패치 클램프

Patch clamp
유리 피펫으로 패치된 세균성 구상체
전류의 패치 클램프 기록은 단일 이온 채널의 두 컨덕턴스 상태(상부)와 개방(하부) 사이의 전이를 나타냅니다.

패치 클램프 기술은 개별 격리된 살아있는 세포, 조직 단면 또는 세포막의 패치에서 이온 전류를 연구하는 데 사용되는 전기생리학 실험실 기술입니다.이 기술은 특히 뉴런, 심근세포, 근육섬유 및 췌장 베타 세포와 같은 흥분성 세포 연구에 유용하며, 특별히 준비된 거대 구상체 내 세균 이온 채널 연구에도 적용될 수 있습니다.

패치 클램핑은 전압 클램프 기법을 사용하여 수행할 수 있습니다.이 경우 세포막 전체의 전압은 실험자에 의해 제어되며 그 결과 발생하는 전류를 기록한다.또는 전류 클램프 기술을 사용할 수 있다.이 경우 막을 통과하는 전류는 실험자에 의해 제어되며, 그 결과 전압의 변화는 일반적으로 활동전위의 형태로 기록된다.

Erwin Neher와 Bert Sakmann은 1970년대 후반과 1980년대 초반에 패치 클램프를 개발했습니다.이 발견은 처음으로 단일 이온 채널 분자의 전류를 기록하는 것을 가능하게 했고, 이것은 활동 전위와 신경 활동과 같은 기본적인 세포 과정에 채널이 관여하는 것에 대한 이해를 향상시켰다.Neher와 Sakmann은 1991년 이 [1]연구로 노벨 생리의학상을 받았다.

기본 기술

셋업

현미경, 항진동 테이블 및 마이크로매니퓰레이터를 사용한 기존 패치 클램프 설정

패치 클램프 기록 중에 마이크로피펫 또는 전해액과 증폭기에 접속된 기록전극이 충전된 패치피펫으로 알려진 중공유리관을 절연셀의 막에 접촉시킨다.다른 전극은 기준 접지전극으로서 셀 또는 조직을 둘러싼 욕조에 배치된다.관심 셀을 사이에 두고 기록 전극과 기준 전극 사이에 전기회로를 형성할 수 있다.

패치 클램프 및 기타 기록용 마이크로피펫 준비에 사용되는 피펫 풀러 장치의 개략도
전체 셀 또는 다공 패치 클램프 중에 형성된 회로

패치 피펫을 채운 용액은 세포 부착 기록의 경우처럼 욕조 용액의 이온 성분과 일치하거나 전세포 기록의 경우 세포질과 일치할 수 있습니다.목욕 용액의 용액은 수행할 실험에 따라 생리학적 세포외 용액인 세포질과 일치하거나 완전히 비생리학적일 수 있습니다.연구원은 또한 이온 또는 약물을 첨가하여 다양한 조건에서 이온 채널을 연구함으로써 욕조 용액(또는 피펫 용액)의 함량을 변경할 수 있습니다.

연구자가 측정하려는 것에 따라 사용되는 피펫 팁의 지름은 달라질 수 있지만, 일반적으로 마이크로미터 [2]범위 내에 있습니다.이 작은 크기는 세포막 표면적을 둘러싸거나 종종 하나 또는 몇 개의 이온 채널 [3]분자를 포함하는 "패치"에 사용됩니다.이러한 유형의 전극은 세포막을 통해 삽입되는 것이 아니라 세포막 표면에 봉인된다는 점에서 기존의 세포 내 기록에서 세포를 뚫는 데 사용되는 "선명한 미세 전극"과는 다릅니다.

기존 패치 클램프 기록 시 사용되는 일반적인 장비

일부 실험에서 마이크로피펫 팁은 세포막과 함께 고저항 씰을 형성하는 데 도움이 되는 매끄러운 표면을 만들기 위해 마이크로 단조기로 가열됩니다.이 고저항 씰을 얻기 위해 마이크로피펫을 세포막에 눌러 흡착한다.세포막의 일부는 피펫으로 흡입되어 올바르게 형성되면 10-100기가옴 범위의 저항성을 생성하는 오메가 모양의 막 영역을 형성하며, 이를 "기가옴 씰" 또는 "기가살"[3]이라고 합니다.이 씰의 높은 저항으로 인해 경쟁 노이즈가 거의 없는 멤브레인 패치 전체에서 측정된 전류를 전자적으로 차단할 수 있을 뿐만 아니라 [4]녹음에 기계적 안정성을 제공할 수 있습니다.

녹음

뇌 조직의 한 조각에 있는 신경 세포의 클램프를 고정합니다.사진의 피펫은 약간 파란색으로 표시되어 있습니다.

대부분의 패치 클램프 앰프는 참 전압 클램프 회로를 사용하지 않고 욕조 전극을 사용하여 제로 전류(접지) 레벨을 설정하는 차동 앰프입니다.이를 통해 연구자는 전류의 변화를 관찰하면서 전압을 일정하게 유지할 수 있습니다.이러한 기록을 작성하기 위해 패치 피펫을 접지 전극과 비교합니다.그런 다음 전류가 시스템에 주입되어 일정한 설정 전압을 유지합니다.전압을 클램프하는 데 필요한 전류는 부호 [3]반대이며 막을 통과하는 전류와 크기가 같습니다.

또는 전셀 모드에서 전류를 클램프하여 막전압의 [5]변화를 관찰하면서 전류를 일정하게 유지할 수 있다.

바리에이션

패치 클램프 기술의 변화를 나타내는 다이어그램

연구자가 무엇을 연구하고자 하는지에 따라 몇 가지 기본 기술의 변형을 적용할 수 있다.이 패치는 세포 본체에서 제거(제거)되기 때문에 inside-out 및 outside-out 기술을 "excised patch" 기술이라고 합니다.전극에 부착된 막의 단면에서의 개별 이온 채널의 거동을 연구하기 위해 세포 부착 및 양쪽 절제 패치 기술을 사용한다.

연구자는 전지 패치와 천공 패치를 사용하여 단일 채널 전류 대신 전지 전체의 전기적 동작을 연구할 수 있습니다.셀 내부에 대한 저저항 전기적 접근을 가능하게 하는 전셀 패치는 현재 세포막 전체에 걸쳐 전류를 기록하는 고저항 마이크로 전극 기록 기술을 대체했습니다.

셀 접속 패치

셀접속패치구성

본 발명에 따르면 피펫은 세포막 위에 봉인되어 세포막이 손상되지 않은 상태에서 기가살(기가옴 정도의 전기저항을 가진 봉인)을 얻는다.이를 통해 피펫에 의해 포착된 멤브레인 패치에 포함된 단일 또는 몇 개의 이온 채널을 통해 전류를 기록할 수 있습니다.세포막 외부에 부착하는 것만으로 세포구조의 [3]교란이 거의 없다.또한 세포 내부를 파괴하지 않음으로써, 일반적으로 채널에 영향을 미치는 세포 내 메커니즘은 여전히 생리적으로 [6]기능할 수 있을 것이다.이 방법을 사용하면 적절한 구성을 비교적 쉽게 얻을 수 있으며, 한 번 얻으면 상당히 [7]안정적입니다.

리간드 게이트 이온 채널 또는 메타보트로픽 수용체에 의해 변조된 채널의 경우, 연구 중인 신경전달물질 또는 약물은 일반적으로 피펫 용액에 포함되며, 여기서 피펫은 막의 외부 표면이었던 것과 상호작용할 수 있다.결과 채널 활성은 사용되는 약물에 기인할 수 있지만, 일반적으로 피펫 내부의 약물 농도를 변경할 수는 없습니다.따라서 이 기법은 패치당 선량 응답 곡선의 한 포인트로 제한됩니다.따라서 선량 반응은 여러 셀과 패치를 사용하여 달성된다.그러나 전압 개폐 이온 채널은 단일 패치로 다른 막 전위로 순차적으로 클램프할 수 있다.따라서 채널이 전압의 함수로 활성화되고 하나의 패치에서만 완전한 I-V(전류-전압) 곡선을 설정할 수 있습니다.이 기술의 또 다른 잠재적 단점은 세포의 세포 내 경로가 교란되지 않는 것과 마찬가지로 직접적으로 [7]수정될 수도 없다는 것이다.

Inside-out 패치

Inside-out 패치 구성

본 발명의 인사이드아웃방법은 해당 막의 패치를 패치피펫에 부착하고 나머지 세포에서 분리한 후 해당 막의 세포성 표면을 외부매체 또는 [8]욕조에 노출시킨다.이 방법의 장점 중 하나는 실험자가 욕조를 통해 막의 세포 내 표면에 접근할 수 있고 막 내부 표면이 노출되는 부분의 화학적 구성을 변경할 수 있다는 것이다.이것은 실험자가 단일 이온 채널의 세포 내 표면에서 환경을 조작하고자 할 때 유용합니다.예를 들어 세포 내 리간드에 의해 활성화된 채널은 리간드 농도의 범위를 통해 연구될 수 있다.

내부-아웃 구성을 실현하기 위해 피펫은 세포 부착 모드와 같이 세포막에 부착되어 기가잘을 형성한 후 수축하여 세포 나머지 부분으로부터 막의 패치를 떼어낸다.막 패치를 떼어내면, 피펫 팁에 막의 소포가 형성되는 경우가 많습니다.패치막의 끝부분이 절개 후 빠르게 융합되기 때문입니다.그런 다음 소포의 외부 표면을 부수어 안쪽-아웃 모드로 전환해야 합니다. 이 작업은 욕조 용액/공기 계면을 통해 막을 잠깐 꺼내거나, 낮은2+ Ca 용액에 노출되거나, 파라핀 한 방울 또는 경화된 [9]실리콘 폴리머 조각과 순간적으로 접촉함으로써 수행할 수 있습니다.

전셀 기록 또는 전셀 패치

전체 셀 패치 구성

전셀 기록에는 세포막의 넓은 영역에 걸쳐 여러 채널을 통해 동시에 전류를 기록하는 것이 포함됩니다.전극은 세포 부착 기록에서와 같이 세포에 그대로 남아 있지만, 더 많은 흡인이 막 패치를 파열시키기 위해 적용되어 피펫 내부로부터 세포 내 공간에 접근할 수 있습니다.이것은 치료제(예: 약물)가 세포에 실시간으로 [10]어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 관리하고 연구할 수 있는 수단을 제공한다.피펫이 세포막에 부착되면 패치를 파괴하는 두 가지 방법이 있습니다.첫 번째는 석션을 더 많이 하는 것이다.이 흡입의 양과 지속 시간은 피펫의 세포 유형과 크기에 따라 달라집니다.다른 방법은 피펫을 통해 대량의 전류 펄스를 전송해야 합니다.인가되는 전류의 양과 펄스의 지속 시간도 [7]셀 유형에 따라 달라집니다.일부 유형의 셀에서는 두 가지 방법을 동시에 적용하여 패치를 해제하는 것이 편리합니다.

날카로운 전극 기술 기록보다 전체 셀 패치 클램프 기록의 장점은 패치 클램프 전극 끝의 큰 개구부가 저항을 줄여 [11][10]셀 내부에 대한 전기적 접근을 개선한다는 것입니다.이 기술의 단점은 전극의 부피가 셀의 부피보다 크기 때문에 셀 내부의 용해성 성분이 전극의 내용물로 서서히 대체된다는 것입니다.이를 전극이 셀의 [7]내용물을 "투석"한다고 합니다.잠시 후, 수용성 세포 내 함량에 의존하는 세포의 특성은 바뀔 것이다.일반적으로 사용되는 피펫 용액은 세포 내부의 고칼륨 환경과 비슷하여 이로 인해 발생할 수 있는 변화를 최소화합니다.대부분의 경우 셀 전체를 기록할 때 셀이 [7]투석되기 전에 측정을 수행할 수 있는 기간이 있습니다.

외부 패치

Outside-out 패치 형성 기술.순서: 왼쪽 위, 오른쪽 위, 왼쪽 아래, 오른쪽 아래

"Outside-out"이라는 이름은 이 기술의 Inside-out 기술에 대한 보완성과 세포막의 외부 표면을 패치 [6]전극과 관련하여 막의 바깥쪽에 배치한다는 사실을 모두 강조한다.

아웃사이드 패치의 형성은, 셀 전체의 기록 설정으로 개시됩니다.전체 셀 구성이 형성된 후 전극이 셀에서 천천히 인출되어 세포에서 막의 구근이 튀어나온다.전극이 충분히 멀리 당겨지면 이 블리브가 셀에서 분리되고 전극 끝에 볼록한 막(전극 끝에 열린 공처럼)으로 형성되며 막의 원래 바깥쪽이 [6]전극에서 바깥쪽으로 향합니다.오른쪽 그림과 같이, 이것은 피펫 내부의 유체가 세포 내 유체를 시뮬레이션하는 것을 의미하며, 연구자는 피펫과 블렙을 다른 용액의 통로로 자유롭게 이동할 수 있습니다.막의 블리브에는 여러 채널이 존재할 수 있지만, 분리된 막의 블리브가 작고 하나의 [12]채널만 포함하는 경우 이 구성에서는 단일 채널 기록도 가능합니다.

외부 패치 적용은 이온 채널이 세포에서 분리되고 세포 외 표면에 있는 다른 용액에 연속적으로 노출될 때 실험자에게 이온 채널의 특성을 검사할 수 있는 기회를 줍니다.실험자는 비교적 짧은 시간에 다양한 용액으로 동일한 패치를 관류할 수 있으며, 신경전달물질이나 세포외 얼굴의 약물에 의해 채널이 활성화되면 용량-반응 곡선을 [13]얻을 수 있다.서로 다른 용액에서 정확히 동일한 막 조각을 통해 전류를 측정하는 이 기능은 세포 연결 방법에 대한 외부 패치의 뚜렷한 이점입니다.반면에, 그것은 성취하기 더 어렵다.형성 프로세스가 길어질수록 실패할 수 있는 단계가 많아지고 사용 가능한 패치의 빈도가 낮아집니다.

천공 패치

천공 패치 기술

이 패치 클램프 방식의 변형은 전체 셀 구성과 매우 유사합니다.가장 큰 차이점은 실험자가 기가옴 씰을 형성할 때 패치막을 파열시키기 위해 흡입을 하지 않는다는 것이다.대신 전극용액에는 암포테리신-B, 니스타틴 또는 그라미시딘과 같은 소량의 항진균제 또는 항생제가 함유되어 있으며, 이 항진균제는 막 패치 안으로 확산되어 막 [14]안에 작은 구멍을 형성하여 세포 내부에 전기적 접근을 제공한다.전세포와 다공성 패치 방법을 비교할 때, 전세포 패치를 피펫 용액과 세포질 사이의 분자가 완전히 교환되는 열린 문이라고 생각할 수 있다.다공성 패치는 피펫 용액에서 세포의 세포질로 특정 분자를 교환할 수 있는 스크린 도어에 비유할 수 있습니다.

전세포 기록과 비교하여 다공성 패치법의 장점은 패치 피펫과 세포졸 사이의 작은 1가 이온만 균등하게 할 수 있는 항생제 모공의 특성을 포함하고, 모공을 투과할 수 없는 큰 분자는 균등하게 할 수 없다.이 특성은 Ca와 같은2+ 2가 이온과 cAMP와 같은 시그널링 분자의 내인성 수준을 유지합니다. 따라서 세포 부착 기록과 같이 대부분의 세포 내 시그널링 메커니즘을 유지하면서 전체 세포에 대한 기록을 가질 수 있습니다.그 결과, 전류의 저하가 경감되어 안정된 천공 패치 기록이 1시간 [14]이상 지속될 수 있습니다.단점은 전극의 선단을 차지하는 부분막으로 인해 전체 셀에 비해 접근 저항이 높다는 것입니다.이로 인해 전류 분해능이 저하되고 녹음 노이즈가 증가할 수 있습니다.항생제가 막을 뚫는 데는 상당한 시간이 걸릴 수 있다.전극 팁 아래의 막은 항생제에 의해 형성된 천공에 의해 약해지고 파열될 수 있습니다.패치가 파열되면 기록은 전세포 모드가 되고 항생제가 [14]세포 내부를 오염시킵니다.

느슨한 패치

느슨한 패치 클램프 기술

느슨한 패치 클램프는 기존 기술에서 사용되는 엄격한 기가살이 아닌 느슨한 씰(저전기 저항)을 사용한다는 점에서 여기서 설명하는 다른 기술과 다릅니다.이 기술은 1961년 Strickholm이 근육세포 [15]표면의 임피던스에 대해 설명한 바와 같이 일찍이 사용되었지만 패치 클램프가 전기생리학 주요 도구로 확립된 후 1982년 [16]Almers, Stanfield 및 Stühmer에 의해 다시 제기될 때까지 거의 주목을 받지 못했다.

세포막에 느슨한 패치 클램프를 달성하기 위해 피펫은 셀을 향해 천천히 이동하며 셀과 피펫 사이의 접촉 전기 저항이 전극의 몇 배까지 증가합니다.피펫이 막에 가까워질수록 피펫 팁의 저항은 커지지만 너무 밀착하면 피펫이 손상되지 않고 분리되기 어려울 수 있습니다.느슨한 패치 공법은 피펫이 기가잘 또는 영구적인 접속을 형성하기 위해 막에 충분히 접근하지 않고 세포막을 [17]관통하지 않는다.세포막은 온전하게 유지되며, 밀폐가 부족하면 이온이 피펫 안으로 들어가지 않고 세포 밖으로 통과할 수 있는 작은 틈이 생긴다.

느슨한 씰의 큰 장점은 사용 중인 피펫을 기록 후 반복적으로 막에서 분리할 수 있고 막이 그대로 유지된다는 것입니다.이를 통해 막의 무결성을 파괴하지 않고 동일한 셀의 다양한 위치에서 반복 측정을 수행할 수 있습니다.이러한 유연성은 근육세포가 실제 생리 조건 하에서 수축하기 때문에 연구자들에게 특히 유용하고, 기록을 빨리 얻으며, 근육섬유의 [16]수축을 막기 위한 과감한 조치에 의존하지 않고 그렇게 한다.주요 단점은 피펫과 막 사이의 저항이 크게 감소하여 씰을 통해 전류가 누출되고 소전류의 분해능이 현저히 떨어진다는 것이다.그러나 이 누출은 부분적으로 수정될 수 있으며, 이를 통해 관심 셀의 여러 영역에서 작성된 기록을 비교 및 대조할 수 있습니다.따라서 느슨한 패치 기법으로 1mA/[17]cm2 미만의 전류를 해결할 수 있을 것으로 추정됩니다.

패치 조작

세포 이미징, RNA 배열 및 패치 클램프의 조합은 여러 가지 [18]형태에 걸쳐 뉴런을 완전히 특징짓기 위해 사용됩니다.신경 조직이 가장 전사적으로 다양한 세포 집단 중 하나이기 때문에, 뉴런이 형성되는 회로를 이해하기 위해 뉴런을 세포 유형으로 분류하는 것은 신경 과학자들에게 큰 도전이다.고전적인 분류 방법과 단일 세포 RNA 염기서열 분석 후를 결합하는 것은 어렵고 느린 것으로 입증되었다.Patch-seq는 전기생리학, 염기서열 분석 및 현미경 검사와 같은 여러 데이터 양식을 결합하여 뉴런을 여러 방법으로 동시에 특성화할 수 있도록 합니다.이는 현재 주로 뉴런에 패치 클램프를 성공적으로 기록하는 데 수반되는 수작업으로 인해 다른 배열 방법에 비해 낮은 처리량을 겪고 있다.패치 클램프 테크놀로지를 자동화하여 패치 seq의 throughput도 [19]개선하기 위한 조사가 현재 진행 중입니다.

자동 패치 클램핑

단기간에 저렴한 비용으로 대량의 데이터를 수집하기 위해 자동화된 패치 클램프 시스템이 개발되었습니다.이러한 시스템은 일반적으로 사출 성형 또는 폴리디메틸실록산(PDMS) 캐스트 칩 중 하나를 사용하여 세포를 포착하는 일회용 마이크로 유체 소자 및 일체형 전극을 포함한다.

이러한 자동화 시스템의 한 형태에서 압력차는 연구 대상 세포가 기가잘을 형성할 때까지 피펫 개구부를 향해 강제로 끌어당기기 위해 사용된다.그 후 피펫 선단을 대기 중에 잠깐 노출시킴으로써 피펫에서 돌출된 막의 일부가 파열되어 피펫 선단에서 막이 안쪽으로부터 바깥쪽으로 배치된다.완전히 자동화된 시스템에서 피펫과 막 패치는 일련의 다른 테스트 용액을 통해 신속하게 이동할 수 있으며 기록 중에 [19]다른 테스트 화합물을 막 내 측에 적용할 수 있다.

「 」를 참조해 주세요.

레퍼런스

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외부 링크