단일 셀 시퀀싱

Single cell sequencing

단일 셀 시퀀싱은 최적화된 차세대 시퀀싱(NGS) 기술로 개별 셀의 시퀀스 정보를 조사하여 셀 차이를 더 높은 분해능과 마이크로 환경 맥락에서 개별 셀의 기능을 더 잘 이해할 수 있도록 한다.[1] 예를 들어, 암에서, 개별 세포의 DNA를 염기서열화하는 것은 세포의 작은 집단이 옮기는 돌연변이에 대한 정보를 줄 수 있다. 개발에서, 개별 세포에 의해 표현된 RNA의 염기서열은 다른 세포 유형의 존재와 행동에 대한 통찰력을 줄 수 있다.[2] 미생물 시스템에서 동일한 종의 개체군은 유전적으로 클론(clonal)으로 보일 수 있지만, RNA의 단세포 염기서열 분석이나 후생유전학적 수정은 세포 대 세포의 가변성을 드러낼 수 있어 변화하는 환경에서 개체군이 생존하기 위해 빠르게 적응하는 데 도움을 줄 수 있다.[3]

배경

전형적인 인간 세포는 약 2 x 33억 염기쌍의 DNA와 6억 염기 mRNA로 구성되어 있다. 보통, 수백만의 세포들이 생어 염기서열이나 Illumina 염기서열과 같은 전통적인 방법을 사용하여 DNA나 RNA 염기서열 분석에 사용된다. 단일 세포에서 DNA와 RNA의 깊은 염기서열을 이용하여 세포 기능을 광범위하게 조사할 수 있다.[1] 일반적인 NGS 실험과 마찬가지로, 단일 셀 시퀀싱 프로토콜은 일반적으로 단일 셀의 격리, 핵산 추출 및 증폭, 시퀀싱 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 생체정보 데이터 분석 등의 단계를 포함한다. 대량으로 셀로부터 시퀀싱하는 것에 비해 단일 셀 시퀀싱을 수행하는 것이 더 어렵다. 단일 셀에서 최소한의 시작 재료는 분해, 샘플 손실 및 오염이 시퀀싱 데이터의 품질에 현저한 영향을 미친다. 또한 핵산 사용량의 피코그램 수준 때문에 단세포 염기서열의 시료 준비 과정에서 무거운 증폭이 필요한 경우가 많아 염기서열 데이터의 균일하지 않은 범위, 잡음, 부정확한 정량화가 발생한다.[4]

최근의 기술 개선은 단일 셀 시퀀싱이 접근하기 어려워 보이는 일련의 문제에 접근하기 위한 유망한 도구로 만들었다. 예를 들어 이종 표본, 희귀 세포 유형, 세포 혈통 관계, 체조직의 모자이즘, 배양할 수 없는 미생물 분석, 질병 진화 등은 모두 단일 세포 염기서열을 통해 해명할 수 있다.[5] 단일 셀 시퀀싱은 Nature Publishing Group이 2013년 올해의 방법으로 선정했다.[6]

단세포 게놈(DNA) 시퀀싱

단세포 DNA 게놈 염기서열 분석은 단일 세포를 분리하고, 전체 게놈이나 관심 영역을 증폭하며, 염기서열 라이브러리를 구축하고, 그 다음 차세대 DNA 염기서열 분석(ex)을 적용하는 것을 포함한다. Illumina, Ion Torrent, MGI). 포유류 시스템에서 단세포 DNA 염기서열은 정상적인 생리학 및 질병 연구에 광범위하게 적용되어 왔다. 단세포 분해능은 암 발생이나 치료 반응에서 유전적 모자이즘이나 내 유전적 이질성의 역할을 밝혀낼 수 있다.[7] 마이크로바이옴의 맥락에서 단일 단세포 유기체의 게놈을 단일 증폭 게놈(SAG)이라고 한다. 단세포 DNA 염기서열의 발달로 복잡한 마이크로바이옴에 존재하는 미개식 원핵종에서 유전체 데이터를 수집할 수 있게 되었다.[8] 비록 SAG는 낮은 완성도와 상당한 편향성으로 특징지어지지만, 최근의 계산적 발전은 복합적인 SAG로부터 거의 완전한 게놈의 조립을 달성했다.[9] 미생물을 통해 얻은 데이터는 향후 배양 과정을 확립할 수 있을 것이다.[10] 단일 세포 게놈 염기서열에 사용할 수 있는 게놈 조립 도구로는 SPAdes, IDBA-UD, Cortex, HyDA 등이 있다.[11]

방법들

이 그림은 단일 세포 게놈 염기서열의 워크플로우에 관련된 단계를 보여준다. MDA는 다중 변위 증폭을 의미한다.

100개 이상의 서로 다른 단일 세포 오믹스 방법의 목록이 발표되었다.[12]

다중 변위 증폭(MDA)은 널리 사용되는 기법으로, 염기서열 분석을 위해 박테리아에서 마이크로그램으로 DNA의 펨토그램을 증폭할 수 있다. MDA 반응에 필요한 시약에는 무작위 프라이머와 박테리오파지 pi29의 DNA 중합효소가 포함된다. 30도 등온 반응에서 DNA는 포함된 시약으로 증폭된다. 중합체가 새로운 가닥을 제조하면서 가닥 변위 반응이 일어나 각 템플릿 DNA에서 여러 개의 복사본을 합성한다. 동시에, 선행적으로 연장되었던 가닥들이 이동될 것이다. MDA 제품의 길이는 약 12kb이며 범위는 약 100kb로 DNA 염기서열에서 사용이 가능하다.[10] 2017년에는 pi29 중합효소의 자동온도조절 돌연변이를 이용해 WGA-X라는 이 기법의 주요한 개선점이 도입되어 개별 세포, 특히 G+C 함량이 높은 세포에서 게놈 회복이 개선되었다.[13] 또한 MDA는 고도로 병렬화된 단일 세포 전체 게놈 증폭을 달성하기 위해 마이크로 유체 방울 기반 시스템으로 구현되었다. DNA 포획과 증폭을 위해 단세포들을 물방울에 캡슐화함으로써 기존 MDA에 비해 편향성과 처리량 향상을 제공한다.[14]

또 다른 일반적인 방법은 MALBAC이다.[15] 이 방법은 MDA에서와 같이 등온 증폭으로 시작하지만 프라이머에는 다운스트림 PCR 증폭을 위한 "공통" 시퀀스가 측면에 있다. 예비 증폭기가 발생함에 따라 공통 시퀀스는 자가조영과 "루프" 형성을 촉진하여 추가 증폭을 방지한다. MDA와는 대조적으로, 고도로 갈라진 DNA 네트워크는 형성되지 않는다. 대신 다른 온도 사이클에서는 루프가 변성되어 파편이 PCR로 증폭될 수 있다. MALBAC도 미세유체장치에서 구현됐지만 나노입자 방울에 캡슐화돼 증폭 성능이 크게 개선되지 않았다.[16]

MDA와 MALBAC를 비교했을 때 MDA는 더 나은 게놈 커버리지를 제공하지만, MALBAC는 게놈 전체에서 더 고른 커버리지를 제공한다. MDA는 SNP를 식별하는 데 더 효과적일 수 있지만, MALBAC는 복사 번호 변형을 탐지하는 데 선호된다. 미세유체 장치로 MDA를 수행하면 편향과 오염을 현저하게 감소시키지만, MALBAC와 관련된 화학 물질은 효율 개선의 동일한 가능성을 보여주지 않는다.

유전학적 구조 변동의 발견에 특히 적합한 방법은 단세포 DNA 템플릿 스트랜드 시퀀싱(예: k.a)이다. Strand-seq).[17] Strand-seq는 읽기-방향성, 읽기-깊이, happlotype-phase의 공동 모델링을 사용하는 단세포 3채널 처리의 원리를 이용하여 크기 200kb의 체구조 변화 등급의 전체 스펙트럼의 발견을 가능하게 한다. Strand-seq는 독해한 침팬지에게 취약하지 않아(아래 절에서 자세히 설명됨) 단세포에서 체 유전적 변이 등급 식별을 위한 전체 게놈 증폭 방법의 한계를 극복했고, 탈락자의 영향을 덜 받기 때문이다.[18] 방법의 선택은 각 방법이 서로 다른 장점을 나타내기 때문에 시퀀싱의 목표에 따라 달라진다.[7]

제한 사항

개별 세포 게놈의 MDA는 매우 고르지 못한 게놈 커버리지(즉, 템플릿의 다양한 영역에 대한 상대적 과대표현 및 과소표현)를 초래하여 일부 시퀀스 손실을 초래한다. 이 과정에는 두 가지 요소가 있다: a) 확률론적 과소 증폭과 b) 높은 %GC 영역에 대한 체계적 편향이다. 확률적 구성요소는 동일한 셀 유형에서 단일 셀 MDA 반응을 풀링하여 상황혼합화(FISH) 및/또는 시퀀싱 후 확인에 형광을 채택하여 해결할 수 있다.[10] 높은 %GC 영역에 대한 MDA의 편향은 WGA-X라 불리는 프로세스와 같이 온도 조절 가능한 중합체를 사용하여 해결할 수 있다.[13]

인간 게놈의 유전적 변동의 큰 부분인 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)과 복사 번호 변화(CNV)는 단일 세포에서 추출한 DNA의 제한된 양뿐만 아니라 단일 세포 염기서열에서도 문제를 일으킨다. DNA의 양이 적기 때문에 커버리지가 낮고 오류가 발생하기 쉽기 때문에 증폭 후에도 DNA의 정확한 분석은 문제를 제기한다. MDA를 통해 평균 게놈 커버리지는 80% 미만이며 시퀀싱 판독이 적용되지 않는 SNP는 제외된다. 또한 MDA는 이질 표본에서 알레르기를 검출하지 않고 알레르기를 투하하는 비율이 높다. 다양한 SNP 알고리즘이 현재 사용 중이지만 단세포 염기서열과 관련된 알고리즘은 없다. CNV를 탑재한 MDA는 실제 CNV를 은폐하는 거짓 CNV를 식별하는 문제도 제기한다. 이를 해결하기 위해, 거짓 CNV로부터 패턴이 생성될 수 있을 때 알고리즘은 이 노이즈를 감지하고 제거하여 진정한 변형을 만들 수 있다.[19]

Strand-seq는 다음과 같은 유전적 변종 호출에 대한 전체 게놈 증폭에 기초한 방법의 한계를 극복했다. Strand-seq는 CNV의 경계(또는 중단점)나 복사균형 구조 변형 클래스를 가로지르는 읽기(또는 읽기 쌍)를 필요로 하지 않기 때문에, 변종 중단점에서 읽음 누락으로 인한 변종 호출 중지를 포함하는 전체 게놈 증폭에 기초한 단일 셀 방법의 일반적인 공학적 요소에 덜 취약하다.애드 [7][18]키메라Strand-seq는 균열-융접-교량 주기 및 크로모트립시스 사건뿐 아니라 균형 잡힌 반전, 복사-숫자 균형 또는 불균형 변환 등 최소 200kb의 구조적 변화 등급의 전체 스펙트럼을 발견한다.[18] Strand-seq가 하는 구조적 변종 통화는 염색체 길이 하플로타입에 의해 해결되는데, 이것은 추가적인 변종 통화 특이성을 제공한다.[18] 현재 제한사항으로 스트랜드-seq는 브롬도옥시우리딘(BrdU)을 이용한 스트랜드별 라벨링에 대해 셀을 분할해야 하며, 이 방법은 모바일 요소 삽입과 같이 크기가 200kb 미만인 변형은 검출하지 않는다.

적용들

마이크로바이옴은 대부분의 환경에서 미생물의 대다수를 배양하기 어려워 단일 세포 유전체학의 주요 대상 중 하나이다. 단세포 유전체학은 배양 없이 미생물 게놈 서열을 얻는 강력한 방법이다. 이러한 접근방식은 미생물 생태학, 진화, 공중보건 및 생명공학 잠재력과 관련된 광범위한 문제를 해결하기 위해 해양, 토양, 지표하, 유기체 및 기타 유형의 마이크로바이옴에 광범위하게 적용되어 왔다.[20][21][22][23][24][25][26][27][28]

암 염기서열 분석은 또한 scDNAseq의 새로운 응용이다. 신선 종양 또는 냉동 종양은 전신 DNAS 접근방식을 사용하여 SCNA, SNV 및 재배치에 대해 분석 및 분류할 수 있다.[29] 암 scDNAseq는 특히 수용체 티로신키나아제 유전자(EGFR, PDGFRA 등)와 같은 증폭된 치료 목표물에 존재하는 복잡성 및 복합 돌연변이의 깊이를 검사하는데 유용하다. 이때 벌크종양의 종양의 기존 인구 수준 접근으로는 이러한 돌연변이의 공동 발생 패턴을 해결할 수 없다. 종양의 세포 그러한 중첩은 경로 활성화와 종양 세포 저항의 중복을 제공할 수 있다.

단세포 DNA 메틸롬 염기서열

단일 세포 DNA 메틸화 염기서열을 위한 한 가지 방법.[30]

단세포 DNA 메틸롬 염기서열은 DNA 메틸화를 정량화한다. 자연에서 발생하는 메틸시토신(5mC), 5-하이드로이메틸시토신(5hmC), 6-메틸아데닌(6mA), 4mC 4-메틸시토신(4mC) 등 알려진 메틸시토신 여러 종류가 있다. 진핵생물, 특히 동물에서 5mC는 게놈을 따라 널리 퍼져 있으며 전이성 원소를 억제하여 유전자 발현을 조절하는 중요한 역할을 한다.[31] 개별 세포에서 5mC의 염기서열 분석은 단일 조직이나 개체군에서 유전적으로 동일한 세포에 걸쳐 후생유전학적 변화가 어떻게 다른 표현형을 가진 세포들을 발생시키는지 밝혀낼 수 있다.

방법들

비황산염 염기서열은 단일 세포에서 5mC를 검출하고 염기서열화하는 데 있어 금본위제가 되었다.[32] 비황산염으로 DNA를 처리하면 시토신 잔류물이 우라실로 전환되지만 5메틸시토신 잔류물은 영향을 받지 않는다. 따라서 비황산염으로 처리된 DNA는 메틸화 시토신만 보유하고 있다. 메틸롬 판독값을 얻기 위해 비황산염 처리 순서는 수정되지 않은 게놈에 정렬된다. 2014년 단일 세포에서 전체 게놈 비황산염 염기서열이 달성됐다.[33] 이 방법은 비황산염 조각화 이전에 시퀀싱 어댑터가 추가되는 일반적인 절차와 관련된 DNA 손실을 극복한다. 대신 어댑터는 DNA를 처리하고 비황산염으로 파편화한 뒤 추가돼 모든 파편이 PCR로 증폭될 수 있다.[34] 이 방법은 딥 시퀀싱을 사용하여 각 셀의 총 CpGs의 최대 40%를 캡처한다. 기존 기술로는 중합효소에 의해 5mC 표시가 복사되지 않기 때문에 비황산염 치료 전에 DNA를 증폭시킬 수 없다.

단세포 축소 표현 비황산염 염기서열(scRBS)도 또 다른 방법이다.[35] 이 방법은 CpG섬(CGI)에서 메틸화 시토신이 군집화되는 경향을 활용하여 CpG 함량이 높은 게놈 영역을 풍부하게 한다. 이것은 전유전자 비황산염 염기서열 분석과 비교하여 염기서열 분석 비용을 줄이지만, 이 방법의 적용범위는 제한한다. 대량 샘플에 RRBS를 적용하면 유전자 촉진제 내 CpG 사이트 대다수가 검출되지만 유전자 촉진제 내 사이트는 전체 게놈에서 CpG 사이트의 10%에 불과하다.[36] 단일 셀에서는 벌크 샘플에서 CpG 사이트의 40%가 검출된다. 커버리지를 높이기 위해 이 방법은 작은 단일 셀 풀에도 적용할 수 있다. 20개의 풀링된 단일 셀 샘플에서, 대량 샘플에서 CpG 사이트의 63%가 검출되었다. 단일 세포를 풀링하는 것은 메틸롬 커버리지를 높이기 위한 하나의 전략이지만, 세포 모집단의 이질성을 가리는 비용을 부담하는 것이다.

제한 사항

비황산염 염기서열은 5mC 검출에 가장 널리 사용되는 접근방식으로 남아 있지만, 화학적 처리가 거칠고 DNA를 파편과 분해한다. 이 효과는 대량 샘플에서 단일 셀로 이동할 때 악화된다. DNA 메틸화를 검출하는 다른 방법으로는 메틸화에 민감한 제한 효소가 있다. 제한 효소는 또한 DpnI를 사용한 6mA와 같은 다른 유형의 메틸화를 검출할 수 있게 한다.[37] 나노포어 기반 염기서열 분석은 또한 원래 DNA에 대한 단편화나 수정 없이 직접 메틸화 염기서열 분석을 위한 경로를 제공한다. 나노포어 염기서열 분석은 6mA와 4mC(eukaryotes의 5mC와는 대조적으로)가 지배하는 박테리아의 메틸롬의 염기서열 분석을 위해 사용되어 왔지만, 이 기법은 아직 단일 세포로 축소되지는 않았다.[38]

적용들

단세포 DNA 메틸화 염기서열은 유전적으로 유사한 세포의 후생유전적 차이를 탐구하는 데 널리 사용되어 왔다. 개발 중에 이러한 방법을 검증하기 위해, 혼합 모집단의 단세포 메틸롬 데이터를 계층적 클러스터링에 의해 성공적으로 분류하여 구별되는 세포 유형을 식별하였다.[35] 또 다른 응용은 초기 발달에서 처음 몇 개의 세포 분열 동안 어떻게 다른 세포 유형이 단일 배아에서 나오는지를 이해하기 위해 단일 세포를 연구하는 것이다.[39] 단세포 전유전자 비황산염 염기서열은 순환종양세포(CTCs)와 같이 암에서 희귀하지만 활동성이 높은 세포 유형을 연구하는데도 사용되어 왔다.[40]

2015년 무스쿨러스 적용범위에서의 단세포 메틸화 시퀀싱 방법 비교

시퀀싱(SCATAC-seq)을 사용하여 트랜스포세스에 액세스할 수 있는 염색체에 대한 단일 셀 검사

주요 기사: ATAC-seq

단일 세포 트랜스포아제 접근 가능한 염색체 염기서열 분석은 게놈 전체에서 염색체 접근성을 맵핑한다. 트랜스포제(transposase)는 염색질의 열린 영역에 직접 시퀀싱 어댑터를 삽입하여 해당 부위를 증폭 및 시퀀싱할 수 있도록 한다.[41]

단일 셀 대본 순서(scRNA-seq)

마이크로레이와 벌크 RNA-seq 분석과 같은 표준 방법은 많은 세포군에서 나오는 RNA의 발현을 분석한다. 혼합 세포 모집단에서, 이러한 측정은 이러한 모집단 내의 개별 세포 사이의 중요한 차이를 모호하게 할 수 있다.[42][43]

단세포 RNA 염기서열(scRNA-seq)은 개별 세포의 발현 프로파일을 제공하며 2020년 현재 세포 상태와 표현형을 정의하는 금본위제로 간주된다.[44] 각 세포가 발현하는 모든 RNA에 대한 완전한 정보를 얻을 수는 없지만, 이용할 수 있는 물질의 양이 적기 때문에 유전자 군집 분석을 통해 유전자 발현 패턴을 파악할 수 있다.[45] 이것은 이전에 볼 수 없었던 세포 집단 내에서 희귀한 세포 유형의 존재를 밝혀낼 수 있다. 예를 들어 낭포성 섬유증 투과 전도성 조절기를 표현하는 폐이온세포라고 불리는 희귀 특성화 세포는 2018년 폐 기도 상피에 scRNA-Seq를 수행하는 두 집단에 의해 확인되었다.[46][47]

방법들

단일 셀 RNA 시퀀싱 워크플로우

현재의 scRNA-seq 프로토콜은 단일 세포와 그 RNA를 분리한 다음 대량 RNA-seq와 같은 단계인 역전사(RT), 증폭, 라이브러리 생성 및 시퀀싱을 따른다. 초기 방법들은 개별 세포를 분리된 우물들로 분리했다; 보다 최근의 방법들은 역전사 반응이 일어나는 미세유체 장치의 방울에 개별 세포를 캡슐화하여 RNA를 cDNA로 변환시킨다. 각 방울에는 단일 세포에서 파생된 cDNA에 고유하게 라벨을 붙이는 DNA "바코드"가 실려 있다. 역전사가 완료되면, 많은 셀의 cDNA를 혼합하여 시퀀싱할 수 있으며, 특정 셀의 대본은 고유한 바코드로 식별된다.[48][49]

scRNA-Seq의 당면 과제는 세포 내 mRNA의 초기 상대적 풍부함을 보존하고 희귀한 대본을 식별하는 것이다.[50] 역전사 단계는 RT 반응의 효율성이 세포의 RNA 모집단 중 얼마나 많은 수가 결국 시퀀서에 의해 분석될 것인지를 결정하기 때문에 매우 중요하다. 역대본의 공정성과 사용된 프라이밍 전략은 전체 cDNA 생산과 3' 또는 5'의 유전자에 치우친 도서관 생성에 영향을 미칠 수 있다.

증폭 단계에서는 현재 PCR 또는 체외전사(IVT)가 cDNA를 증폭하는 데 사용된다. PCR 기반 방법의 장점 중 하나는 전신 cDNA 생성 능력이다. 그러나 특정 시퀀스(예: GC 콘텐츠 및 스냅백 구조)에 대한 서로 다른 PCR 효율성도 기하급수적으로 증폭되어 커버리지가 불균일한 라이브러리를 생성할 수 있다. 반면에 IVT에 의해 생성된 라이브러리는 PCR에 의한 시퀀스 편향을 피할 수 있지만, 특정 시퀀스는 비효율적으로 전사되어 시퀀스 드롭아웃을 유발하거나 불완전한 시퀀스를 생성할 수 있다.[1][42] 몇 가지 scRNA-seq 프로토콜이 발표되었다. 탕 외,[51] STRT,[52] SMART-seq,[53] CEL-seq,[54] RIGH-seq,[55] Quartz-seq,[56] C1-CAGE.[57] 이러한 프로토콜은 역전사, cDNA 합성 및 증폭 전략과 시퀀스별 바코드(즉, UMI)를 수용하는 가능성 또는 풀링된 시료를 처리할 수 있는 능력 면에서 다르다.[58]

2017년에는 RIP-seq로 알려진 올리고뉴클레오티드 라벨 항체와 [59]CITE-seq로 알려진 항체를 통해 단세포 mRNA와 단백질 표현을 동시에 측정하는 두 가지 접근법이 도입됐다.[60] 패치클램프를 이용한 전기생리학 녹화에 따른 세포 내용 수집도 신경과학 분야에서 꾸준히 우위를 점하고 있는 패치-세크 방식의 개발이 가능해졌다.[61]

제한 사항

대부분의 RNA-Seq 방법은 mRNA를 풍부하게 하고 풍부하고 비정보적인 rRNA를 고갈시키기 위해 폴리(A) 꼬리 포획에 의존한다. 따라서, 그것들은 종종 폴리아데닐화 mRNA 분자의 염기서열화에 제한된다. 그러나 최근 연구들은 유전자 발현 조절에 있어서 긴 비코딩 RNA와 마이크로RNA와 같은 비폴리(A) RNA의 중요성을 이제 인식하기 시작하고 있다. 스몰세크는 포유류 세포에서 마이크로RNA, tRNA 파편, 작은 핵 RNA 등 작은 RNA(<300 뉴클레오티드)를 포획하는 단세포 방식이다.[62] 이 방법은 '올리고뉴클레오티드 마스크'(고도로 풍부한 5.8S rRNA 분자의 포획을 억제하는 것)와 크기 선택을 결합해 다른 고도로 풍부한 rRNA 분자와 같은 대형 RNA 종을 배제하는 방식이다. 긴 코딩 mRNA, 히스톤 mRNA, 원형 RNA, 엔한서 RNA와 같은 더 큰 비폴리(A) RNA를 대상으로 하기 위해, 고농축 리보솜 RNA 분자(18S 및 28s rRNA)[63]를 감산하는 데에는 크기 선택이 적용되지 않는다. 단세포 RamDA-Seq는 rRNA 분자에 대한 프라이밍을 피하기 위해 특별히 고안된 "비 랜덤하지 않은"(NSR) 프라이머가 있는 상태에서 무작위 프라이밍(랜덤 변위 증폭)으로 역전사를 수행하여 이를 달성하는 방법이다.[64] 이 방법은 염기서열을 위해 전장 총 RNA 대본을 성공적으로 캡처하고 감도가 높은 다양한 비폴리(A) RNA를 검출했지만, 몇 가지 한계가 있다. NSR 프라이머는 특정 유기체(마우스)의 rRNA 순서에 따라 신중하게 설계되었으며, 다른 종을 위한 새로운 프라이머 세트를 설계하는 데는 상당한 노력이 필요할 것이다. 최근, scDASH(혼성에 의한 풍부한 시퀀스의 단세포 고갈)라는 CRISPR 기반 방법은 단일 셀 총 RNA-seq 라이브러리에서 rRNA 시퀀스를 고갈시키는 또 다른 접근법을 보여주었다.[65]

박테리아와 다른 원핵생물들은 현재 폴리아데닐화 mRNA가 부족하여 단세포 RNA-seq에 적응할 수 없다. 따라서, 폴리(A) 꼬리 포획에 의존하지 않는 단세포 RNA-seq 방법의 개발은 단세포 분해능 마이크로바이옴 연구를 가능하게 하는 데도 도움이 될 것이다. 대량 박테리아 연구는 일반적으로 박테리아에 대한 폴리아데닐화 mRNA의 부족을 극복하기 위해 일반적인 rRNA 고갈을 적용하지만, 단세포 수준에서 한 세포에서 발견된 총 RNA는 너무 작다.[63] 단일 박테리아 세포에서 발견된 폴리아데닐화 mRNA의 부족과 총 RNA의 희소성은 박테리아 내 scRNA-seq의 전개를 제한하는 두 가지 중요한 장벽이다.

적용들

scRNA-Seq는 발달 생물학,[66] 신경학,[67] 종양학,[68][69][70] 면역학,[71][72] 심혈관계 연구[73], 전염병을 포함한 생물학 분야에서 널리 사용되고 있다.[74][75]

기계 학습 방법을 사용하여 벌크 RNA-Seq의 데이터를 사용하여 scRNA-Seq의 신호/소음 비율을 증가시켰다. 구체적으로 과학자들은 코엑스프레이징 네트워크를 구축하기 위해 범암 데이터세트의 유전자 발현 프로파일을 사용한 뒤 이를 단일 세포 유전자 발현 프로파일에 적용해 대본 수준을 이용해 개별 세포에서 돌연변이의 존재를 검출하는 보다 강력한 방법을 얻어냈다.[76]

일부 scRNA-seq 방법은 단일 세포 미생물에도 적용되었다. SMART-seq2는 단일 세포 진핵 미생물을 분석하는 데 사용되어 왔으나, 폴리(A) 꼬리 포획에 의존하기 때문에 원핵 세포에는 적용되지 않았다.[77] Drop-seq와 Fluidigm IFC-C1 장치와 같은 미세유체 접근법은 단일 말라리아 기생충 또는 단일 효모 세포의 염기서열 분석을 위해 사용되어 왔다.[78][79] 단세포 효모 연구는 이 효모가 소금 스트레스에 노출되기 전과 후에 이질적인 이산화 효모 세포 내 응력 내성을 특징짓기 위해 노력했다. scRNA-seq에 의한 여러 전사 인자에 대한 단세포 분석은 모집단 전체의 이질성을 드러냈다. 이러한 결과는 규제가 인구의 소수에게 생존 가능성을 높이기 위해 인구 구성원에 따라 다르다는 것을 시사한다.

원핵종에서 첫 번째 단세포 성적표 분석은 종단기 엑소누클레이저 효소를 사용하여 rRNA와 mRNA의 RCA(롤링 서클 증폭)를 선택적으로 저하시키는 방법으로 수행되었다.[80] 이 방법에서는 단일 가닥의 DNA의 끝을 함께 묶어서 원을 이루었고, 그 결과 생긴 루프는 선형 RNA 증폭을 위한 템플릿으로 사용되었다. 이어 최종 제품 라이브러리를 마이크로 어레이로 분석해 편향성이 낮고 커버력도 좋았다. 그러나 RCA는 일반적으로 차세대 염기서열을 채용하는 RNA-seq로 시험하지 않았다. 박테리아를 위한 단세포 RNA-seq는 마이크로바이옴 연구에 매우 유용할 것이다. 그것은 낮은 풍부도에서 존재하는 종을 포획하지 못하거나 세포 집단 간의 이질성을 해결하지 못하는 것과 같은 전통적인 대량 메타트랜스크라토믹스 접근방식에서 직면하는 문제들을 다룰 것이다.

scRNA-Seq는 곤충인 새너하브다염 선충과 [81]재생평면동물인 슈미드테아테라니아와[82][83] 액솔로틀 암비스토마 멕시콘을 포함한 배아와 유기체의 개발에 대한 상당한 통찰력을 제공했다.[84][85] 이런 방식으로 지도를 만든 최초의 척추동물로는 제브라피쉬와[86][87][88] 제노푸스 레비스가 있었다.[89] 각각의 경우 배아의 여러 단계를 연구하여 전체 발달 과정을 세포별로 매핑할 수 있도록 하였다. 과학은 이러한 진보를 2018년 올해의 돌파구로 인정했다.[90]

고려 사항.

단일 세포의 격리

전체 게놈 증폭과 염기서열화에 앞서 개별 세포를 분리하는 몇 가지 방법이 있다. 형광 활성 세포 분류(FACS)는 널리 사용되는 접근법이다. 개별 세포는 미세조직을 통해서도 수집될 수 있는데, 예를 들어 직렬 희석이나 패치 피펫이나 나노튜브를 사용하여 하나의 셀을 수확하는 것이다.[15][91] 미세조정의 장점은 용이하고 비용이 적게 들지만, 현미경상으로는 세포 유형의 오식별화에 취약하고 수고가 많다. 레이저 캡쳐 마이크로 단면(LCM)도 단일 셀 수집에 사용할 수 있다. LCM은 조직 내에서 샘플링된 세포의 공간적 위치에 대한 지식을 보존하고 있지만, 인접한 세포로부터도 물질을 수집하지 않고는 하나의 세포 전체를 포착하기 어렵다.[42][92][93] 단일 세포 격리를 위한 고투과 방법에는 미세유체학도 포함된다. FASS와 마이크로유체학 모두 정확하고 자동적이며 편향되지 않은 샘플을 분리할 수 있다. 그러나 두 가지 방법 모두 먼저 세포를 마이크로 환경으로부터 분리해야 하므로 RNA 표현 분석에서 전사 프로파일에 동요를 일으킨다.[94][95]

분석할 셀 수

scRNA-Seq

일반적으로 말하면, 일반적인 벌크 세포 RNA-시퀀싱(RNA-seq) 실험의 경우 1,000만 번의 판독이 생성되며, 임계값이 100만 건당 50회 이상(RPKM)인 유전자가 표현된 것으로 간주된다. 길이가 1kb인 유전자의 경우 이는 포아송 분포를 가정했을 때 500개의 판독치와 4%의 최소 변동 계수(CV)에 해당한다. 200,000 mRNA를 포함하는 일반적인 포유류 세포의 경우, 이 최소 CV 값을 달성하기 위해 적어도 50개의 단일 세포의 시퀀싱 데이터를 풀링해야 한다. 그러나 역전사 및 실험에 도입된 기타 소음의 효율성으로 인해 정확한 표현 분석과 세포형식별에는 더 많은 세포가 필요하다.[42]

참고 항목

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