루리아-델브뤼크 실험

루리아-델브뤼크 실험(1943)은 박테리아에서 유전자 돌연변이는 그것에 대한 반응이라기보다 선택적 압력이 없는 상태에서 발생한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 무작위 돌연변이에 작용하는 다윈의 자연 선택 이론은 박테리아뿐만 아니라 더 복잡한 유기체에도 적용된다는 결론을 내렸습니다. 막스 델브뤼크와 살바도르 루리아는 1969년 노벨 생리학·의학상을 수상했습니다.

역사

유전 물질로서의 DNA의 역할은 아직 확립되지 않았지만, 1940년대에 이르러 유전과 돌연변이에 대한 아이디어는 일반적으로 받아들여졌습니다. 박테리아는 그들이 스스로 발견한 상황에 따라 유전적인 돌연변이를 일으킬 수 있다고 생각되었습니다. 즉, 박테리아의 돌연변이는 사전 적응적(선존재)이었는가 아니면 사후 적응적(선지향적 적응)이었는가?^[1]

그들의 실험에서 루리아와 델브뤼크는 별도의 배양 튜브에 소수의 박테리아(대장균)를 접종했습니다. 성장 기간 후, 그들은 T1 파지(바이러스)를 포함하는 한천에 동일한 부피의 이러한 개별 배양체를 플레이팅했습니다. 박테리아의 바이러스에 대한 내성이 박테리아의 유도된 활성화에 의해 발생한 경우, 즉 내성이 유전적인 유전적 성분 때문이 아니라면 각 플레이트에는 거의 동일한 수의 내성 집락이 포함되어야 합니다. Luria는 돌연변이의 일정한 비율을 가정하여 선택제에 노출된 후와 그에 대한 반응으로 돌연변이가 발생하면 평균이 분산과 같은 포아송 분포에 따라 생존자 수가 분포할 것이라고 가정했습니다. 델브뤼크와 루리아가 발견한 것은 이것이 아니었습니다. 대신 각 플레이트에 있는 내성 집락의 수는 크게 달라졌습니다. 분산은 평균보다 상당히 컸습니다.

Luria and Delbrück는 이러한 결과를 초기 배양 튜브에서 자라는 각 세대의 박테리아에서 일정한 비율의 무작위 돌연변이가 발생하는 것으로 설명할 수 있다고 제안했습니다. 이러한 가정을 바탕으로 델브뤼크는 실험적으로 얻은 값과 일치하는 순간 사이의 관계를 제공하는 확률 분포(현재는 루리아-델브뤼크 분포라고^[2][3] 함)를 도출했습니다. 따라서 박테리아의 돌연변이는 다른 유기체와 마찬가지로 지시가 아닌 무작위라는 결론을 내렸습니다.^[4]

루리아와 델브뤼크의 결과는 뉴컴에 의해 더 그래픽적이지만 덜 정량적인 방법으로 확인되었습니다. 뉴컴은 페트리 접시에서 몇 시간 동안 박테리아를 배양한 다음 파지로 처리된 두 개의 새로운 페트리 접시에 복제 플레이팅했습니다. 첫 번째 플레이트는 펴지지 않은 채로 놔둔 다음 두 번째 플레이트는 다시 펴졌고, 즉 박테리아 세포는 일부 집락의 단일 세포가 그들만의 새로운 집락을 형성하도록 주변으로 이동되었습니다. 만약 집락이 파지 바이러스와 접촉하기 전에 저항성 박테리아 세포를 포함하고 있다면, 이 세포들 중 일부는 다시 펴진 접시에 새로운 저항성 집락을 형성하여 그곳에서 더 많은 수의 생존 박테리아를 찾을 것으로 예상할 수 있습니다. 성장을 위해 두 플레이트를 모두 배양했을 때, 실제로 리스프레드 플레이트에 박테리아 집락의 수가 50배나 더 많았습니다. 이것은 바이러스 내성에 대한 박테리아 돌연변이가 첫 번째 배양 동안 무작위로 발생했음을 보여주었습니다. 다시 한 번 선택이 적용되기 전에 돌연변이가 발생했습니다.^[5]

보다 최근에, Cairns 등은 환경 스트레스의 한 형태로서 당 대사의 돌연변이를 연구한 Luria와 Delbrück의 결과에 의문을 제기했습니다.^[6] 일부 과학자들은 이 결과가 유전자 증폭을 위한 선택 및/또는 분열할 수 없는 세포의 더 높은 돌연변이율에 의해 야기되었을 수 있다고 제안합니다.^[7] 다른 사람들은 연구를 옹호하고 적응적 돌연변이 유발과 일치하는 관찰된 현상을 설명하는 메커니즘을 제안했습니다.^[8]

이 분포는 Haldane에 의해 처음으로 결정된 것으로 보입니다.^[9] 1991년 University College London에서 이 분포를 설명하는 미공개 원고가 발견되었습니다. 파생은 다르지만 결과는 컴퓨터를 사용하지 않으면 계산하기 어렵습니다.

시험에 대한 설명

소수의 세포를 사용하여 비선택적 배지에서 평행 배양체를 접종합니다.^[10] 배양물은 동일한 세포 밀도를 얻기 위해 포화 상태로 성장합니다. 세포를 선택 배지에 플레이팅하여 돌연변이 수(r)를 얻습니다. 희석액을 풍부한 배지에 플레이팅하여 총 생존 세포 수(N_t)를 계산합니다. 포화 배양에서 나타나는 돌연변이의 수는 돌연변이 속도와 돌연변이가 배양 성장 중에 발생할 때의 척도입니다: 배양 성장 초기에 나타나는 돌연변이는 성장 중에 나중에 발생하는 돌연변이보다 훨씬 더 많은 돌연변이를 전파합니다. 이러한 요인으로 인해 돌연변이 사건의 수(m)가 동일하더라도 빈도(r_t / N)가 크게 달라집니다. 빈도는 돌연변이를 충분히 정확하게 측정할 수 없으며 항상 돌연변이율(m/N_t)을 계산해야 합니다.

돌연변이율(μ)의 추정이 복잡합니다. Luria and Delbruck은 분포의 평균으로부터 이 모수를 추정했지만, 그 후 이 추정량은 편향된 것으로 나타났습니다.

중앙값의 Lea-Coulson 방법은 1949년에 도입되었습니다.^[11] 이 방법은 방정식을 기반으로 합니다.

${\displaystyle {\frac {r}{m}}-\ln(m)-1.24=0.}$

위치:

r = 지표를 포함하는 한 플레이트의 집락 수(예: 리팜피신, 염소산나트륨, 스트렙토마이신)

m = 변이될 변수, 변이/배양에 해당합니다.

변수 m의 값은 방정식의 총 값이 0에 가까울 때까지 조정됩니다. 그러면 돌연변이율(돌연변이/세포/분열 또는 생성의 확률)은 다음 세 가지 공식 중 하나로 계산할 수 있습니다.

(1) $μ$ = $/median (Nt)$ {\displaystyle \mu = m/median (N_{t})}

(2) ${\displaystyle \mu }$ = m$$/ $($2 ∗ $중앙값($Nt)) {\displaystyle \mu = m / (2*중앙값(N_{t}))}

(3) ${\displaystyle }$μ = $m$∗ l (2) /$median$(Nt) {\displaystyle \mu = m*ln (2) / median (N_{t}}}

여기서 N은_t 비표시판(종종 첨가제가 없는 LB 한천)에서 생존 가능한 세포 수의 중앙값입니다.

어떤 공식을 사용할지는 세포 분열의 어느 단계에서 돌연변이가 발생할 것으로 예상되는지에 따라 달라집니다.

이 방법은 이후 개선되었지만 이러한 보다 정확한 방법은 복잡합니다. 현재 가장 잘 알려진 추정치는 Ma-Sandri-Sarkar 최대 우도 추정치입니다.^[13] 실험 데이터에서 얻은 여러 가지 추가 방법과 추정치가 설명되었습니다.^[14]

돌연변이율 계산을 위한 두 가지 웹 애플리케이션을 자유롭게 사용할 수 있습니다. 팔코와 bz-rate. Bz-rate는 돌연변이율과 차분 성장률을 모두 추정할 수 있는 생성 함수 추정기뿐만 아니라 돌연변이율과 야생형 세포 간의 상대적 차분 성장률을 고려할 수 있는 일반화된 버전의 Ma-Sandri-Sarkar 최대 우도 추정기를 구현합니다. Jones et al. 이 논문에는 작업된 예가 나와 있습니다.^[15]

분배

이 모든 모델에서 돌연변이율(μ)과 성장률(β)은 일정하다고 가정했습니다. 이러한 제약 조건 및 기타 제약 조건을 완화하기 위해 모델을 쉽게 일반화할 수 있습니다.^[16] 이러한 비율은 비실험 설정에서 다를 가능성이 있습니다. 또한 모델에는 N_t μ > > 1이 필요합니다_t. 여기서 N은 유기체의 총 수입니다. 이 가정은 가장 현실적이거나 실험적인 환경에서 유지될 가능성이 높습니다.

루리아와 델브뤼크는^[4] 방정식으로부터 돌연변이율을 추정했습니다.

${\displaystyle \mu = {\frac {\beta \ln(\rho )}{n_{0}[1-\exp(\beta t)]}}}$

여기서 β는 세포 성장 속도, n은₀ 각 배양액의 초기 박테리아 수, t는 시간, 그리고

${\displaystyle \rho = {\frac {N_{s}}{N}}$

여기서 N은_s 내성균이 없는 배양수이고 N은 전체 배양수입니다.

Lea와 Coulson의 모형은^[11] 독립적인 Yule 과정의 집합(필터링된 포아송 과정)을 고려했다는 점에서 원래와 차이가 있었습니다. 이 두 모델을 매개변수의 현실적인 값과 수치적으로 비교한 결과, 그들은 약간의 차이만 있는 것으로 나타났습니다.^[17] 이 모델의 생성 기능은 1978년^[18] 바틀렛에 의해 발견되었으며,

${\displaystyle G(z,\mu,\phi )=\exp \left ({\frac {\mu}{\phi}}\left ({\frac {1}{z}-1\right)\log \left(1-\phiz\right)}$

여기서 μ는 돌연변이율(assumed은 일정), β는 세포 성장률(또한 일정하다고 가정함), t는 시간으로 φ = 1 - e입니다.

이 방정식에서 μ를 구하는 것은 어려운 것으로 판명되었지만 2005년에^{[citation needed]} 해결책이 발견되었습니다. μ에 대한 생성 함수의 미분은 점수 함수의 사용과 함께 μ에 대한 신뢰 구간을 얻을 수 있는 뉴턴-랩슨 방법의 적용을 가능하게 합니다.

분자생물학

파지 T1에 대한 내성 메커니즘은 T1 수용체 역할을 하는 막 단백질인 fhuA 유전자의 돌연변이 때문이었던 것으로 보입니다.^[19] tonB 유전자 산물은 T1에 의한 감염에도 필요합니다. FhuA 단백질은 페리크롬, 알보마이신 및 리파마이신의 수송에 적극적으로 관여합니다.^[20] 또한 마이크로신 J25와 콜리신 M에 대한 민감성을 부여하고 T1뿐만 아니라 파지 T5와 phi80에 대한 수용체 역할을 합니다.

FhuA 단백질은 베타-배럴 도메인(residue 161 내지 714)을 가지며, 이는 구형 코르크 도메인(residue 1 내지 160)에 의해 폐쇄되는 것을 특징으로 하는 단백질.^[21] 코르크 도메인 내에는 TonB 결합 영역(잔기 7~11)이 있습니다. 단량체 β-배럴 도메인에 걸쳐 있는 큰 막은 가변 길이의 22개의 β-가닥을 가지고 있으며, 그 중 몇 개는 막 소수성 코어를 넘어 세포외 공간으로 크게 확장됩니다. L1부터 L11까지 번호가 매겨진 11개의 세포외 루프가 있습니다. L4 루프는 T1 파지가 결합하는 곳입니다.

참고문헌

외부 링크

• 돌연변이 실험실에서
• 과학 분야의 프로필: 살바도르 E. 국립 의학 도서관의 살바도르 루리아에 대한 루리아 논문 정보