. ^ Marshall OJ, Southall TD, Cheetham SW, Brand AH (September 2016). "Cell-type-specific profiling of protein-DNA interactions without cell isolation using targeted DamID with next-generation sequencing". Nature Protocols. 11 (9): 1586–98. doi:10.1038/nprot.2016.084. hdl:10044/1/31094. PMC 7032955. PMID 27490632.
  8. ^ Tosti L, Ashmore J, Tan BS, Carbone B, Mistri TK, Wilson V, Tomlinson SR, Kaji K (April 2018). "Mapping transcription factor occupancy using minimal numbers of cells in vitro and in vivo". Genome Research. 28 (4): 592–605. doi:10.1101/gr.227124.117. PMC 5880248. PMID 29572359.
  9. ^ Cheetham, Seth W.; Gruhn, Wolfram H.; van den Ameele, Jelle; Krautz, Robert; Southall, Tony D.; Kobayashi, Toshihiro; Surani, M. Azim; Brand, Andrea H. (2018-09-05). "Targeted DamID reveals differential binding of mammalian pluripotency factors". Development. 145 (20): dev.170209. doi:10.1242/dev.170209. ISSN 1477-9129. PMC 6215400. PMID 30185410.
  10. ^ Pindyurin AV, Pagie L, Kozhevnikova EN, van Arensbergen J, van Steensel B (July 2016). "Inducible DamID systems for genomic mapping of chromatin proteins in Drosophila". Nucleic Acids Research. 44 (12): 5646–57. doi:10.1093/nar/gkw176. PMC 4937306. PMID 27001518.
  11. ^ Hass MR, Liow HH, Chen X, Sharma A, Inoue YU, Inoue T, Reeb A, Martens A, Fulbright M, Raju S, Stevens M, Boyle S, Park JS, Weirauch MT, Brent MR, Kopan R (August 2015). "SpDamID: Marking DNA Bound by Protein Complexes Identifies Notch-Dimer Responsive Enhancers". Molecular Cell. 59 (4): 685–97. doi:10.1016/j.molcel.2015.07.008. PMC 4553207. PMID 26257285.
  12. ^ Wines DR, Talbert PB, Clark DV, Henikoff S (1996). "Introduction of a DNA methyltransferase into Drosophila to probe chromatin structure in vivo". Chromosoma. 104 (5): 332–40. doi:10.1007/BF00337221. PMID 8575244.
  13. ^ Aughey GN, Estacio Gomez A, Thomson J, Yin H, Southall TD (February 2018). "CATaDa reveals global remodelling of chromatin accessibility during stem cell differentiation in vivo". eLife. 7. doi:10.7554/eLife.32341. PMC 5826290. PMID 29481322.
  14. ^ Cheetham SW, Brand AH (January 2018). "RNA-DamID reveals cell-type-specific binding of roX RNAs at chromatin-entry sites". Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1): 109–114. doi:10.1038/s41594-017-0006-4. PMC 5813796. PMID 29323275.
  15. ^ Cléard F, Moshkin Y, Karch F, Maeda RK (August 2006). "Probing long-distance regulatory interactions in the Drosophila melanogaster bithorax complex using Dam identification". Nature Genetics. 38 (8): 931–5. doi:10.1038/ng1833. PMID 16823379.
  16. ^ Marshall, Owen J.; Southall, Tony D.; Cheetham, Seth W.; Brand, Andrea H. (September 2016). "Cell-type-specific profiling of protein-DNA interactions without cell isolation using targeted DamID with next-generation sequencing". Nature Protocols. 11 (9): 1586–1598. doi:10.1038/nprot.2016.084. hdl:10044/1/31094. ISSN 1750-2799. PMC 7032955. PMID 27490632.
  17. ^ Kind, Jop; Pagie, Ludo; de Vries, Sandra S.; Nahidiazar, Leila; Dey, Siddharth S.; Bienko, Magda; Zhan, Ye; Lajoie, Bryan; de Graaf, Carolyn A. (2015-09-24). "Genome-wide maps of nuclear lamina interactions in single human cells". Cell. 163 (1): 134–147. doi:10.1016/j.cell.2015.08.040. ISSN 1097-4172. PMC 4583798. PMID 26365489.

추가 읽기

외부 링크