자동 패치 클램프

Automated patch clamp

자동 패치 클램핑은 개별 셀의 전기적 활동을 측정하는 방법으로 수동 패치 클램핑을 대체하기 시작하고[1] 있다.세포 배양 및 생체내 세포로부터 패치 클램프 녹화를 자동화하기 위해 다양한 기법이 사용된다.이 작업은 1990년대 후반부터 연구소와 기업들이 수동으로 패치 클램핑의 복잡성과 비용을 줄이려고 노력하면서 진행되어 왔다.패치 클램핑은 오랫동안 예술적인 형태로 여겨졌으며 여전히 시간이 많이 걸리고 특히 생체내에서는 지루하다.자동화 기법은 사용자 오류와 단일 셀에서 양질의 전기생리학 기록을 얻는데 있어서의 가변성을 줄이려고 노력한다.null

수동 패치 클램프

주요기사 : 패치클램프
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기가세일링 프로세스를 보여주는 애니메이션.피펫이 세포에 접근하고 피펫에서 흘러나오는 액체가 세포 표면에 작은 보조개를 만든다.저항이 충분히 증가하면 피펫에 소량의 흡착이 가해져 세포막을 피펫 팁과 접촉하게 된다.이는 패치 클램프 레코딩의 기가옴 씰 특성을 생성한다.

유리 피펫을 이용해 클램프를 패치하는 전통적인 수동 방식은 에르윈 네헤르와 베르트 사크만이 개발했으며 고도의 기술을 갖춘 기술자가 필요했다.기술자는 유리 피펫을 셀 근처에 배치하고 적절한 흡입기를 사용하여 피펫과 셀 멤브레인 사이에 전기 씰을 만든다.이 밀봉은 피펫 끝과 세포막 사이에 전류가 새어나가지 않도록 함으로써 품질 기록을 보장한다.이 밀봉은 피펫의 안쪽이 세포질에만 연결되도록 세포의 막이 피펫의 끝과 화학적으로 결합될 때 만들어진다.이 막-유리 연결 또는 봉인을 "기가살"이라고 한다.[2]null

기술자는 전통적으로 입을 이용해 셀에 밀봉하는 데 필요한 정확한 압력을 제공했다.또한 기술자는 압력을 제어하는 것 외에도 피펫을 세포로부터 정확한 거리에 위치시켜 막이 세포와 밀봉되도록 해야 한다.정비사가 피펫 내부의 유체와 주변 유체 사이의 전기 저항의 변화를 볼 때까지(애니메이션 참조) 피펫을 셀 쪽으로 이동시킨다.이것은 일반적으로 정비사가 셀로부터 신뢰할 수 있는 기록을 하기 전에 3-12개월의 훈련을 필요로 한다.정비사는 기본적으로 여러 시스템을 동시에 감시하고 조작하려고 하는 균형 조정 작업을 수행하고 있다(동작, 압력 및 전기 신호).공정의 각 부분을 정확한 타이밍과 함께 정확하게 수행하지 않는 한, 씰이 제대로 형성되지 않고 기술자는 피펫을 교체하고 다시 시작해야 한다.null

이러한 도전은 기술자가 획득할 수 있는 녹화 수를 줄이고 비용을 크게 증가시킨다.자동화는 수동 패치 클램핑의 시간, 복잡성 및 비용 절감을 추구한다.처리량 향상은 또한 전기생리학, 형태학 및 뉴런의 대소문자 특성을 다른 시퀀싱 방법과[3] 비교할 수 있는 규모로 동시에 결합하기 위한 높은 처리량 패치-seq를 가능하게 하는 데 핵심이 될 것이다.

자동화 시스템

자동화 기법은 세포의 주변 환경에 따라 다르다.체내 세포의 경우, 이것은 전형적으로 세포가 뇌 안에 있고 다른 세포에 둘러싸여 있다는 것을 의미한다.이 환경은 또한 1-2μm 직경의 피펫 끝을 막음으로써 기가살 형성을 어렵게 하는 혈관, 덴드라이트, 액손, 활엽 세포도 포함하고 있다.여기서 피펫 팁의 압력과 위치의 정확한 제어는 위에서 논의한 바와 같이 막힘을 방지하고, 셀이 피펫 끝 가까이에 있는지 여부를 감지하는 데 큰 역할을 한다.null

체외 세포는 액체로 매달려 있거나 배양 접시에 달라붙도록 만들어지거나 동물에게서 제거된 조직의 일부분으로 남을 수 있다.이러한 환경은 일반적으로 동물의 심장박동이나 호흡으로 인한 조직의 움직임을 보상할 필요가 없다.보류 중인 셀의 경우, 피펫을 기체 생성 및 전기적 활성도 측정이 가능한 구멍이 있는 마이크로칩으로 완전히 교체한다.배양 접시의 세포나 조직에도 막힘은 덜 문제가 된다. 왜냐하면 세포와 피펫은 현미경을 통해 볼 수 있기 때문이다. 이는 기술자가 관심 세포 이외의 모든 것을 피할 수 있도록 도와준다.null

이러한 자동화된 시스템은 각각 몇 가지 작업을 수행해야 한다.그것은 반드시 피펫의 끝이나 1~2 μm의 구멍이 있는 다른 장치 옆에 셀을 위치시키고, 구멍의 압력을 조절하며, 셀 내부의 전압을 조절해야 한다.null

체내

체내 패치 클램핑의 한 예는 Kodandaramaiah, et al.에 의해 보여졌다.[4]이 경우 압력 컨트롤은 정비사가 이전에 제공한 세 가지 압력(고압 800~1000mbar, 저압 20~30mbar, 소진공 15~150mbar)을 제공하기 위해 전자 밸브와 전자 압력 조절기로 구성되었다.세 개의 전자 밸브가 세 개의 압력과 대기압 사이에서 전환되었다.고압은 피펫이 막히는 것을 방지하기 위해 사용되었고, 저압은 셀을 검색할 때 사용되었으며, 진공상태는 기가세일링 과정을 돕는데 사용되었다.이것들은 모두 피펫 끝의 저항이 변함에 따라 압력 중에서 선택하기 위해 컴퓨터에 의해 제어되었다.null

이 경우 수동 위치 제어는 컴퓨터가 제어하는 피에조 마이크로모니프레이터로 대체되었고, 피펫은 세포와 접촉할 때까지 2~3μm의 불연속적인 단계로 조직 안으로 피펫을 이동시켰다.이 정밀 제어는 수동 배치보다 훨씬 정확하고 반복 가능하며 조작자가 필요하지 않다.null

컴퓨터는 또한 피펫이 셀과 접촉할 때 전기 저항의 변화를 계산하고 추적한다.그것은 피펫의 끝을 빠져나오거나 세포막에 의해 차단되는 사각파 형태의 전압 신호를 피펫 아래로 보낸다.막이 그것을 막으면 컴퓨터는 피펫의 움직임을 멈추고 석션하여 기가살(Gigaseal)을 형성한다.이러한 자동화를 통해 기술자가 수행해야 했던 의사결정이 제거되며, 기술자와는 달리 컴퓨터는 이러한 작업을 지치지 않고 보다 정밀하게 수행할 수 있다.null

이러한 모든 단계는 수동 패치 클램핑과 동일한 논리적 순서로 수행되지만, 수행하는데 광범위한 교육이 필요하지 않으며 컴퓨터에 의해 완전히 제어된다.이것은 패치 클램프 레코딩을 얻는 데 필요한 비용을 줄이고 살아있는 뇌에서 레코딩의 반복성과 견고성을 증가시킨다.null

보류 중

드롭릿 서스펜션 배양 및 중력을 사용하여 피펫 위에 셀을 배치하는 패치 클램프 시스템의 개략도.피펫 내부의 흡입은 세포들을 피펫 끝으로 끌어들이고, 그 다음 기체를 형성한다.
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기가살, 전체 셀 기록 구성, 이온 채널 및 전체 셀 전류를 보여주는 패치 클램프 칩의 개략도.

서스펜션 배양액에서 많은 유형의 시스템이 패치 클램핑 셀을 위해 개발되었다.한 시스템은 전통적인 피펫과 드롭릿 서스펜션 배양 셀을 사용하여 패치 클램프 기록을 얻는다(그림 참조).이것은 유리 모세관을 가열하여 세로 방향으로 당겨 패치 클램핑에 사용되는 테이퍼형 팁을 만드는 기존의 피펫 제작 시스템을 사용하는 추가적인 이점이 있다.null

정지 배양균을 위한 보다 일반적인 자동화 시스템은 피펫 대신 평판 기질에 작은(1~2μm) 구멍이 있는 마이크로칩을 사용하여 단일 세포에서 기가살과 기록을 만든다.패치칩은 반도체 업계가 개발한 미세조립 기술이 개선되면서 2000년대 초 개발됐다.칩은 일반적으로 실리콘, 유리, PDMS, 폴리미드로 만들어진다.패치 칩 시스템은 일반적으로 더 복잡하고 비싸지만 병렬 및 핸즈프리 작동의 추가적인 이점을 가지고 있다.[5][6][7]null

보통, 뉴런은 정지 배양액에서 자라지 않지만, 다른 세포 종류는 자랄 수 있다.어떤 것들은 관심 있는 막 이온 채널을 만들기 위해 유전자로 전염될 수 있다.이것은 보통 전기적 활동을 하지 않는 세포가 이온 전류를 발생시키는 막에 이온 채널을 성장시킬 수 있다는 것을 의미한다.정지 배양액에서 세포가 서로 분리되기 때문에 단일 세포의 이온 전류를 정밀하게 측정할 수 있다.이를 통해 연구자들은 신경망에서 흔히 일어나는 것처럼 다른 세포가 간섭하지 않고 더 통제된 환경에서 이온 채널의 동작을 연구할 수 있다.이것은 특히 대상이 특정 단백질인 약물 검사 연구에서 유용하다.[8]보류 중인 셀을 취급하는 것이 배양 세포나 생체내 세포 취급보다 훨씬 용이하기 때문에 패치 클램프 녹음을 훨씬 빠르고 안정적으로 얻을 수 있어 생산성이 높아져 수천 개의 화합물 스크리닝이 가능하다.[9]null

줄기 세포에서 파생된 뉴런은 일관성 있게 배양되어 고정될 수 있으며 평면 패치 클램프 장치에 성공적으로 사용되어 왔다.[10]리간드 GABA에 의해 개방된 전압 게이트 나트륨 채널, 전압 게이트 칼륨 채널, 이온 게이트 이온 채널 등의 이온 채널은 자동화되고 수동적인 패치 클램프를 사용하여 이들 셀로부터 기록되었다.[11]null

문화에서

배양된 세포나 뇌 조직 조각의 자동 패치 클램핑에는 많은 시험관내 방법이 있다.null

배양된 세포들이 자라면서 기가스체가 형성되는 오리피스로 이동하게 하는 표면 처리와 함께 위에서 논의한 것과 같은 패치칩을 사용한다.[12]배양된 뉴런들이 자라게 함으로써, 그들은 뇌의 신경세포처럼 자연적으로 네트워크를 형성하는데, 이는 정지된 고립된 세포라기 보다는 자연 조직에 더 가깝다.null

또 다른 방법으로는, 세포가 동물에서 제거되어, 폴리이미드와 PDMS 패치 칩으로 자발적으로 기가살(Gigaseal)을 형성하면서 2~4시간 동안 패치 칩에 배양된다. 이 시스템은 기가살(Gigaseal)을 형성하기 위한 외부 장비가 필요하지 않다.null

또 다른 기술은 문화에서 패치 클램핑 세포의 위치를 자동화하는 것이다.그것은 정확한 피에조 작용의 스테이지에 나노피펫을 사용하여 배양 접시의 표면을 스캔한다.스캔할 때 피펫 끝과 그 아래 표면 또는 셀 사이에 일정한 전기 캐패시턴스를 위아래로 움직여서 유지한다.(셀 가까이 이동하면 캐패시턴스가 증가하므로 액츄에이터가 피펫을 멀리 이동시킨다.)이것은 문화 요리 안에 있는 표면의 정확한 지형도를 보여준다.세포가 매핑된 후, 컴퓨터는 피펫을 선택된 세포로 옮기고 피펫을 낮춰 그것으로 기가살(Gigaseal)을 형성한다.[14]null

또 다른 기술은 세포를 조심스럽게 접촉하는 사업을 단순히 자동화한다.운영자는 피펫을 샘플 위에 배치한 다음 자동 소프트웨어가 이어받도록 하여 피펫을 낮추고 피펫이 셀과 접촉할 때 피펫의 저항 증가를 탐지한다.이 시점에서 프로세스가 종료되고 기술자가 수동으로 기가살(Gigaseal)을 생성한다.null

개발 및 수용

패치 클램프 자동화 계측기는 2003년에 상용화되었다.초기 20년 가까이 된 높은 비용 때문에 이 기술은 원래 생명공학 및 제약 산업에 서비스를 제공하기 위한 것이었지만, 최근 몇 년 동안 입증된 기술적 신뢰성과 상대적으로 비용에 대한 접근성을 고려할 때, 학계와 비영리적인 환경에서 그 존재가 증가하고 있다.이제 점점 더 많은 대학과 다른 학술 기관들이 관련되거나 보완적인 기술 및 방법들과 연계되고 공존하는 패치 클램프 자동 기구를 갖춘 실험실 및 핵심 시설을 갖추고 있다.[15]자동화 패치 클램프 전기생리학의 수용과 인정은 이 혁신적인 신기술로 얻은 결과와 함께 출판된 과학 문헌의 기하급수적인 성장에 반영된다.

참조

  1. ^ Wood C, Williams C, Waldron GJ (May 2004). "Patch clamping by numbers". Drug Discovery Today. 9 (10): 434–41. doi:10.1016/S1359-6446(04)03064-8. PMID 15109948.
  2. ^ Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (August 1981). "Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches". Pflügers Archiv. 391 (2): 85–100. CiteSeerX 10.1.1.456.107. doi:10.1007/BF00656997. PMID 6270629. S2CID 12014433.
  3. ^ Tripathy, Shreejoy J.; Toker, Lilah; Bomkamp, Claire; Mancarci, B. Ogan; Belmadani, Manuel; Pavlidis, Paul (2018-10-08). "Assessing Transcriptome Quality in Patch-Seq Datasets". Frontiers in Molecular Neuroscience. 11: 363. doi:10.3389/fnmol.2018.00363. ISSN 1662-5099. PMC 6187980. PMID 30349457.
  4. ^ Kodandaramaiah SB, Franzesi GT, Chow BY, Boyden ES, Forest CR (June 2012). "Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo". Nature Methods. 9 (6): 585–7. doi:10.1038/nmeth.1993. PMC 3427788. PMID 22561988.
  5. ^ Jones KA, Garbati N, Zhang HM, Large CH (2009). "Automated Patch Clamping Using the QPatch". High Throughput Screening. Methods in Molecular Biology. Vol. 565. pp. 209–23. doi:10.1007/978-1-60327-258-2_10. ISBN 978-1-60327-257-5. PMID 19551364.
  6. ^ Chen CY, Tu TY, Chen CH, Jong DS, Wo AM (August 2009). "Patch clamping on plane glass-fabrication of hourglass aperture and high-yield ion channel recording". Lab on a Chip. 9 (16): 2370–80. doi:10.1039/B901025D. PMID 19636469.
  7. ^ Obergrussberger A, Stölzle-Feix S, Becker N, Brüggemann A, Fertig N, Möller C (2015). "Novel screening techniques for ion channel targeting drugs". Channels. 9 (6): 367–75. doi:10.1080/19336950.2015.1079675. PMC 4850050. PMID 26556400.
  8. ^ Dunlop J, Bowlby M, Peri R, Vasilyev D, Arias R (April 2008). "High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology". Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (4): 358–68. doi:10.1038/nrd2552. PMID 18356919. S2CID 9294213.
  9. ^ Obergrussberger A, Brüggemann A, Goetze TA, Rapedius M, Haarmann C, Rinke I, et al. (December 2016). "Automated Patch Clamp Meets High-Throughput Screening: 384 Cells Recorded in Parallel on a Planar Patch Clamp Module". Journal of Laboratory Automation. 21 (6): 779–793. doi:10.1177/2211068215623209. PMID 26702021.
  10. ^ Haythornthwaite A, Stoelzle S, Hasler A, Kiss A, Mosbacher J, George M, et al. (October 2012). "Characterizing human ion channels in induced pluripotent stem cell-derived neurons". Journal of Biomolecular Screening. 17 (9): 1264–72. doi:10.1177/1087057112457821. PMID 22923790.
  11. ^ Haythornthwaite A, Stoelzle S, Hasler A, Kiss A, Mosbacher J, George M, et al. (October 2012). "Characterizing human ion channels in induced pluripotent stem cell-derived neurons". Journal of Biomolecular Screening. 17 (9): 1264–72. doi:10.1177/1087057112457821. PMID 22923790.
  12. ^ Py C, Martina M, Diaz-Quijada GA, Luk CC, Martinez D, Denhoff MW, et al. (2011). "From understanding cellular function to novel drug discovery: the role of planar patch-clamp array chip technology". Frontiers in Pharmacology. 2: 51. doi:10.3389/fphar.2011.00051. PMC 3184600. PMID 22007170.
  13. ^ Martinez D, Py C, Denhoff MW, Martina M, Monette R, Comas T, et al. (December 2010). "High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip". Biomedical Microdevices. 12 (6): 977–85. CiteSeerX 10.1.1.362.9850. doi:10.1007/s10544-010-9452-z. PMID 20694518. S2CID 14441945.
  14. ^ Gorelik J, Gu Y, Spohr HA, Shevchuk AI, Lab MJ, Harding SE, et al. (December 2002). "Ion channels in small cells and subcellular structures can be studied with a smart patch-clamp system". Biophysical Journal. 83 (6): 3296–303. Bibcode:2002BpJ....83.3296G. doi:10.1016/S0006-3495(02)75330-7. PMC 1302405. PMID 12496097.
  15. ^ Picones A, Loza-Huerta A, Segura-Chama P, Lara-Figueroa CO (2016). "Contribution of Automated Technologies to Ion Channel Drug Discovery". Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 104: 357–378. doi:10.1016/bs.apcsb.2016.01.002. ISBN 9780128048269. PMID 27038379.
  16. ^ Picones A (2015). "Ion channels as medicinal targets of biological toxins: the impact of automated patch-clamp electrophysiology". Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (7): 631–7. doi:10.2174/1568026615666150309145928. PMID 25751269.

외부 링크