GCaMP

GCaMP는 2001년 나카이 ^[1]준이치에 의해 개발된 유전자 부호화 칼슘 지표(GECI)입니다.녹색 형광 단백질(GFP), 칼모듈린(CaM) 및 미오신 경쇄 키나제로부터의 ^[2]펩타이드 배열인 M13의 합성 융합입니다.Ca에 결합하면 GCaMP는²⁺ 녹색 형광을 발하며, 피크 들뜸 파장은 480 nm, 피크 방출 파장은 510 ^[3]nm이다.이는 생체 연구에서 바이러스 감염 또는 트랜스제닉 세포 ^[2][4]및 동물주를 사용하여 체외 및 체내 Ca²⁺ 수치를 측정하기 위해 사용된다.그 유전자 배열 GCaMP을 인코딩하는 프로모터들은 특정한 종류의 세포에 대한 독점 판매의 통제를 받는 많은 세포 메커니즘 및 신호 경로에 기부한 김치가 소금은 제2전령 GCaMP.[5]의 갈바니 전지식 특정 표현을 허용하면서 삽입할 수 있GCaMP 연구원들Ca2+-based 메커니즘 a의 활동을 정량화할 수 있알몬드 study 관심 있는 생물학적 과정에서 Ca 이온의 역할을²⁺ 한다.

구조.

GCaMP는 N 터미널의 M13 도메인, C 터미널의 Calmodulin(CaM) 도메인 및 중앙의 GFP 도메인의 3가지 주요 도메인으로 구성됩니다.GFP 도메인은 원어민 N-termini와 C-termini가 6-amino-acid 연결 배열에 의해 융합되고 GFP 시퀀스가 중간에 분할되어 M13 및 CaM 도메인에 접속되는 새로운 ^[6]N-termini와 C-termini가 생성되도록 순환 배열된다.

Ca가 없을²⁺ 때 GFP 발색단은 물에 노출되어 형광강도가 최소인 양성자화된 상태로 존재한다.Ca 결합 시²⁺, CaM 도메인은 구조 변화를 겪고 M13 도메인 알파 나선에 단단히 결합되어 물 분자가 색소단에 접근하는 것을 방지한다.그 결과, 발색단은 빠르게 음이온 형태로 탈양성자화되며, 자연산 ^[7]GFP와 유사하게 밝게 형광을 내는 음이온 형태로 변환된다.

역사와 발전

2001년 Nakai 등은 기존에 개발된 형광 Ca ^[1]프로브에²⁺ 비해 신호 대 잡음비가 개선된 Ca²⁺ 프로브로서 GCaMP1의 개발을 보고했다.GCaMP1을 발현하는 최초의 유전자 변환 마우스는 ^[5]2004년에 보고되었습니다.그러나 37ºC(포유동물의 생리온도)에서는 GCaMP1이 안정적으로 접히거나 형광이 발생하지 않아 ^[1][8]생체내 칼슘지표제로서의 사용이 제한되었다.

2006년 Tallini 등은 GCaMP1이 GCaMP1보다 밝은 형광과 포유류의 체온에서 더 높은 안정성을 보이는 GCaMP2로 개선되었음을 보고했다.탈리니 외 연구진은 ^[8]포유동물 최초로 Ca의 생체²⁺ 내 GCaMP 영상을 수행하기 위해 마우스 배아의 심근세포에서 GCaMP2를 발현시켰다.

GCaMP3, GCaMP5, GCaMP6, jGcaMP7 등 GCaMP의 추가 변경은 Ca ^{[2][9][10][11]}검출의 신호²⁺, 감도 및 동적 범위를 점진적으로 개선하기 위해 개발되었으며, 최근 버전은 네이티브 ^[11]GFP와 유사한 형광을 보인다.

사용 중인 변종

느린 변종(GCaMP6s, jGcaMP7s)과 빠른 변종(GCaMP6f, jGcaMP7f)은 모두 생물학적 및 신경과학 연구에 사용된다.느린 변형은 더 밝고 단일 활동 전위 등 Ca 수준의 작은²⁺ 변화에 더 민감합니다. 반면 빠른 변형은 덜 민감하지만 더 빠르게 반응하기 때문에 정확한 ^[12][13]타임스케일에 걸쳐 Ca 수준의 변화를²⁺ 추적하는 데 유용합니다.GCaMP6에는 GCaMP6s와 GCaMP6f의 ^[12]중간 키네틱스인 미디어 바리안트 GCaMP6m도 있습니다.jGcaMP7의 다른 변종들도 사용된다: jGcaMP7b는 밝은 베이스라인 형광을 나타내며 수상돌기와 축삭을 촬영하는 데 사용되는 반면, jGca는MP7c는 최대 형광과 기준 형광 사이에 더 큰 대조를 보이며 많은 뉴런 ^[12]집단을 촬영하는 데 유리하다.

2018년 Yang 등은 Calmodulin-binding 모티브를 첨가하여 생성된 GCaMP-X의 개발을 보고했다.GCaMP 칼모듈린 도메인은 결합하지 않으면 L형 칼슘 채널 게이트를 방해하므로 추가된 칼모듈린 결합 모티브는 GCaMP-X가 칼슘의존성 시그널링 메커니즘에 ^[14]간섭하는 것을 방지한다.

2020년, 장 외 연구진은 민감, 중간, 빠른 변형을 포함한 jGcaMP8의 개발을 보고했다. 이 변종은 대응하는 jGcaMP7 ^[15]변종보다 빠른 속도론과 높은 민감도를 나타낸다.

적색 형광 인디케이터도 개발되었다.jRCaMP1a 및 jRCaMP1b는 GFP 대신 적색 형광 단백질 mRuby의 원형 순열을 사용하며, jRGECO1a는 적색 형광 단백질 ^[12][16]mApple에 기초한다.GCaMP를 들뜨게 하기 위해 사용되는 청색광은 조직에 의해 산란되고 방출된 녹색광은 혈액에 의해 흡수되기 때문에 적색 형광 표시기는 GCaMP보다 생체 내 투과 및 촬영 깊이를 높인다.또한 적색 형광 표시기를 사용하면 청색 들뜨게 ^[16]되는 광손상을 피할 수 있다.또한 적색 형광 인디케이터는 광유전학을 동시에 사용할 수 있으며, 이는 GCaMP의 들뜸 파장이 채널로돕신-2(ChR2)^[16][17]의 들뜸 파장과 겹치기 때문에 GCaMP에서는 어렵다.빨간색과 녹색 GECI를 동시에 사용하면 서로 다른 아세포 영역 또는 세포 ^[16][17][18]집단을 2색 시각화할 수 있습니다.

연구 중인 응용 프로그램

신경 활성

뉴런에서 활동 전위는 전압 게이트²⁺ Ca 채널을 열어 축삭 말단에서 신경 전달 물질 방출을 유도하여 Ca 유입을²⁺ 허용한다.결과적으로, GCaMP는 Caenorhabditis Elegans, Zebrafish, Drosophila, 그리고 ^[19]쥐를 포함한 여러 동물 모델에서 신경 활동의 대용물로 뉴런 세포 내 Ca의²⁺ 증가를 측정하는데 일반적으로 사용됩니다.최근에는 GECI와 함께 유전적으로 부호화된 전압 표시기(GEVI)가 개발되어 이러한 ^[20]동물 모델에서 세포 수준에서 신경 활동을 보다 직접적으로 조사한다.

GCaMP는 신경 네트워크의 활동 패턴이 행동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기 위해 동물에서 대규모 신경 기록을 확립하는 데 중요한 역할을 했다.예를 들어, Nguyen et al. (2016)는 C. ^[21]elegans의 자유로운 이동 중 전뇌 영상에 GCaMP를 사용하여 특정 운동 거동과 관련된 활동을 하는 뉴런과 뉴런 그룹을 식별했다.

무토 등(2003)는 펜티렌테트라졸에 ^[22]의해 유발되는 발작의 시작, 전파 및 회복 중에 척추 운동 뉴런의 조정된 활동을 측정하고 뇌의 다른 부분에 매핑하기 위해 제브라피시 배아에서 GCaMP를 발현시켰다.제브라피쉬의 뇌에서 GCaMP 발현은 또한 먹이 포획, 충동 제어, ^[23][24]주의와 같은 인지 과정에서 신경 회로의 활성화를 연구하는 데 사용되었습니다.

또한, 연구원들은 흥분성 피라미드 ^[25]뉴런에서 발견되는 Ty1 프로모터의 통제 하에 발현시킴으로써 생쥐의 신경 활동을 관찰하기 위해 GCaMP를 사용했다.예를 들어, 운동 학습 중 회로에 뉴런의 통합은 GCaMP를 사용하여 Ca ^[26][27][28]수준의 동기화된²⁺ 변동 패턴을 관찰함으로써 추적되었다.GCaMP는 또한 마우스 뉴런의 세포 하위 구획에서 Ca 역학을 관찰하는²⁺ 데 사용되었다.Cichon과 Gan(2015)은 마우스 운동 피질의 뉴런이 각 수상돌기 척추에 대해 독립적인 NMDA 주도 Ca 증가를²⁺ 나타내며, 따라서 개별 수상돌기가 시냅스 가소성을 ^[29]조절한다는 것을 보여주기 위해 GCaMP를 사용했다.마지막으로, GCaMP는 마우스 뇌의 특정 영역에서 활동 패턴을 식별하기 위해 사용되었습니다.예를 들어, 존스 외 연구진(2018)은 포유류의 일주기 심박조절기인 상완골핵(SCN)의 신경 활동을 측정하기 위해 생쥐에서 GCaMP6를 사용했으며, 혈관 활성 장내 펩타이드(VIP)를 생성한 SCN 뉴런이 VIP ^[30]방출과 관련된 생체 내 일일 활동 리듬을 보였다.

GCaMP는 또한 자유롭게 움직이는 ^[31]동물의 뉴런 하위 집단 내 모집단²⁺ 수준의 Ca 변화를 측정하기 위해 섬유 광도 측정과 결합되었다.예를 들어 Clarkson et al. (2017)는 시상하부의 활 모양의 핵에 있는 뉴런이 황체화 호르몬(^[32]LH)의 펄스 직전에 Ca의 증가와²⁺ 동기화한다는 것을 보여주기 위해 이 방법을 사용했다.섬유 측광에 의한 GCaMP 이미징은 개별 뉴런 내의 Ca 수준의 변화를²⁺ 추적할 수 없지만, 대규모 ^[33]변화에 대해서는 더 큰 시간 분해능을 제공한다.

심장 전도

심근세포²⁺ 간극 접합을 통한 Ca 전류는 심장 조직의 동기화된 수축을 매개합니다.그 결과, 시험관내 및 생체내 양쪽의 심근세포에서 GCaMP 발현을 사용하여 제브라피쉬와 ^[34]생쥐의 Ca-인플루엔자²⁺ 의존 흥분 및 수축을 연구하였다.예를 들어 탈리니 등.(2006)는 배아 10.5일에 심방과 심실에서는 전기 전도가 빠르지만 방실관에서는 ^[8]느리다는 것을 보여주기 위해 마우스 배아에서 GCaMP2를 발현시켰다.Chi 등(2008)는 심전도에 영향을 미치는 4가지 발달 단계를 특징짓고 심장 ^[35]전도에 영향을 미치는 17개의 새로운 돌연변이를 식별하기 위해 심전도에 영향을 미치는 GCaMP 제브라피쉬 라인을 사용하여 심장 주기 전체에 걸쳐 심근세포 활성화를 촬영했다.단, GCaMP의 제어되지 않은 발현은 칼모듈린 모티브의 과발현으로 심장비대로 이어져 세포내 칼슘 시그널링을 방해한다.따라서 심장 조직을 사용한 실험은 GCaMP ^[8]발현 수준을 신중하게 제어해야 합니다.

시그널링 경로 활성화

Ca는 일반적인 세컨드메신저이기 때문에²⁺ 시그널링 패스의 활성화를 감시하기 위해 GCaMP가 사용되고 있습니다.예를 들어, 본더와 맥카시(2014)는 GCaMP를 사용하여 성세포 G단백질 결합 수용체(GPCR) 신호와²⁺ 후속 Ca 방출이 신경혈관 결합에 관여하지 않는다는 것을 보여주었다. 이는 신경활동의 변화가 국소 혈류 ^[36]변화로 이어지는 과정이다.마찬가지로, Greer와 Bear et al. (2016)는 GCaMP를 사용하여 목걸이 후각 뉴런 시그널링에서 Ca 유입의²⁺ 역학을 특성화하였다. 목걸이 후각 뉴런 시그널링은 화학수용체로 ^[37]막 통과 MS4A 단백질을 사용한다.

「 」를 참조해 주세요.

• 칼슘 이미징
• 생물학의 칼슘
• 칼모듈린
• 카멜레온(단백질)
• 녹색 형광 단백질
• 미오신경쇄인산화효소

레퍼런스