패치 시퀀스

Patch-sequencing

패치 시퀀싱(patch-seq)은 뉴런의 특성화와 관련된 특정 문제에 대처하기 위해 설계된 방법입니다.신경 조직이 가장 전사적으로 다양한 세포 집단 중 하나이기 때문에, 뉴런이 형성되는 회로를 이해하기 위해 뉴런을 세포 유형으로 분류하는 것은 신경 [1]과학자들에게 큰 도전이다.고전적인 분류 방법과 단일 세포 RNA 염기서열 분석 후를 결합하는 것은 어렵고 느린 것으로 입증되었다.Patch-seq는 전기생리학, 염기서열 분석 및 현미경 검사와 같은 여러 데이터 양식을 결합하여 뉴런을 여러 방법으로 동시에 특성화할 수 있도록 합니다.이는 현재 주로 뉴런에 패치 클램프를 성공적으로 기록하는 데 수반되는 수작업으로 인해 다른 배열 방법에 비해 낮은 처리량을 겪고 있다.패치 클램프 테크놀로지를 자동화하여 패치 seq의 throughput도 개선하기 위한 조사가 현재 진행 중입니다.

Patch-Seq 다이어그램은 다음 3가지 주요 데이터 유형을 보여 줍니다.전기생리학 속성, 전사체 분석 및 형태학적 재구성.

배경

패치 클램프 이력

피펫이 신경소마로 씰을 형성하고 부압을 가하여 기가옴 씰을 형성한 그림

Patch-seq는 특수한 형태의 패치 클램프 기록 기술, 세포 전기생리학 밀리초 분해능, 특정 이온의 전류를 검출하는 능력, 그리고 아마도 가장 중요한 것은 세포막에 전압 클램프를 형성하는 능력에 대한 단세포 전기생리학 연구의 황금 표준입니다.이 기술은 처음에는 작은 유리관인 피펫을 사용하여 개발되었는데, 피펫은 빠르게 가열되고 늘어나서 개구부 직경이 3~5mm인 바늘 모양의 모양을 만들어 낸다.현대식 준비는 용도에 따라 다른 팁 직경을 사용합니다.피펫은 셀 표면에 눌러지기 전에 이온 전류를 전도하는 염탕으로 채워져 높은 전기 저항(단위 옴으로 측정)의 전기 씰을 형성하여 녹음 [2][3]시 노이즈를 낮춥니다.이 씰은 메가옴급이지만 조금만 흡입하면 저항이 기가옴 [4]이상인 씰이 되는 것으로 나타났다.고저항 씰을 통해 실험자는 전압 게이트 이온 채널을 연구하기 위해 원하는 전압으로 씰 내의 멤브레인 패치를 고정할 수 있습니다.막의 패치 위에 전압 클램프를 형성하는 이러한 능력은 이 기술의 이름을 부여합니다.이 클램프는 막의 휴지 전위와 활동 전위를 결정하는 이온 채널의 전압 의존 개방 역학을 테스트하는 데 매우 중요합니다.피펫 용액은 나트륨 채널, 칼륨 채널 및 칼슘 채널과 같은 특정 이온 채널을 목표로 하기 위해 특정 이온으로 채워질 수도 있습니다.이 기술의 발명자인 에르윈 네허와 버트 사크만은 패치 클램프를 개발하고 이온 채널의 존재를 증명하는 데 사용한 공로로 1991년 노벨 생리의학상을 수상했다.이온 채널의 개방 역학을 특징짓는 것은 신경학적, 당뇨병 [5]및 심장 [6]질환에 이르기까지 다양한 조건의 기초가 되는 생리학적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공해 왔다.많은 의학적 조건들은 생리학적 [7][8][9]과정의 기초가 되는 전기적 현상을 교란시키는 이온 채널을 코드하는 유전자의 돌연변이인 채널 패피스의 결과이다.

처음에는 피펫과 세포막 사이의 직접적인 접촉이 필요하기 때문에 배양 세포 준비에 패치 클램프의 사용이 제한되었습니다.브레인 슬라이스 제제는 피펫을 표적에서 차단할 수 있는 표적 세포, 혈액 및 림프관을 가지고 있다.이윽고 효소 용액의 적용이 뇌 슬라이스에도 [10]기록을 가능하게 한다는 것이 밝혀졌다.신경과학은 종종 심리학 이론과 그들의 기초 [11][12]생물학 사이의 관계를 테스트하기 위해 전기 생리학적 역학 및 행동에 대한 일치된 관찰을 필요로 합니다.패치 클램프에 사용되는 팁에 매우 얇은 점이 있는 섬세한 유리 튜브를 사용하여 이를 실현하려면 동물의 머리를 고정하거나 동물의 머리에 부착된 안정화 장치를 사용하여 상당한 기계적 안정화가 필요합니다.표적에서 벗어난 브레인 슬라이스 준비와 마찬가지로 물리적 장벽도 문제가 있으며 효소 용액으로는 제거할 수 없습니다.결국 이러한 기술적 어려움은 극복되었습니다.첫 생체내 기록은 마취된 머리 고정 [13]고양이에게서 이루어졌다.메인 씰이 손상되지 않도록 클리닝 피펫을 삽입하거나 사용하는 동안 양압을 가함으로써 피펫 팁이 타깃을 클램핑할 가능성을 줄였습니다.결국 이러한 기술들은 깨어있고, 머리를[14] 고정하는 동물들과 심지어 자유롭게 움직이는 [15]설치류들로까지 확장되었다.패치 클램프는 인접한 세포와 가까운 세포에서 기록하여 뉴런의 작은 조각이 서로 어떻게 연결되어 있는지 이해하고 임계값 이하의 이벤트를 [10]연구하기 위해 사용할 수 있습니다.

다른 전기 생리학적 기록 기법과 비교하여 클램프를 패치합니다.

멀티 전극 어레이와 형광 칼슘 센서와 같은 다른 현대적인 기록 기술은 훨씬 더 많은 뉴런에서 동시에 기록할 수 있는 대안으로 등장했지만 패치 클램프는 밀리초의 시간 분해능과 특정 이온 [16]전류를 연구하는 능력을 제공합니다.이와는 대조적으로 광유전학적 기록 기술에 의해 제공되는 최상의 시간 분해능은 약 수십 밀리초이며, 광학적 간섭으로 인해 표면에 가까운 구조에서만 사용할 수 있거나 간섭 [17]구조를 제거해야 합니다.또한 결정적으로 패치 클램프는 뉴런의 전기적 특성을 가장 잘 나타내기 위해 막에 전압 클램프 또는 전류 클램프를 적용할 수 있는 기능을 제공합니다.다른 어떤 기술도 멤브레인 전위를 정밀하게 제어할 수 있는 실험을 제공하지 않습니다.광유전학 기술은 아직 그에 필적할 만한 것을 제공하지 못하며 앞으로도 그럴 [18]것 같지 않다.

신경 세포 타이핑에는 여러 데이터 모달리티를 동시에 캡처해야 합니다.

피질 마이크로 회로

뉴런의 전기적 특성은 세포 유형을 정의할 때 중요하지만, 방출되는 신경전달물질의 종류, 시냅스에서 발현되는 신경전달물질 수용체, 신경계 및 국소 회로에서의 뉴런의 위치도 똑같이 중요하다.뉴런은 세포체, 수상돌기, 축삭의 많은 차이와 함께 매우 다양한 형태로 나타난다.수상돌기의 위치는 세포가 어떤 다른 뉴런으로부터 입력을 받는지 결정하며 그들의 모양은 뉴런이 이 입력에 어떻게 반응하는지에 큰 영향을 미칠 수 있다.마찬가지로 뉴런 축삭의 표적은 그 출력을 결정한다.뉴런 축삭과 수상돌기 사이에 형성되는 시냅스의 종류도 마찬가지로 중요하다.[19]예를 들어 오른쪽에 표시된 포유동물 피질의 피질 미세회로에서 세포는 국소회로 내뿐만 아니라 다른 피질 영역과 비피질 영역과의 입출력에 대해서도 매우 특이적인 투영 패턴을 가진다.수상돌기는 뉴런의 전기적 동작에도 영향을 미칠 수 있으며, 수상돌기가 시냅스 후 전위의 형태로 입력을 처리하는 방법에 큰 영향을 미칩니다.무질서한 기하학과 투영 패턴은 자폐증과 정신분열증을 포함한 다양한 정신 및 신경학적 조건과 연관되어 있지만, 이러한 표현형의 행동적 관련성은 아직 [20]이해되지 않았습니다.신경세포의 종류는 종종 서로 지속적으로 달라 보였다.형태전적 특성에 의한 뉴런 분류에 대한 이전의 시도는 양립할 수 없는 방법론과 다른 세포주 [21]선택에 의해 제한되었다.

단세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)의 등장으로 특정 고전적으로 정의된 특성을 가진 뉴런에서만 일관되게 발현되는 유전자가 존재하기를 희망했다.이 유전자들은 세포표지자 역할을 할 것이다.이것은 mRNA 염기서열 분석만을 사용하여 뉴런 유형을 빠르고 쉽게 묘사할 수 있는 더 나은 수단을 제공할 것이다.그러나 scRNA-seq는 지나치게 경직된 세포 유형의 정의가 [22]항상 뉴런을 특징짓는 최선의 방법은 아니라는 사실을 강조하는 데만 기여하는 것으로 나타났다.또한 유전자 발현은 동적으로 조절되며, 신경 [23][24]가소성을 가능하게 하는 세포형 특이적 방법의 활성에 반응하여 다양한 시간 척도에 따라 변화한다.다른 조직과 마찬가지로 발달 과정도 [25]고려될 필요가 있다.scRNA-seq의 결과를 고전적으로 정의된 신경 세포 유형과 일치시키는 것은 이러한 모든[26] 이유로 매우 어려우며, 추가로 단세포 RNA-seq는 신경 분류를 위한 자체 추출을 가지고 있다.scRNA-seq는 개별 뉴런의 유전자 발현 패턴 연구를 가능하게 하지만, 개별 세포 분리를 위해 조직을 교란시키고, 따라서 조직에서 뉴런의 원래 위치를 추론하거나 그 형태를 관찰하는 것은 어렵다.배열 정보를 전기생리학적 및 형태학적 특성에 의해 이전에 정의된 신경 아형에 연결하는 것은 느리고 복잡한 [27]과정이다.patch-seq에 의한 여러 데이터 유형의 동시 캡처와 통합은 유전자 발현, 전기생리학 및 형태학적 특성 및 신경 [16]기능 사이의 새로운 상관관계를 밝혀냄으로써 신경 분류에 이상적이다.따라서 patch-seq는 진정한 학제간 방법이 되며 전기생리학, 시퀀스 처리 및 이미징 [16]전문가 간의 협업이 필요합니다.

준비 및 모델 시스템 선택

패치섹은 뉴런의 세포배양을 포함한 모든 모델 시스템에서 수행될 수 있습니다.배양용 뉴런은 신경 조직으로부터 수집되어 분리되거나[28] 유도 다능성 줄기세포([29]iPSC)로부터 만들어질 수 있다. 이는 인간 줄기세포주로부터 성장한 뉴런이다.세포 배양 제제는 패치 클램프를 적용하기 가장 쉬우며, 예를 들어 호르몬이나 신경 전달 물질과 같이 뉴런이 어떤 배위자에 노출되는지 실험자에게 통제권을 줍니다.그러나 종합적인 실험 제어의 이점은 뉴런이 발달하는 동안 노출될 자연 환경에 노출되지 않는다는 것을 의미한다.앞서 언급했듯이 뇌 구조를 가진 뉴런의 위치뿐만 아니라 그들의 수상돌기와 축삭이 확장되는 위치도 회로 내에서의 뉴런의 역할을 이해하는 데 매우 중요하다.다양한 동물의 [30][31]뇌 조각을 위한 많은 준비물들이 존재한다.피펫 및 타깃 셀을 방해하는 셀 또는 이물질이 존재하기 때문에 준비물을 약간 수정해야 하며 의도하지 않은 씰을 형성하지 않도록 피펫에 약간의 양의 압력이 가해지는 경우가 많습니다.행동이 신경 이벤트의 역학과 어떻게 연관되어 있는지 이해하는 것이 관심이라면 생체 내 기록도 가능하다.생체 내 연구를 위해 패치 클램프를 적응하는 것은 특히 동작 작업 중에 기계적 이유로 매우 어려울 수 있지만 이미 [15]시행되었다.자동화된 생체 내 패치 클램프 방법이 [32]개발되었습니다.비인간 영장류와 영장류 피질에서 뉴런 크기의 다양성이 더 다양하기 [16]때문에 표적 뉴런을 죽이지 않고 물개를 형성하기 위해 다른 끝 직경과 압력을 사용해야 할 수 있지만 포유류 종에 대한 준비 사이에는 거의 차이가 없다.패치섹은 췌장 또는 심장 [33]세포와 같은 비신경적 연구에도 적용된다.

패치 순서 워크플로우

모델 시스템 및 준비 유형 패치-세크 실험도 유사한 워크플로우를 가집니다.먼저 셀과 피펫 사이의 씰을 확립하여 기록 및 수집을 수행합니다.셀은 기록 [34]중에 이미징을 위해 형광 라벨로 채워질 수 있습니다.다음 기록 음압은 시퀀싱을 위해 세포와 종종 핵을 포착하기 위해 가해진다.이 과정은 준비 중인 세포가 분해되어 데이터를 수집할 가치가 없을 때까지 반복됩니다.영상 데이터의 사후 분석을 통해 형태학적 재구성이 가능합니다.현명하고 복잡한 [35]전사체 데이터의 사후 처리와 마찬가지로 피펫을 통해 세포에서 세포질 함량을 수집할 때 많은 혼동을 처리하기 위해서도 종종 필요하다.[1] [2]

피펫과 셀 사이의 씰 형성

패치 피펫은 전체 셀 기록을 위해 설계되었기 때문에 개방 직경이 단일 이온 채널을 검사하기 위해 수행된 실험보다 큽니다.대부분의 경우 표준 패치 클램프 프로토콜을 사용할 수 있지만, 피펫과 내부 솔루션에 따라 약간의 수정 사항이 있을 수 있습니다.세포 내부를 피펫에 흡인하기 쉽게 하기 위해 더 넓은 직경을 사용할 수 있지만 표적 세포 [36]유형에 따라 조절해야 할 수도 있다.음압을 가하여 기록 시 더 좋을 뿐만 아니라 시퀀싱을 위한 셀 내용물 수집 후 또는 수집 중에 세포 내 유체 누출 및 오염을 방지합니다.기록 중에 비오틴은 이미징 및 나중에 형태학적 [34]재구성을 위해 피펫을 통해 세포에 확산될 수 있다.

전기 생리학적 기록

씰이 설정되면 램프, 사각 펄스 및 노이즈 전류 주입과 같은 전압 클램프를 사용하여 셀에 서로 다른 자극 방식을 적용합니다.휴지막 전위 및 역치 전위를 포함한 세포체 막의 특징을 기록한다.AP 폭, AP 진폭, 탈분극 후 및 과분극 후 진폭 등 생성된 활동전위(AP)에서 관찰된 특징도 [21][27]기록된다.전세포 기록은 소량의 세포내 용액(RNA 희석을 피하기 위해), 칼슘 킬레이터, RNA 캐리어 및 RNase 억제제를 [16]충전한 패치 레코딩 피펫을 사용하여 이루어진다.EGTA와 같은 RNase 억제제의 첨가는 [27]샘플로부터 더 높은 품질의 RNA를 보존함으로써 전사체 분석을 강화한다.기록 시간은 팽창으로 인한 뉴런 구조에 영향을 주지 않고 1분에서 15분 정도 걸릴 수 있으며, 값이 작을수록 [31]기술의 처리량이 증가합니다.데이터는 MIES,[21][37] PATCHMASTER,[38] PCLamp,[39] WaveSurfer [40]등의 상용 또는 오픈 소스 소프트웨어로 기록 및 분석됩니다.

뉴런은 그들의 휴식막 전위를 검증하고 실험 전체와 실험 중에 그들의 기준선을 안정시키기 위해 미리 자극된다.세포는 램프와 사각 전류에 의해 자극되며 전기생리학적 특성이 기록되고 측정됩니다.자극 후 기록이 일관되고 견고하기 위해서는 멤브레인 전위가 기준값으로 돌아와야 한다.막의 안정성을 되돌리기 위해 기록의 마지막에 음압을 사용합니다.측정은 [31]추가 분석을 위해 이러한 조건을 충족해야 한다.기록 중에 세포가 패치 클램핑되는 것은 세포에 스트레스를 주기 때문에 세포의 생존력을 유지해야 합니다.

핵추출

음압은 전극을 소마 중앙 부근으로 이동시키면서 피펫 팁 부근에서 핵을 이동시키는 데 사용됩니다.해당 모델 시스템은 가해지는 부압에 영향을 미칩니다.인간과 인간이 아닌 영장류에서는 세포 생존을 보장하기가 더 어렵다.설치류 모델에 비해 신경 크기의 변화가 크면 세포와 [16]핵을 추출하기 위해 가해야 하는 음압의 양이 더 다양하다는 것을 의미한다.회수 후 피펫은 선단부가 막씰을 형성한 상태에서 핵을 둘러싼 막이 세포에서 분리될 때까지 부압을 유지한 채 천천히 수축한다.멤브레인 씰은 피펫에서 추출된 내용을 트랩하여 시퀀싱을 위한 제거 중 오염을 방지한 후 다른 기록을 위해 피펫을 준비합니다.씰의 구조는 저항 증가(MΩ)[31]를 통해 전기적으로 관찰할 수 있습니다.셀을 [31]터트리지 않기 위해서는 정밀도가 필요하기 때문에 검색 프로세스는 느리고 종종 10분 정도 걸립니다.

문자 변환학

기록된 [27][31]뉴런에서 추출된 핵과 세포질을 이용하여 RNA-seq 분석을 실시한다.RNA는 전체 길이의 cDNA로 증폭되고 시퀀싱을 위해 라이브러리가 구성됩니다.핵을 포함한 분석은 mRNA의 수율이 높을 뿐만 아니라 데이터 [21]품질도 향상된다.

샘플은 성상세포나 다른 유형의 뉴런과 같은 인접 세포로부터의 RNA 오염을 포함하여 RNA 함량에 높은 수준의 변동성을 나타낸다.품질은 정의된 마커 유전자에 의해 평가되며, RNA 함량이 관심 세포 등급의 표적(마커)을 포함하는지 여부 및 오염 마커(오프 마커)[31]를 포함하지 않는지 여부를 나타냅니다.수집된 RNA의 품질을 판단하기 위해 다양한 측정기준이 사용됩니다.

  • 정규화 마커섬(NMS) 점수: 형광활성화세포분류(FACS) 등의 세포해리법을 사용한 유사 데이터로부터의 동일 유전자의 중앙발현에 대한 패치세크세포의 마커 유전자의 비율.세포분리법은 기술적 문제를 줄이고 표준화 방법으로 [35]작용한다.점수는 샘플에서 알려진 세포 등급까지의 유전자 발현 유사성 패턴을 측정합니다.낮은 NMS 점수는 마커 유전자의 검출이 감소했음을 나타냅니다. 오프 마커 [31]유전자의 증가보다 더 큽니다.
  • 오염 점수:추출 중에 가까운 세포에서 RNA가 오염될 가능성을 나타냅니다.다른 신경 과정과 상호작용하는 소마로 [35]피펫 이동으로 인해 오염이 발생할 수 있습니다.이것은 할당된 셀클래스와 일치하지 않는 모든 광범위한 셀타입의 NMS 점수의 합계로 계산됩니다.
  • 품질 점수:동일 유형의 세포 해리 방법을 사용하여 분석한 세포의 평균 발현 프로파일과 패치섹 결과에서 온/[31]오프 마커 유전자의 상관관계를 측정한다.
  • 핵 존재 마커:핵 특이 유전자(포유동물에서 [35][41]말라트1과 같은)의 검출과 인트로닉 판독 비율의 증가는 RNA-seq 분석에 핵을 포함시키는 증거를 제공한다.

형태학적 재구성

수지상/축방향 수목, 축방향 형상, 시냅스 접점 및 소마 위치와 같은 뉴런 모양과 구조가 신경 유형 분류에 사용된다.급성 슬라이스 제제 또는 생체 내에서는 중요한 기능적 결과도 있으므로 층상 위치가 기록된다.비오틴에 의한 염색은 뉴런 전기생리학적 [42]기록 중에 수행됩니다.또는 세포 외부에 첨가된 로다민은 [43]기록하기 전에 살아있는 세포를 상상하게 한다.이미징은 개별 셀의 밝은 필드 투과 및 형광 채널에 의해 2차원 타일링된 이미지로 수행된 후 상용 또는 오픈 [31]소스 소프트웨어로 처리됩니다.급성 슬라이스와 비교하여 배양된 뉴런에서 더 높은 해상도의 영상을 얻을 수 있으며, 더 높은 품질의 형태학적 [16]재구성을 얻을 수 있다.

사후 3D 재구성은 TReMAP,[44] Mozak [45]또는 Va3D와 [46]같은 이미지 처리 소프트웨어로 이루어집니다.결과의 품질은 전기 생리학적 기록 시간에서 핵 추출 절차까지 다양한 요인에 따라 달라집니다.재구성된 세포는 구조의 완전성과 완전성에 따라 4가지 품질 수준으로 분류된다.소마 및 프로세스가 완전히 보이고 적절한 디지털 재구성이 가능한 경우 고품질, 소마 및 일부 프로세스가 보이지만 3D 재구성과 호환되지 않는 경우 중품질, 수지상돌기가 비오틴으로 채워져 있지만 축삭이 약하게 염색된 경우 불충분한 축삭, 서브로 인해 소마 얼룩이 부족할 수 있는 축삭핵 추출 [31]후 구조물의 측면.

다운스트림 데이터 분석

결과 멀티모달 데이터를 처리하고 결합하기 위한 워크플로우를 설계하는 것은 패치세크가 적용되는 특정 연구 질문에 따라 달라집니다.세포 타이핑 연구에서 데이터는 샘플 크기가 더 크고(수십 또는 수백 개의 세포에 비해 수천 개의 세포 순서) 따라서 전사체 데이터만을 사용하여 세포 유형 식별을 위한 통계적 힘이 더 큰 기존 scRNA-seq 연구와 비교되어야 한다.이 순서에서는,[21][47] 상관 베이스의 방법으로 충분합니다.그런 다음 T 분포 확률적 인접 임베딩 또는 균일한 매니폴드 근사 및 투영과 같은 차원 축소 방법을 사용하여 더 높은 품질의 scRNA-seq [48]데이터의 기준 아틀라스에서 수집된 데이터의 위치를 시각화할 수 있다.유전자 발현 데이터를 형태학적 및 전기생리학 데이터와 관련짓기 위해 머신러닝을 적용할 수 있다.이를 위한 방법으로는 자동 인코더,[49] 병목 네트워크 [50]또는 기타 순위 감소 [48]방법이 있습니다.형태학적 데이터를 포함하는 것은 컴퓨터 비전 태스크로 기계 학습에서 악명 높은 복잡한 문제이기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다.형태학적 재구성의 이미징 데이터를 [16]분석에 포함하기 위한 특징 벡터로 표현하기는 어렵다.

적용들

패치-섹 통합 데이터 세트를 사용하면 특히 뉴런에서 세포 유형을 포괄적으로 특성화할 수 있다.신경과학자들은 이 기술을 다양한 실험과 프로토콜에 적용하여 전사체 데이터와 신경 형태 전기 특성 사이의 상관관계를 바탕으로 새로운 세포 서브타입을 발견해 왔다.패치섹 데이터에 기계 학습을 적용하면 전사체 데이터를 연구하여 각각의 형태 전기 [16]특성에 연결할 수 있다.견고한 세포 유형 분류에 대한 확인된 근거 진실을 갖는 것은 연구자들이 행동, 언어, 신경 및 정신 질환의 기초 과정과 같은 복잡한 과정에서 특정 뉴런 유형과 하위 유형의 기능을 볼 수 있게 한다.프로테오믹스와 트랜스크립토믹스의 비교는 트랜스크립트 데이터가 반드시 동일한 단백질[51] 발현으로 변환되는 것은 아니며 마찬가지로 트랜스크립트롬 데이터와 결합된 고전적인 분류 방법에서 뉴런의 표현형의 기본 진실을 볼 수 있는 능력이 신경과학에 중요하다는 것을 보여주었다.전사체 결과를 뒷받침하는 패치섹 실험들이 발견되었지만, 다른 실험들은 다른 뇌 영역에서 유사한 전사체 정의 세포 유형의 [16]형태학이 일치하지 않는 사례들을 발견했다.이 기술은 특히 신경과학에 적합하지만 일반적으로 전기생리학, 형태학 및 전사체학을 동시에 알아야 하는 모든 조직이 패치섹에 사용될 것입니다.예를 들어,[33] 췌장섬과 같은 비신경조직에도 당뇨병을 연구하기 위해 패치세크가 적용되었다.

단일 세포 시퀀싱에서 얻은 전사체 데이터에서 뉴런 형태와 전기 생리학적 특성을 예측하기 위해 기계 학습 알고리즘에 통합된 Patch-Seq 데이터 세트.
  • 표적 신경 집단 연구: 패치-섹은 표본을 방해하지 않고 표적 신경 세포로부터 유전 정보를 측정하고 추출하는 능력에 있어 다른 방법론에 비해 우수합니다.이를 통해 연결성, 슬라이스 내 위치, 형태학 등 뉴런 특성에 대한 전사체 데이터의 정확한 역추적이 가능합니다.이러한 데이터 유형 간의 상관관계 연구는 뉴런 유형에 걸친 차이 발현 유전자를 식별하고 빠른 [16]분류를 위한 유전자 마커를 발견하는 데 도움이 된다.
  • 다중모달 세포 유형 데이터베이스 편집 및 통합: Patch-seq는 단일 세포 RNA-seq 연구의 대규모 전사 데이터베이스에 뉴런 기능 특성을 통합하기 위해 사용되어 왔다.패치-섹은 고품질 표준을 달성하기 어렵기 때문에 형태학이 덜 일반적이므로 [31]전기생리학 및 형태학 데이터를 제공할 수 있다.하나의 데이터 유형만으로는 셀 유형의 정확한 라벨링을 얻을 수 없기 때문에 멀티모달 데이터의 통합이 필요합니다.이전의 연구는 전사적으로 유사한 뉴런이 다른 형태 전기적 [52]특성을 가질 수 있다는 것을 보여주었다.
  • 형태학적 및 기능적 다양성의 분자 기반:뉴런의 형태학적, 기능적 다양성을 정의하는 분자 메커니즘에 대한 연구는 진행 중이다.Patch-seq는 알려진 구별된 세포 유형들 사이의 분화 발현 유전자의 식별을 가능하게 한다.유전자 발현의 작은 변화는 세포가 자극에 대해 다른 반응을 나타내게 할 수 있으며, 이는 적절한 [53]분류를 위해 이 데이터를 연관시키는 것의 중요성을 강조한다.

제한 사항

patch-seq에 대한 가장 심각한 제한은 일반적으로 패치 클램프 기법에 의해 공유되는 제한으로, 이는 높은 충실도와 능숙한 수작업의 요건이다.패치 클램핑은 예술의 한 형태로 설명되어 왔으며, 기술을 완성하기 위해서는 연습이 필요합니다.따라서, 노동 집약적일 뿐만 아니라,[54][55] 이 기술을 습득하는 데에도 수년간의 훈련이 필요합니다.지금까지 가장 큰 패치섹 연구는 생쥐의 1차 시각 피질의 급성 피질 슬라이스에서 이루어졌다.4000개가 조금 넘는 뉴런이 패치되고 배열이 이루어졌으며 엄청난 양의 [31]수작업이 필요했다.대부분의 다른 데이터 세트는 수십 또는 수백 개의 셀에서 수집되었습니다.조직을 [16]분리하여 시퀀싱을 위해 수집된 세포보다 훨씬 적습니다.그럼에도 불구하고 다른 전기생리학 기록의 기술은 패치섹의 시간 분해능이나 특정 이온 전류를 특징짓는 능력에 필적할 수 없으며 전압 클램프를 생성하는 용량을 제공할 수 없다.이러한 이유로 이 기술을 자동화하는 것은 패치-섹을 포함한 패치 클램핑을 사용하는 애플리케이션에 대해 전 세계 많은 연구소에서 활발하게 조사되고 있는 분야입니다.

디지털 이미징을 통한 형태학적 재구성은 합격률이 50% [31]미만인 기술의 또 다른 한계입니다.대량의 이미지와 대량의 노이즈의 적절한 통합과 핵 추출에 의한 구조적 교란은 신경과학에서 계산상의 난제가 됩니다.새로운 자동 추적 방법이 개발되고 있지만 품질은 여전히 [56]낮습니다.

장래의 방향

기타 배열 기술, 단백질학 및 단세포 유전자 조작 통합

지금까지 사용된 시퀀스 기술은 mRNA 시퀀스 기술뿐이었습니다.다른 양식도 포함하면 생성된 데이터에 포함된 "오믹"의 수가 증가합니다.예를 들어 mRNA를 DNA에서 분리하는 기술은 DNA에 대한 [36]변형을 연구할 수 있게 할 수 있다.염색질 접근성은 DNA 메틸화와 ChIP 염기서열 분석의 메틸화 DNA 면역 침강 및 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화를 사용하여 판단할 수 있다.이것은 패치섹 실험에서 후생유전학의 연구를 가능하게 할 것이다.마찬가지로 단백질을 분리하는 것은 단백질학과의 통합을 가능하게 하는 단백질의 풍부함을 판단하는데 유용할 것이다.CRISPR은 단일 세포 수준에서 [16]돌연변이의 영향을 조사하기 위해 피펫에 포함되어 기록 중에 주입될 수 있습니다.

자동 패칭

patch-seq의 throughput에서 가장 큰 병목은 패치 클램핑에 필요한 작업입니다.천천히 자동화된 패치 클램프가 표준이 되기 시작했지만 아직 널리 채택되지는 않았습니다.이는 일부 자동 패싱 장치가 인간보다 성공적으로 시도된 봉인 비율과 데이터 수집 속도를 가지고 있음에도 불구하고 발생합니다.자동 패치 클램핑은 압력 센서에 의존하여 로봇 장치가 씰을 형성하고 기록하도록 유도하는 알고리즘에 대한 입력을 제공하는 대신 이미징 정보 없이 블라인드 방식으로 수행될 수 있습니다.또, 형광 라벨이 붙은 세포를 대상으로 하는 화상 유도 알고리즘도 존재한다.일부 시스템은 특정 모델 시스템 [55]및 준비에 더 적합합니다.[3]

「 」를 참조해 주세요.

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