생어 시퀀싱

Sanger sequencing

생어 시퀀싱은 전기영동을 수반하는 DNA 시퀀싱 방법이며 시험관 내 DNA 복제 중 DNA 중합효소에 의한 사슬 종단 디데옥시뉴클레오티드의 무작위 결합에 기초한다.1977년 Frederick Sanger와 동료들에 의해 처음 개발된 후, 약 40년 동안 가장 널리 사용되는 배열 방식이 되었다.1986년 Applied Biosystems에 의해 처음 상용화 되었다.최근에는 특히 대규모 자동 게놈 분석을 위해 대용량의 Sanger 염기서열 분석 방법이 차세대 염기서열 분석 방법으로 대체되었습니다.그러나 Sanger 방법은 소규모 프로젝트 및 심층 시퀀싱 결과 검증에 널리 사용됩니다.500개 이상의 뉴클레오티드의 DNA 염기서열 판독치를 생성할 수 있고 정확도가 약 99.99%[1]로 매우 낮은 오류율을 유지할 수 있다는 점에서 Illumina와 같은 단판 배열 기술보다 여전히 유리하다.생어 시퀀싱은 여전히 SARS-CoV-2에서[2] 급증하는 단백질을 배열하는 것과 같은 공중 보건 이니셔티브와 질병통제예방센터(CDC)의 칼리시넷 감시 [3]네트워크를 통한 노로바이러스 발생 감시에 활발하게 사용되고 있다.

DNA 염기서열 분석을 위한 Sanger(체인 종단) 방법.

방법

형광 ddNTP 분자

전통적인 연쇄 종단 방법은 단일 가닥 DNA 템플릿, DNA 프라이머, DNA 중합효소, 정상 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs) 및 변형 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dnTPs)를 필요로 하며, 이 중 후자는 DNA 가닥의 연장을 종료한다.이러한 사슬 종단 뉴클레오티드는 두 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합 형성에 필요한 3'-OH기가 부족하여 변형된 ddNTP가 통합될 때 DNA 중합효소가 DNA의 확장을 중단시킵니다.ddNTP는 자동 시퀀싱 기계에서 검출하기 위해 방사능 또는 형광 라벨로 표시될 수 있습니다.

DNA 샘플은 4개의 디옥시뉴클레오티드 표준(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)과 DNA 중합효소 모두를 포함하는 4개의 개별 배열 반응으로 나뉜다.각 반응에는 4가지 디데옥시뉴클레오티드(ddATP, ddGTP, ddCTP 또는 ddTTP) 중 하나만 첨가되며, 다른 첨가된 뉴클레오티드는 일반적인 반응이다.디옥시뉴클레오티드 농도는 디옥시뉴클레오티드 농도(예: 0.5mM dTTP : 0.005M ddTTP)보다 약 100배 높아야 완전한 염기서열을 전사하면서 충분한 조각이 생성된다(단, ddNTP 농도는 원하는 [4]염기서열의 길이에 따라 다름).보다 합리적인 순서로 말하면, 4개의 ddNTP를 모두 테스트하려면 이 프로세스에서 4개의 개별 반응이 필요합니다.결합된 프라이머에서 템플릿 DNA를 확장한 후 생성된 DNA 조각은 겔 전기영동을 사용하여 열변성되고 크기에 따라 분리됩니다.1977년 [4]초판에서는 ssDNA의 염기쌍 루프 형성이 일부 위치에서 밴드 해결에 심각한 어려움을 초래했다.이것은 종종 변성 폴리아크릴아미드 요소 겔을 사용하여 4개의 개별 레인 중 하나(LAN A, T, G, C)에서 각각 4개의 반응을 실행한다.그런 다음 DNA 밴드는 자동 방사선 촬영 또는 UV 빛으로 시각화할 수 있으며, DNA 시퀀스는 X선 필름 또는 겔 이미지에서 직접 읽을 수 있습니다.

방사성 라벨이 부착된 시퀀싱 젤의 일부

오른쪽 이미지에서 X선 필름은 겔에 노출되었으며 어두운 띠는 길이가 다른 DNA 조각에 해당합니다.레인 내의 어두운 띠는 디데옥시뉴클레오티드(ddATP, ddGTP, ddCTP 또는 ddTTP)의 혼입 후 사슬 종료의 결과인 DNA 단편을 나타냅니다.그리고 아래에서 위로 4개 레인의 다른 밴드들의 상대적인 위치를 사용하여 DNA 시퀀스를 읽습니다.

DNA 조각은 프라이머(1)에 방사성 또는 형광 태그를 부착하거나, 새로운 DNA 가닥에 라벨이 부착된 dNTP 또는 라벨이 부착된 ddNTP로 라벨링된다.

연쇄 종단 시퀀싱의 기술적 변화로는 방사성 인을 포함한 뉴클레오티드에 의한 태깅 또는 형광 염료로 5' 끝에 라벨이 부착된 프라이머를 사용하는 것이 포함된다.염료 프라이머 시퀀싱은 광학 시스템에서 판독을 용이하게 하여 보다 빠르고 경제적인 분석 및 자동화를 가능하게 합니다.Leroy Hood와 형광[5][6] 라벨이 부착된 ddNTP 및 프라이머의 동료들에 의한 이후 개발은 자동화된 높은 처리량 DNA 염기서열 분석을 위한 기반을 마련했습니다.

형광 피크와 비교하여 방사성 시퀀싱에 의한 시퀀스 래더

연쇄 종단 방법은 DNA 염기서열 분석을 크게 단순화했다.예를 들어, 시퀀싱에 필요한 시약, 사전 견적 및 즉시 사용 가능한 시약이 들어 있는 체인 종단 기반 키트가 시판되고 있습니다.제한사항에는 DNA 배열의 정확한 판독에 영향을 미치는 프라이머의 DNA에 대한 비특이적 결합과 배열의 충실도에 영향을 미치는 DNA 2차 구조가 포함된다.

염료 터미네이터 시퀀싱

모세관 전기영동

염료종단자 배열방법은 연쇄종단자 ddNTPs의 라벨 부착을 이용하여 라벨 부착 프라이머법과 같이 4가지 반응이 아닌 1가지 반응으로 배열할 수 있다.염료 말단자 배열에서 4개의 디옥시뉴클레오티드 사슬 종단자는 각각 다른 파장의 빛을 방출하는 형광 염료로 라벨링된다.

염료 터미네이터 시퀀싱은 편리성과 속도가 향상되었기 때문에 현재 자동화된 시퀀싱의 주류가 되고 있습니다.한계에는 염료 라벨이 부착된 사슬 터미네이터를 DNA 단편에 통합하는 차이로 인한 염료 효과가 포함되어 모세관 전기영동 후 전자 DNA 배열 추적 크로마토그램의 피크 높이와 모양이 동일하지 않다(왼쪽 그림 참조).

이 문제는 변형된 DNA 중합효소 효소 시스템과 혼입 변동을 최소화하는 염료의 사용과 함께 "염료 방울"을 제거하는 방법으로 해결되었다.염료 터미네이터 염기서열 분석 방법은 차세대 염기서열 분석 기술이 도입될 때까지 대부분의 염기서열 분석 프로젝트에 사용되었습니다.

자동화 및 샘플 준비

염료 터미네이터 판독 예제의 시작 보기

자동화된 DNA 염기서열 분석 기구(DNA 염기서열 분석기)는 단일 배치에 최대 384개의 DNA 샘플을 염기서열화할 수 있습니다.배치 실행은 하루에 최대 24회 발생할 수 있습니다.DNA 시퀀서는 모세관 전기영동을 사용하여 크기(또는 길이)별로 가닥을 분리하고 염료 형광을 검출하여 기록하고 형광 피크 추적 크로마토그램으로 데이터를 출력합니다.시료를 시퀀서에 로드하기 전에 완충액 내 시료의 배열 반응(열순환 및 라벨 표시), 세척 및 재현탁을 별도로 실시한다.많은 상용 및 비상용 소프트웨어 패키지에서 저품질 DNA 트레이스를 자동으로 트리밍할 수 있습니다.이러한 프로그램은 각 피크의 품질에 점수를 매겨 낮은 품질의 기본 피크(일반적으로 시퀀스의 끝에 위치)를 제거합니다.이러한 알고리즘의 정확도는 인간의 조작자에 의한 육안 검사보다 떨어지지만 큰 시퀀스 데이터 세트의 자동 처리에 적합합니다.

염료 종단 시퀀싱의 응용

공중 보건 분야는 잠재적인 독성 물질과 순환하는 생물학적 병원체의 환경 감시뿐만 아니라 환자 진단도 지원하는 많은 역할을 한다.2020년 [7]1월 30일 공중 보건 비상사태로 선포된 대유행 기간 동안 전 세계 공중 보건 연구소(PHL)와 다른 연구소는 COVID-19의 원인 물질인 바이러스 SARS-CoV-2의 감시에 대한 신속한 염기서열 분석 데이터를 제공하는 데 중추적인 역할을 했다.실험실은 시퀀싱 방법을 신속하게 구현해야 하며 바이러스 확산을 줄이기 위한 정책 개발을 위한 의사결정 모델에 도움이 되는 정확한 데이터를 제공할 것을 요청받았다.많은 연구소가 차세대 시퀀싱 방법을 사용했고 다른 연구소는 Sanger 시퀀싱을 지원했습니다.SARS-CoV-2의 염기서열 분석 작업은 많은 반면, 대부분의 실험실은 바이러스의 전체 게놈 염기서열 분석을 시행하고 있는 반면, 다른 실험실은 S-유전자와 같은 바이러스의 매우 구체적인 유전자 염기서열 분석을 선택하면서, 스파이크 단백질을 생성하는 데 필요한 정보를 암호화하고 있다.사스-CoV-2의 높은 돌연변이율은 S-유전자 내 유전적 차이로 이어지고 이러한 차이는 바이러스의 [8]감염성에 영향을 미쳤다.S-Gene의 Sanger Sequencing은 유전자 코드를 빠르고 정확하게 검색할 수 있는 보다 저렴한 방법을 제공합니다.저소득 국가의 실험실은 차세대 시퀀싱과 같은 고가의 애플리케이션을 구현할 능력이 없을 수 있으므로 변종 감시를 위한 시퀀싱 데이터 생성을 지원하는 Sanger 방법이 우세할 수 있다.

생어 시퀀싱은 질병통제예방센터(CDC)의 CaliciNet 네트워크의 노로바이러스 감시 방법의 "골드 스탠다드"이기도 합니다.CalciNet은 2009년 3월에 설립된 감염 감시 네트워크입니다.이 네트워크의 목표는 미국에서 순환하는 노로바이러스의 염기서열 데이터를 수집하고 바이러스 확산을 줄이기 위해 감염원을 결정하는 다운스트림 조치를 활성화하는 것이다.CalciNet 네트워크는 많은 감염을 식인성 [9]질병으로 식별했다.이 데이터는 게시되고 향후 식품 오염 방지를 위한 권장사항을 개발하는 데 사용될 수 있습니다.노로바이러스의 검출에 사용되는 방법은 게놈의 특정 영역의 표적 증폭을 포함한다.그런 다음 색소 종단 Sanger 시퀀싱을 사용하여 앰픽을 배열하고 생성된 크로마토그램과 시퀀스를 BioNumerics에서 개발한 소프트웨어 패키지로 분석합니다.역학적 관련성을 추론하기 위해 시퀀스를 추적하고 변형률 관련성을 연구한다.

과제들

Sanger 방법에 의한 DNA 염기서열 분석의 일반적인 과제로는 프라이머 결합으로 인한 염기서열의 첫 15-40 염기서열에서의 품질 저하와 700-900 염기서열 분석 후 염기서열 분석의 품질 저하가 있다.Phred와 같은 기본 호출 소프트웨어는 일반적으로 시퀀스의 [10][11]저품질 영역을 트리밍하는 데 도움이 되는 품질의 견적을 제공합니다.

염기서열 분석 전에 DNA 조각이 복제되는 경우, 결과 염기서열은 복제 벡터의 일부를 포함할 수 있다.이와는 대조적으로 PCR 기반 클로닝과 파이로시퀀싱에 기반한 차세대 시퀀스 기술에서는 클로닝 벡터를 사용하지 않는 경우가 많습니다.최근에는 Ampliseq, SeqSharp 등 클로닝이나 사전 [12][13]증폭 없이 표적 유전자의 신속한 염기서열 분석을 가능하게 하는 원스텝 생거 염기서열결정법(증폭 및 염기서열 복합)이 개발됐다.

현재 방법은 단일 반응으로 비교적 짧은(300-1000 뉴클레오티드 길이) DNA 조각만 직접 배열할 수 있습니다.이 크기 한계를 초과하는 DNA 조각의 배열에 대한 주요 장애물은 길이가 단 하나의 뉴클레오티드에 의해 다른 큰 DNA 조각들을 분해하기 위한 분리의 힘이 부족하다는 것이다.

마이크로유체 생거 시퀀싱

마이크로유체 생거 시퀀싱은 DNA 시퀀싱을 위한 랩 온 칩 애플리케이션으로, 생거 시퀀싱 단계(열 사이클, 샘플 정제 및 모세관 전기영동)가 나노리터 스케일 샘플 볼륨을 사용하여 웨이퍼 스케일 칩에 통합되어 있습니다.이 기술은 Sanger 시퀀스 처리 단계를 통합 및 자동화함으로써 기존 Sanger 방법의 많은 단점(예: 고가의 시약 소비량, 고가의 장비에 대한 의존도, 인력 집약적인 조작 등)을 제거하면서 길고 정확한 시퀀스 판독을 생성합니다.

그것의 현대적 시작에서, 높은 처리량 게놈 배열은 게놈을 작은 단일 가닥 조각으로 단편화한 후, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 단편들을 증폭시키는 것을 포함한다.Sanger법을 채택하여 형광표지 디데옥시 사슬 종단 뉴클레오티드의 혼입에 의해 각 DNA 단편이 불가역적으로 종단되며, 그 결과 길이가 1염기씩 다른 단편의 DNA "래더"가 생성되어 말단 염기에 염기 특이 형광라벨이 부착된다.다음으로 증폭된 베이스 래더는 형광 라벨이 부착된 ssDNA 단편의 "마감선" 검출을 자동화한 모세관 어레이 전기영동(CAE)에 의해 분리되며, 이는 단편의 순서를 제공한다.이러한 시퀀스 판독치는 컴퓨터가 겹치거나 연속된 시퀀스('농도'라고 함)로 조립되며, 이는 완전히 [14]조립된 후 완전한 게놈 시퀀스와 유사합니다.

Sanger 메서드는 읽기 길이가 약 800bp(일반적으로 비농축 DNA의 경우 500~600bp)에 달합니다.Sanger 방법의 판독 길이가 길수록 특히 게놈의 반복 영역 배열 측면에서 다른 배열 방법에 비해 상당한 이점이 있습니다.단독 배열 데이터의 과제는 특히 새로운 게놈(de novo)의 배열과 고도로 정렬된 게놈 세그먼트([15]일반적으로 암 게놈 또는 구조적 변화를 보이는 염색체 영역)의 배열에 관한 문제이다.

마이크로 유체 배열 기술의 응용

DNA 시퀀싱의 다른 유용한 응용 프로그램으로는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 검출, 단일 스트랜드 배향 다형성(SSCP) 헤테로듀플렉스 분석 및 짧은 탠덤 반복(STR) 분석이 있다.크기 및/또는 구성의 차이에 따라 DNA 단편을 분해하는 것은 [14]게놈의 이러한 특징을 연구하는데 있어 가장 중요한 단계이다.

디바이스 설계

시퀀싱 칩은 직경 100mm의 유리 웨이퍼 3개(디바이스 요소가 미세 조립됨)와 폴리디메틸실록산(PDMS) 막으로 구성된 4층 구조로 되어 있습니다.반응 챔버와 캐피럴리 전기영동 채널은 열적으로 접합된 상단 2개의 유리 웨이퍼 사이에 식각됩니다.PDMS 및 바닥 매니폴드 유리 웨이퍼에 의해 3차원 채널 상호접속 및 마이크로밸브가 형성됩니다.

이 장치는 각각 Sanger 시퀀스 단계에 해당하는 세 가지 기능 장치로 구성됩니다.Thermal Cycling(TC; 열사이클링) 유닛은 250나노리터 반응 챔버로 저항 온도 검출기, 마이크로밸브 및 표면 히터가 내장되어 있습니다.상부 전유리층과 하부 유리-PDMS층 사이의 시약 이동은 직경 500μm의 비어홀을 통해 이루어진다.열사이클링 후 반응혼합물은 포획/정화 챔버 내에서 정화를 거친 후 모세관 전기영동(CE) 챔버 내에 주입된다.CE 유닛은 30cm의 모세관으로 구성되어 있으며 65μm 폭의 회전을 통해 컴팩트한 스위치백 패턴으로 접혀 있습니다.

염기서열화학

서멀 사이클
TC 반응 챔버 내에서는 염료 말단 배열 시약, 템플릿 DNA 및 프라이머를 TC 챔버에 로드하여 35 사이클(12초간 95 °C, 55초간 60 °C) 동안 서멀 사이클한다.
정화
대전된 반응 혼합물(확장 조각, 템플릿 DNA 및 초과 염기서열 분석 시약 포함)은 포획 출구와 흡입구 포트 사이에 적용된 33V/cm 전계를 통해 30°C의 포획/정화 챔버를 통해 수행됩니다.샘플이 구동되는 포획 겔은 폴리아크릴아미드 매트릭스에 공유 결합되어 있는 올리고뉴클레오티드(프라이머의 상보적) 40μM으로 구성됩니다.겔 매트릭스에 의해 신장 조각이 고정화되고 여분의 프라이머, 템플릿, 유리 뉴클레오티드 및 염분이 포획 폐기물 포트를 통해 용출된다.그 포획 젤 67-75°C까지 연장 조각을 발매하기 위해 가열된다.
모세관 전기영동
확장 단편은 CE 챔버에 주입되어 125~167-V/cm의 필드를 통해 전기영동됩니다.

플랫폼

Apollo 100 플랫폼(Microchip Biotechnologies Inc., Dublin,[16] CA)은 최초 2개의 Sanger 시퀀스 처리 단계(열 사이클링 및 정화)를 완전 자동화 시스템에 통합합니다.제조업체는 샘플과 시약이 시스템에 로드된 후 3시간 이내에 모세관 전기영동을 할 준비가 되었다고 주장합니다.아폴로 100 플랫폼은 마이크로리터 미만의 시약을 필요로 한다.

다른 시퀀스 기술과의 비교

Sanger 방법 및 차세대 방법을[15][17][18] 포함한 게놈 배열 기술의 성능 값
테크놀로지 차선수 주입량(nL) 분석시간 평균 읽기 길이 스루풋(분석 포함, Mb/h) 겔 주입 차선 추적
슬래브겔 96 500–1000 6~8시간 700 bp 0.0672 네. 네.
캐피럴리 어레이 전기영동 96 1–5 1 ~ 3 시간 700 bp 0.166 아니요. 아니요.
마이크로칩 96 0.1–0.5 6~30분 430 bp 0.660 아니요. 아니요.
454/Roche FLX (2008) 0.001 미만 4시간 200~300 bp 20–30
Illumina/Solelexa (2008) 2~3일 30 ~ 100 bp 20
ABI/SOLiD (2008) 8일 35 bp 5–15
Illumina MiSeq(2019) 1 ~ 3 일 2x75~2x300 bp 170–250
Illumina NovaSeq(2019) 1~2일 2x50~2x150 bp 22,000–67,000
이온 토렌트 이온 530 (2019) 2.5~4시간 200 ~ 600 bp 110–920
BGI MISEQ-T7(2019) 하루 150 bp x 2 250,000
Pacific Biosciences SMRT(2019) 10~20시간 10 ~ 30 kb 1,300
옥스퍼드 나노포어 미니온(2019) 3일 13 ~ 20[19] kb 700

하이 스루풋 시퀀싱의 궁극적인 목표는 저비용으로 매우 효율적인 시스템을 개발하는 것입니다(더 긴(더 긴) 읽기 길이를 얻을 수 있습니다.각각의 단일 전기영동 분리의 판독 길이가 길수록 de novo DNA 배열과 관련된 비용과 주어진 용장성에서의 DNA 콘티그 배열에 필요한 템플릿의 수를 크게 줄일 수 있다.마이크로유체학으로 보다 빠르고 저렴하며 쉽게 시퀀스를 [14]조립할 수 있습니다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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추가 정보

외부 링크