단세포분석

Single-cell analysis
이 단일 세포는 분자생물학의 중심 도그마의 과정을 보여주는데, 이는 모두 연구자들이 정량화하고자 하는 단계(DNA, RNA, 단백질)이다.

세포 생물학 분야에서, 단일 세포 분석은 단일 세포 수준에서 유전체학, 대물학, 세포-세포 상호작용에 대한 학문이다.[1][2][3]진핵 세포 집단과 원핵 세포 집단 모두에서 보이는 이질성 때문에, 단일 세포의 분석은 많은 세포 집단을 연구할 때 보이지 않는 메커니즘을 발견하는 것을 가능하게 한다.[4]반면 높은 처리량 단세포 technologies,[5][6][7]수백 혹은 하나의 정리되지 않은 세포 수천개의 동시적인 분자 분석을 가능하게 분할 형광 활성화 세포 분류(FACSFacialActionCodingSystem)과 같은 기술, 이 특히의 분석을 위해 유용하다 복잡한 샘플에서 선택한 단일 세포의 정확한 격리할 수 있다.transcr유전자형적으로 동일한 세포의 integrome 변화, 그렇지 않으면 검출할 수 없는 세포 아형의 정의를 가능하게 한다.신기술의 개발은 우리의 단일 세포의 게놈과 성적 증명서를 분석하는 [8]능력뿐만 아니라 그들의 단백질과 대사물을 정량화하는 능력을 증가시키고 있다.[9][10][11]질량분석 기법은 단일 세포의 단백질 및 대사물 분석을 위한 중요한 분석 도구가 되었다.[12][13]최근의 발전으로 수백 개의 단일 세포에 걸쳐 수천 개의 단백질을 계량화할 수 있게 되었고,[14] 따라서 새로운 유형의 분석을 가능하게 했다.[15][16]상황 순서와 상황 혼합(FISH)에서의 형광 투과에서는 세포가 분리될 필요가 없으며 조직의 분석에 점점 더 많이 사용되고 있다.[17]

단세포격리

많은 단세포 분석 기법은 개별 세포의 분리를 필요로 한다.현재 단일 셀 격리에 사용되는 방법은 다음과 같다.유전체성 디지털 정렬, 효소 소화, FCS, 유체역학 트랩, 레이저 캡쳐 미세분해, 수동 픽업, 미세유체학, 미세조화, 직렬 희석, 라만 핀셋.

수동 단일 셀 선택이란 현수막 안의 셀을 현미경으로 보고 마이크로피펫을 이용해 개별적으로 선택하는 방식이다.[18][19]라만 핀셋은 라만 분광기가 광학 핀셋과 결합해 레이저 빔을 이용해 함정에 빠뜨리고 세포를 조작하는 기술이다.[20]

유전체 소자 디지털 정렬 방식은 마이크로유체 칩에 있는 반도체 제어 전극 배열을 이용해 유전체 소자(DEP) 우리에 단일 셀을 가둔다.셀 식별은 형광 표시기와 영상 관찰의 결합에 의해 보장된다.정밀 전달은 플로우 셀에 있는 DEP 케이지의 반도체 제어 모션에 의해 보장된다.

유체역학 기반의 마이크로유체 바이오칩의 개발은 해를 거듭할수록 증가하고 있다.이 기법에서는 일반적으로 단일 세포 분석(SCA)을 위해 특정 부위에 세포나 입자가 끼여 광학, 전기, 자석 또는 음향과 같은 외부 힘장을 전혀 가하지 않는다.세포의 자연상태에서 SCA의 통찰력을 탐구할 필요가 있으며 이러한 기법의 개발은 그 연구에 매우 필수적이다.연구자들은 시장/재조사 수요에 맞는 바이오칩 장치를 개발하기 위해 탐구되어야 할 방대한 잠재 분야를 강조해왔다.유체역학 마이크로유체학은 패시브 랩온칩 어플리케이션의 개발을 촉진한다.최근의 검토는 그들의 메커니즘, 방법 및 응용 프로그램과 함께 이 분야의 최근 진보에 대한 설명을 제공한다.[21]

관련 기술

유전체 소자 디지털 정렬 방식은 미세유체 칩에 반도체 제어 전극 배열을 활용해 유전체 소자(DEP) 우리에 단일 셀을 가둬놓는다.셀 식별은 형광 표시기와 영상 관찰의 결합에 의해 보장된다.정밀 전달은 플로우 셀에 있는 DEP 케이지의 반도체 제어 모션에 의해 보장된다.

유체역학 트랩은 수동적 미세유체 이송에 의해 주어진 한 시간에 "트랩"으로 개별 셀을 격리할 수 있다.격리된 셀의 수는 시스템의 트랩 수를 기준으로 조작할 수 있다.

레이저 캡쳐 미세분해 기술은 레이저를 이용하여 관심 조직 샘플에서 개별 세포 또는 단면을 해부하고 분리한다.그 방법에는 현미경으로 셀을 관찰하는 것이 포함되어 있어 분석을 위한 단면을 식별하고 라벨을 붙여 레이저가 셀을 절단할 수 있도록 한다.그리고 나서, 그 세포는 분석을 위해 추출될 수 있다.

수동 단일 셀 선택이란 현수막 안의 셀을 현미경으로 보고 마이크로피펫을 이용해 개별적으로 선택하는 방식이다.

미세유체학에서는 추가 분석을 위해 개별 세포를 분리할 수 있다.다음 원리는 단일 셀 분리를 위한 다양한 미세유체 공정을 개략적으로 설명한다. 단세포 분리를 위한 드롭-인-오일 기반 격리, 공압 막 바빙 및 유체역학 셀 트랩.기름 방울 기반 미세유체 물질은 기름으로 채워진 채널을 사용하여 분리된 수용성 물방울을 고정시킨다.이를 통해 단일 셀을 내장하고 오일 기반 채널 내부에서 분리할 수 있다.공압막밸브는 기압의 조작을 이용하여 막의 편향에 의해 개별 세포를 격리시킨다.압력원의 조작은 미세유체망에서 채널의 개폐를 허용한다.일반적으로 시스템은 운영자를 필요로 하며 처리량이 제한된다.

라만 핀셋 기술은 레이저 빔을 이용해 세포를 가두고 조작하는 라만 분광법과 광학 핀셋을 결합한 기술이다.

유체역학 기반의 마이크로유체 바이오칩의 개발은 해를 거듭할수록 증가하고 있다.이 기법에서, 세포들은 단일 세포 분석 (SCA)을 위해 특정한 지역에 갇히게 된다.이것은 광학, 전기, 자석 또는 음향과 같은 외부 힘 장 없이 발생한다.세포의 자연상태에서 SCA의 통찰력을 탐구할 필요가 있으며 이러한 기법의 개발은 그 연구에 매우 필수적이다.연구자들은 시장과 연구자의 요구에 맞는 바이오칩 장치 개발의 필요성을 강조해왔다.유체역학적 마이크로유체학은 패시브 랩온칩 어플리케이션의 개발을 촉진한다.

게노믹스

기술

단세포 유전체학은 세포에서 발견된 DNA의 복사본을 증가시키는 것에 크게 의존하고 있기 때문에 염기서열화하기에 충분하다.이는 전체 게놈증폭(WGA) 전략 개발로 이어졌다.현재 WGA 전략은 세 가지 범주로 분류할 수 있다.

  • 프라이밍 및 PCR 증폭 제어:어댑터-링커 PCR WGA
  • 무작위 프라이밍 및 PCR 증폭: DOP-PCR, MALBAC
  • 무작위 프라이밍 및 등온 증폭: MDA

어댑터 링커 PCR WGA는 매우 낮은 알레릭 드롭아웃 효과 덕분에 디플로이드 단일 세포 돌연변이 분석과 [22][23][24]ACGH 및 NGS 로우패스 시퀀싱으로 인한 낮은 소음으로 인한 복사 번호 변동 프로파일링에 가장 적합한 것으로 많은 비교 연구에서 보고되었다.[25][26]이 방법은 고정된 세포와 결합되지 않은 세포에만 적용된다.

널리 채택된 WGA 기법 중 하나는 퇴행성 올리고뉴클레오티드-프리미드 중합효소 연쇄반응(DOP-PCR)이라고 불린다.이 방법은 잘 확립된 DNA 증폭법 PCR을 사용하여 대규모 프라이머 세트를 사용하여 전체 게놈을 증폭시키고 시도한다.간단하지만, 이 방법은 게놈 커버리지가 매우 낮은 것으로 밝혀졌다.DOP-PCR의 개선은 DOP-PCR보다 큰 파편의 증폭과 게놈 커버리지가 높은 고밀도 효소인 φ29 DNA 중합효소를 사용하는 다중변위 증폭(MDA)이다.이러한 개선에도 불구하고 MDA는 여전히 염기서열 의존적 편향(확실한 유전자 부분은 염기서열 때문에 다른 부분보다 증폭된다)을 가지고 있다.DOP-PCR과 MDA에서 나타나는 편향성을 대부분 피하는 것으로 나타난 방법은 MALBAC(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)이다.이 시스템의 편향성은 복제본을 만드는 대신 원본 DNA 가닥만 복제함으로써 감소한다.MALBA 사용에 대한 주된 단점은 DNA 복사에 사용되는 효소로 인해 DOP-PCR과 MDA에 비해 정확도가 떨어졌다는 것이다.[9]위의 기법 중 하나를 사용하여 증폭된 후에는 생거 또는 차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하여 DNA 서열을 분석할 수 있다.

목적

단일 세포 수준에서 게놈을 연구하는 데는 크게 두 가지 응용이 있다.한 가지 응용은 표현적 차이가 자주 나타나는 박테리아 개체군에서 일어나는 변화를 추적하는 것이다.이러한 차이는 모집단의 대량 시퀀싱에 의해 누락되지만 단일 셀 시퀀싱에서 관찰할 수 있다.[27]두 번째 주요한 적용은 암의 유전적 진화를 연구하는 것이다.암세포가 끊임없이 변이되기 때문에 암이 유전적 수준에서 어떻게 진화하는지 보는 것이 큰 관심사다.이러한 체적 돌연변이와 복사 번호 일탈 패턴은 단일 세포 염기서열 분석을 통해 관찰할 수 있다.[1]

성적 증명서

기술

단세포 transcriptomics는 단일 세포 유전체학과 유사한 염기서열 기법이나 상황 잡종에서 형광을 이용한 직접 검출 기법을 사용한다.transcriptome을 정량화하는 첫 번째 단계는 역 transcriptase를 사용하여 RNA를 cDNA로 변환하여 유전체학에서 그랬던 것처럼 NGS 방법을 사용하여 세포의 내용을 시퀀싱할 수 있도록 하는 것이다.일단 변환되면 시퀀싱할 cDNA가 충분하지 않기 때문에 단일 세포 유전체학에서 논의된 동일한 DNA 증폭 기법이 cDNA에 적용되어 시퀀싱이 가능해진다.[1]또는 RNA 하이브리드화 프로브에 부착된 형광 화합물을 사용하여 특정 시퀀스를 식별하고 서로 다른 RNA 프로브의 순차적 적용으로 종합적 트랜스포머가 구축된다.[28][29]

목적

단일 세포 transcriptomics의 목적은 각 세포에서 어떤 유전자가 표현되고 있는지를 결정하는 것이다.transcriptom은 현재 단백질 수치를 증폭시키는 것과 관련된 어려움 때문에 proteome 대신 유전자 발현을 정량화하는 데 종종 사용된다.[1]

이 기술을 사용하여 유전자 발현이 연구된 세 가지 주요 이유는 유전자 역학, RNA 스플라이싱, 세포 타이핑이다.유전자 역학은 보통 유전자 발현에 어떤 변화가 다른 세포 특성에 영향을 미치는지 결정하기 위해 연구된다.예를 들어, 이러한 유형의 성적 증명 분석은 종종 배아 발달을 연구하는데 사용되어 왔다.RNA 스플리싱 연구는 서로 다른 대본 등소형식의 규정 이해에 초점을 맞추고 있다.세포의 유형을 식별하기 위해 세포에 표현된 유전자를 사용하는 세포 타이핑에도 단일 세포 기록체학이 사용되어 왔다.세포 타이핑의 주요 목표는 유전자 표지를 알지 못하는 세포의 정체를 알아내는 방법을 찾는 것이다.[1]

프로테오믹스

기술

단세포 단백질학에는 항체 기반 방법, 형광 단백질 기반 방법, 질량 스펙트럼 분석 기반 방법 등 크게 3가지 접근법이 있다.[30][16]

항체 기반 방법

항체 기반 방법은 설계 항체를 사용하여 관심 있는 단백질에 결합하여 여러 개의 개별 목표물의 상대적 풍부함을 여러 가지 다른 기법 중 하나로 식별할 수 있다.

이미징:항체는 양자점 같은 형광 분자에 묶이거나 형광 현미경 검사에 의해 검출하기 위해 유기 형광체로 태그될 수 있다.각 항체에는 서로 다른 색상의 양자점이나 독특한 불소성분이 부착되기 때문에 하나의 세포에서 여러 개의 다른 단백질을 식별할 수 있다.퀀텀닷은 시료를 손상시키지 않고 항체에서 씻어낼 수 있어 같은 시료에서 이 방법을 이용해 단백질 정량화를 여러 차례 할 수 있다.[31]유기 형광물질을 기반으로 하는 방법의 경우, 형광 태그를 DNA-하이브리드(저염 조건에서 용해/분해할 [32]수 있는)와 같은 가역적 연계에 의해 부착하거나 화학적으로 비활성화하여 복수의 분석 주기가 가능하며,[33] 주기당 3-5개의 표적을 정량화한다.이러한 접근방식은 조직 및/또는 종양의 가변 단백질 표현을 지도화하고 [33]암 치료에 대한 단백질 표현 및 세포 신호의 변화를 측정하기 위해 환자 생검 검체(예: 암)의 단백질 풍부도를 정량화하는 데 사용되어 왔다.[32]

질량 시토메트리: 세포나 조직에서 일반적으로 발견되지 않는 희귀 금속 동위원소는 개별 항체에 부착될 수 있으며 단백질에 대한 동시적이고 민감한 식별을 위한 질량 분광법으로 검출될 수 있다.[34]이러한 기법은 단일 셀에서 많은 대상(최대 38개의 마커의 패널)을 동시에 계량하기 위해 고도로 다중화할 수 있다.[35]

항체-DNA 정량화: 또 다른 항체 기반 방법은 단백질 수준을 DNA 수준으로 변환한다.[30]DNA로의 변환은 단백질 수치를 증폭시키는 것을 가능하게 하고 단백질을 정량화하기 위해 NGS를 사용한다.그러한 하나의 접근법에서는 정량화에 필요한 각 단백질에 대해 두 개의 항체를 선택한다.그런 다음 두 항체는 서로 보완되는 단 하나의 좌초된 DNA를 연결하도록 수정된다.두 항체가 단백질에 결합할 때 보완 가닥이 벗겨지고 PCR을 사용하여 증폭될 수 있는 DNA의 이중 좌초된 부분을 생성한다.각 한 쌍의 단백질용으로 설계된 항체는 다른 DNA 염기서열로 태그가 붙는다.그런 다음 PCR에서 증폭된 DNA를 염기서열화하고 단백질 수치를 정량화할 수 있다.[36]

질량 분광기 기반 방법

질량 분광기 기반 단백질학에서는 펩타이드 식별에 3가지 주요 단계가 필요하다: 샘플 준비, 펩타이드 분리, 펩타이드 식별.몇몇 그룹은 난모세포나 매우 초기 분열 단계 세포에 초점을 맞췄다. 이 세포들은 비정상적으로 크고 분석에 충분한 물질을 제공하기 때문이다.[37][38][39]또 다른 접근법, 질량분석에 의한 단일 세포 프로테오믹스(SCoPE-MS)는 캐리어-셀과 단세포 바코딩을 결합하여 전형적인 세포 크기(지름 10-15μm)의 포유류 세포 수천 개의 단백질을 정량화했다.[40][41][42][43]2세대 SCoPE-MS,[44][45][46] SCoPE2는 자동화되고 소형화된 샘플 준비로 처리량을 증가시켰는데,[43] 그러한 접근방식 중 하나는 수신 사이트와 주변 지역 간의 습윤성의 차이를 이용하여 고속에서 고열을 달성하는 MAMS(Micro-Array for Mass Spectrometry)이다.[47]또한 LC-MS/MS와[48] 펩타이드 식별의 데이터 중심 최적화를 통해 정량적 신뢰성과 단백질 커버리지도 개선했다.[49]분석을 위해 펩타이드 분리를 위한 여러 가지 방법이 존재한다.여기에는 필터 보조 검체 준비, 자석 비드의 사용 또는 일련의 시약 및 원심분리 단계를 사용하는 것이 포함된다.[50][37][39]크기가 다른 단백질의 분리는 모세관 전기영양증(CE)이나 액상 크로마토그래피(LC)를 사용하여 수행할 수 있다(액체 크로마토그래피와 질량 분광법을 함께 사용하는 것을 LC-MS라고도 한다).[37][38][39][40]이 단계는 탠덤 질량 스펙트럼 분석기(MS/MS)를 사용하여 정량화하기 전에 펩타이드에 명령을 내린다.정량화 방법의 주요 차이점은 탠덤 질량 태그(TMT)나 디메틸 라벨과 같은 펩타이드의 라벨을 사용하는데, 이 라벨은 특정 단백질이 어느 세포에서 왔는지 식별하는 데 사용된다(각 세포에서 나오는 단백질은 서로 다른 라벨을 가지고 있다)는 것과 라벨을 사용하지 않는 것(셀을 개별적으로 정량화)이다.그런 다음 질량 분광기 데이터는 확인된 펩타이드에 대한 정보를 단백질 수준의 정량화로 변환하는 데이터베이스를 통해 데이터를 실행하여 분석한다.[37][38][39][40][51]이러한 방법은 매우 작은 샘플 용적을 수용하도록 수정하여 벌크 셀의 프로테오메를 정량화하는 데 사용되는 방법과 매우 유사하다.[41]

목적

프로테오메를 연구하는 목적은 단일 세포 수준에서 세포의 활동을 더 잘 이해하기 위함이다.단백질은 세포가 어떻게 작용하는지를 결정하는 역할을 하기 때문에, 단일 세포의 단백질에 대한 이해는 세포가 어떻게 작용하는지, 그리고 다른 환경 자극으로 인해 세포에서 유전자 발현이 어떻게 변화하는지를 가장 잘 이해하게 한다.비록 transcriptomics가 단백체학과 같은 목적을 가지고 있지만, 세포에서 유전자 발현을 결정하는 것은 그것이 전환 후의 규제를 고려하지 않는 것만큼 정확하지 않다.[10]RNA 수치와 단백질 수치의 차이를 연구하는 것이 어떤 유전자가 전치 후 조절되는지에 대한 통찰력을 줄 수 있기 때문에 transcriptomics는 여전히 중요하다.

대사학

기술

단일 세포의 대사물을 정량화하는 데 사용되는 주요 방법은 형광 기반 검출, 형광 바이오센서, FET 바이오센서, 질량 분광법 등 4가지다.열거된 처음 세 가지 방법은 형광 현미경을 사용하여 세포의 분자를 검출한다.일반적으로 이러한 분석은 관심 있는 분자에 부착된 작은 형광 태그를 사용하지만 이는 단일 세포 대사물에 대해 지나치게 침습적이며 대사물의 활동을 변화시키는 것으로 나타났다.이 문제에 대한 현재 해결책은 대사물 탐지기의 역할을 할 형광 단백질을 사용하는 것이다. 그들이 관심 있는 대사물과 결합할 때 형광 검사를 하는 것이다.[52]

질량 분광학은 단일 세포 대사학에서 가장 자주 사용되는 방법이 되고 있다.관심 있는 모든 분자에 대해 형광 단백질을 개발할 필요가 없고, 펨토몰 범위에서 대사물을 검출할 수 있는 것이 장점이다.[13]프로테오믹스에서 논의된 방법과 유사하게 대사물을 정량화하기 위해 모세관 전기영양과 같은 분리 기법과 질량 분광법을 결합하는 데도 성공했다.이 방법은 또한 펨토몰 농도로 존재하는 대사물을 검출할 수 있다.[52]모세관 마이크로 샘플링을 이온 이동성 분리가 있는 질량 분광 분석과 결합하여 활용하는 또 다른 방법은 단일 세포 대사체학에서 분자 범위와 이온 분리를 강화하는 방법이 입증되었다.[19][53]연구자들은 현재 기술 중 부족한 것을 충족시킬 수 있는 기술을 개발하려고 노력하고 있다: 높은 처리량, 낮은 이온화 효율성과 우수한 복제성을 가지고 있고 대사물의 정량화를 가능하게 하는 대사물에 대한 높은 민감도, 높은 처리량, 높은 민감도를 가지고 있다.[54]

목적

단일 세포 대사학의 목적은 암, 줄기세포, 노화, 그리고 약물 내성의 발달과 같은 주요 생물학적 주제의 분자 수준에서 더 나은 이해를 얻는 것이다.일반적으로 대사학의 초점은 세포가 분자 수준에서 환경적 스트레스를 처리하는 방법을 이해하고 세포 기능에 대한 보다 역동적인 이해를 제공하는 데 있다.[52]

개발 궤적 재구성

단일 세포 기록 분석은 재건 개발 궤적을 허용했다.이 궤도의 분기점은 세포 분화를 설명한다.단일 세포 대본 데이터에서 발달 궤도를 분기시키는 다양한 방법이 개발되었다.[55][56][57][58]그들은 최적의 교통수단에서부터[57] 주요 그래프에 이르기까지 다양한 고급 수학 개념을 사용한다.[58]계통 분화 궤적을 재구성하고 시각화하기 위한 일부 소프트웨어 라이브러리는 온라인에서 자유롭게 이용할 수 있다.[59]

세포-세포 상호작용

세포-세포 상호작용은 안정적이고 일시적인 상호작용에 의해 특징지어진다.

참고 항목

참조

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