박층 크로마토그래피

Thin-layer chromatography
박층 크로마토그래피
TLC black ink.jpg
TLC 플레이트의 검정 잉크 분리
약어TLC
분류크로마토그래피
기타 기법
관련
3가지 표준(티로신, 글리신, 메티오닌)과 샘플(메티오닌 & 글리신)의 TLC
자외선(UV) 조명 아래 형광 TLC 플레이트

박층 크로마토그래피(TLC)는 비휘발성 혼합물을 분리하는 데 사용되는 크로마토그래피 기법이다.[1]박층 크로마토그래피는 유리, 플라스틱, 알루미늄 호일 등의 불활성 기질 시트에서 수행되며, 흡착물질(보통 실리카겔, 산화알루미나) 또는 셀룰로오스(셀룰로오스)의 얇은 층으로 코팅되어 있다.이 흡착제의 층은 정지 단계로 알려져 있다.

시료를 플레이트에 도포한 후 모세관 작용을 통해 용제 또는 용제 혼합물(이동상이라고도 함)을 끌어 올린다.다른 분석 물질들이 다른 속도로 TLC 플레이트를 상승시키기 때문에, 분리가 달성된다.[2]이동 단계는 정지 단계와 다른 특성을 가진다.예를 들어 극성 물질인 실리카겔과 함께 헵탄과 같은 비극성 이동 단계가 사용된다.이동 단계는 화학자가 이동 단계의 대량 특성을 미세 조정할 수 있도록 혼합된 것일 수 있다.

실험 후, 점들이 시각화된다.종종 이것은 시트에 자외선을 투사하는 것만으로 간단히 이루어질 수 있다; 시트는 인광으로 처리되는 경우가 많고, 시트에 어두운 점이 나타나는데, 시트는 화합물이 특정 부위에 충격을 주는 빛을 흡수한다.화학적 과정은 점들을 시각화하는 데 사용될 수도 있다; 예를 들어, 아니스알데히드는 많은 화합물을 가진 색상의 유도체를 형성하고, 황산은 대부분의 유기 화합물을 태워 시트에 어두운 점을 남긴다.

그 결과를 정량화하기 위해 고려되는 물질에 의한 이동 거리는 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 이동상 총 거리로 나누어 이 비율을 지체인자(Rf), 또는 때로는 유지인자로 구어적으로 부른다.결과가 정량적이 되려면 이동 단계가 정지 단계의 끝에 도달하기 전에 용매 흡수를 중단해야 한다.일반적으로 정지상 구조와 유사한 물질은f R이 낮은 반면 이동상 구조와 유사한 물질은 지연인자가 높은 것이 특징이다.지연 요인은 특성이 있지만 이동 및 정지 단계의 정확한 상태에 따라 변경된다.이러한 이유로 화학자들은 일반적으로 알려진 화합물의 샘플을 알려지지 않은 샘플과 함께 시트에 적용한다.

박층 크로마토그래피는 반응의 진행 상황을 모니터링하고, 주어진 혼합물에 존재하는 화합물을 식별하며, 물질의 순도를 결정하는 데 사용될 수 있다.이러한 애플리케이션의 구체적인 예로는 세라마이드와 지방산 분석, 식품과 물에서 농약이나 살충제의 검출, 법의학에서 섬유질의 염료 성분 분석, 방사선 의약물의 방사성 화학적 순도 분석, 또는 약용 식물과 그 성분 확인 등이 있다.

다양한 단계를 자동화하고, TLC로 달성한 분해능을 높이고, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 하기 위해 원래의 방법에는 많은 개선이 이루어질 수 있다.이 방법을 HPTLC, 즉 "고성능 TLC"라고 하는데, HPTLC는 일반적으로 고정 위상의 얇은 층과 더 작은 샘플 볼륨을 사용하므로 확산에 따른 분해능 손실을 감소시킨다.

플레이트 준비

TLC 플레이트는 일반적으로 상업적으로 사용할 수 있으며, 표준 입자 크기 범위를 사용하여 재현성을 개선한다.실리카겔 등 흡착제를 황산칼슘(흡수액)과 물 등 소량의 불활성 바인더와 섞어 준비한다.이 혼합물은 보통 유리, 두꺼운 알루미늄 호일 또는 플라스틱과 같은 비활성 캐리어 시트에 두꺼운 슬러리로 퍼진다.결과판은 건조되어 오븐에서 110°C에서 30분간 가열하여 작동한다.흡수성 층의 두께는 일반적으로 분석 목적의 경우 0.1–0.25 mm, 준비성 TLC의 경우 0.5–2.0 mm이다.[4]

테크닉

이 과정은 더 빠른 주행, 더 나은 분리, 서로 다른 정지 단계 사이의 선택이라는 장점을 가진 종이 크로마토그래피와 유사하다.TLC는 단순성과 속도 때문에 화학반응을 모니터링하고 반응제품의 질적 분석에 자주 사용된다.플레이트는 프로세스를 방해하거나 반응하지 않는 연필이나 기타 도구를 사용하여 크로마토그래피 공정 전후에 라벨을 붙일 수 있다.

박층 크로마토그래피 플레이트를 실행하려면 다음 절차를 수행한다.[5]

  • 모세관(모세관)을 이용해 하단 가장자리로부터 약 1.5cm 떨어진 플레이트에 시료를 함유한 용액의 작은 부분을 도포한다.용제는 다음 단계에서 샘플의 이동 단계와의 상호작용을 방해하지 않도록 완전히 증발할 수 있다.비휘발성 용제를 사용하여 샘플을 도포한 경우, 플레이트를 진공 챔버에서 건조시켜야 한다.이 단계는 종종 플레이트의 출발 지점에 가시적인 결과를 얻을 수 있는 충분한 분석물이 있는지 확인하기 위해 반복된다.다른 표본들은 아래쪽 가장자리로부터 같은 거리에 있는 점들의 줄에 놓일 수 있으며, 각 표본들은 출발점에서부터 자신의 인접 차선으로 이동한다.
  • 유리 비커나 기타 적절한 투명 용기(분리실)에 소량의 적절한 용매(용융제)를 1센티미터 미만의 깊이까지 붓는다.여과지 한 장(일명 "윅"이라 함)을 챔버에 넣어 바닥이 용제에 닿도록 하고 용지는 챔버 벽면에 놓여 용기 상단까지 닿게 한다.용기는 덮개 유리나 다른 뚜껑으로 닫혀 용제 증기가 여과지를 상승시켜 챔버의 공기를 포화시킬 수 있도록 몇 분간 방치한다.(챔버를 포화시키지 못하면 분리가 불량하고 재생산 불가능한 결과가 초래된다.)
  • 그런 다음 TLC 플레이트를 챔버에 배치하여 샘플의 점이 챔버의 용출액 표면에 닿지 않도록 하고 뚜껑을 닫는다.용제는 모세관 작용에 의해 플레이트를 위로 이동시키고, 샘플 혼합물을 만나 플레이트 위로 운반한다(시료에 용해된다).플레이트는 용제 전선이 정지 단계의 상단에 도달하기 전에 챔버에서 제거하고 건조시켜야 한다(용출이 계속되면 잘못된 결과를 초래할 수 있음).
  • 지체 없이, 용제 전면, 즉 판에 용제의 가장 먼 범위가 표시된다.
  • 판이 시각화되다.일부 판은 황화아연과 같은 인광으로 미리 코팅되어 있어 자외선을 이용해 많은 화합물을 시각화할 수 있으며, 그 화합물이 판에 부딪히는 것을 막는 어두운 반점이 나타난다.또는 용출 후 플레이트를 분사하거나 화학물질에 담글 수 있다.다양한 시각화 작용제는 눈에 보이는 결과를 내기 위해 점들과 반응한다.

분리과정과 원칙

표본 혼합물의 서로 다른 화합물은 고정 위상에 대한 유인력의 차이와 용매의 용해성의 차이로 인해 서로 다른 속도로 이동한다.[6]용제를 변경하거나 혼합물을 사용하여 성분 분리(Rf 값으로 측정)를 조정할 수 있다.또한 TLC 판으로 얻어진 분리를 이용하여 플래시 크로마토그래피 기둥의 분리를 추정할 수 있다.(채취된 용제의 양이 1/R일f 때 열에서 화합물이 용출된다.)[7]화학자들은 크로마토그래피에 의한 분리를 위한 프로토콜을 개발하기 위해 TLC를 사용하고 원하는 화합물을 포함하는 분수를 결정하기 위해 TLC를 사용한다.

TLC 플레이트 개발.보라색 점은 빨간색과 파란색으로 구분된다.

화합물의 분리는 정지 단계에서의 결합 사이트를 위한 솔루트와 이동 단계의 경쟁에 근거한다.[3]예를 들어 정상상 실리카겔을 정지상(stating phase)으로 사용할 경우 극성으로 간주할 수 있다.극성이 다른 두 화합물을 고려할 때, 극성 화합물은 실리카와 더 강한 상호작용을 가지며, 따라서 이용 가능한 결합 부위에서 이동 단계를 더 잘 대체할 수 있다.결과적으로 극성 화합물이 플레이트 위로 더 높게 이동한다(결과f R 값이 더 높아짐).[6]이동상을 보다 극성 용매나 용매의 혼합으로 바꾸면 극판과의 결합에 더 능숙해져 TLC판의 모든 화합물이 판 위로 더 높게 이동하게 된다.흔히 "강력한" 용제(용제)는 분석된 화합물을 플레이트 위로 밀어 올리는 반면, "약한" 용제들은 그것들을 거의 움직이지 않는다고 한다.강도/취약성 순서는 TLC 플레이트의 코팅(스테이션 위상)에 따라 달라진다.For silica gel-coated TLC plates, the eluent strength increases in the following order: perfluoroalkane (weakest), hexane, pentane, carbon tetrachloride, benzene/toluene, dichloromethane, diethyl ether, ethyl acetate, acetonitrile, acetone, 2-propanol/n-butanol, water, methanol, triethylamine, acetic acid, formic acid (strongest).C18 코팅 플레이트의 경우 순서는 역순이다.즉 정지상이 극이고 이동상이 비극일 때 방법은 역상과는 반대로 정상상이다.이는 이동상 에틸 아세테이트와 헥산느를 혼합하여 사용하면 에틸 아세테이트를 더 많이 첨가하면 TLC 플레이트의 모든 화합물에 대한 R 값이f 더 높아진다는 것을 의미한다.이동 단계의 극성을 변경해도 일반적으로 TLC 플레이트의 화합물 작동 순서가 역전되지 않는다.등방성 시리즈는 모바일 위상 선택 시 가이드로 사용할 수 있다.화합물의 역주행을 원하는 경우 C18 기능 실리카와 같은 단극 정지 단계를 사용해야 한다.

분석

분리되는 화학 물질은 무색일 수 있으므로 점들을 시각화하는 몇 가지 방법이 존재한다.

  • 키니네와 같은 형광 분석 물질은 블랙라이트(366nm)에서 검출될 수 있다.
  • 대개 망간 활성 아연 규산염인 소량의 형광 화합물이 UV-C 조명(254nm) 아래에서 점의 시각화를 허용하는 흡착제에 첨가되는 경우가 많다.따라서 흡착층은 그 자체로 연녹색을 발현하지만 분석 물질의 점들은 이 형광을 해소할 것이다.
  • 요오드 증기는 일반적인 불특정 색상 시약이다.
  • TLC 플레이트를 담그거나 플레이트에 분사하는 특정 색상 시약이 존재한다.[8][9][10]

일단 눈에 보이면, 각 지점의f R 값 또는 지연 계수는 제품이 이동한 거리를 초기 스폿팅 사이트를 기준으로 하여 용제 전선이 이동한 거리로 나누어 결정할 수 있다.이러한 값은 사용된 용매와 TLC 플레이트의 유형에 따라 달라지며 물리적 상수가 아니다.

적용들

특성화

유기화학에서는 TLC로 질적으로 반응을 관찰한다.모세관(모세관)으로 시료 채취한 반점이 플레이트 위에 놓여 있다. 시작 재료의 반점, 반응 혼합물에서 나온 반점, 둘 다와 교차 반점이다.작은 (3 X 7 cm) TLC 플레이트는 작동하는데 몇 분이 걸린다.이 분석은 질적 분석이며, 시작 재료가 사라졌는지 여부, 즉 반응이 완료되었는지 여부, 제품이 나타났는지 여부, 그리고 얼마나 많은 제품이 생성되었는지를 보여준다(공해로 인해 과소평가될 수 있지만).불행히도, 저온 반응으로 인한 TLC는 잘못된 결과를 초래할 수 있다. 왜냐하면 모세관의 실온으로 샘플을 데워서 반응을 바꿀 수 있기 때문이다. TLC에 의해 분석된 데워진 샘플은 저온 플라스크에 있는 것과 같지 않다.그러한 반응 중 하나는 에스터가 알데히드로 감소하는 DIBALH이다.

한 연구에서 TLC는 유기 반응의 선별에 적용되었으며, 예를 들어 2-나프톨에서 BINAP 합성의 미세 조정에도 적용되었다.[11]이 방법에서는 알코올과 촉매 용액(예를 들어 철(III) 염화물)을 따로 기준선에 놓고 반응한 다음 즉시 분석한다.

Radioolabelle 화합물의 특성화에 TLC를 특별히 적용하여 방사화학 순도를 결정하는 데 사용한다.TLC 시트는 사진 필름 시트 또는 방사능 측정 가능 기구를 사용하여 시각화한다.다른 방법을 사용하여 시각화할 수도 있다.이 방법은 다른 방법들보다 훨씬 더 민감하며, 방사능 원자를 운반할 경우 극히 적은 양의 화합물을 검출하는 데 사용될 수 있다.

격리

정지 단계에서 다른 화합물이 다른 거리를 이동하기 때문에 크로마토그래피를 사용하여 추가 분석을 위해 혼합물의 성분을 분리할 수 있다.분리된 화합물은 각각 플레이트의 특정 영역을 점유하며 스크래핑하여(정지된 위상 입자와 함께) 적절한 용매로 용해될 수 있다.예를 들어, 7단계 개발에서 나타난 녹색 식물 재료 추출물(예: 시금치)의 크로마토그래피에서 카로틴은 빨리 용출되어 2단계까지만 볼 수 있다.엽록소 A와 B는 마지막 단계의 중간이고 첫 번째 화합물은 노란색으로 얼룩져 있다.크로마토그래피가 끝나면 카로틴을 판에서 제거하고 용매에 추출해 분광도계에 넣어 스펙트럼을 결정할 수 있다.추출한 수량은 적고 컬럼 크로마토그래피와 같은 기법은 큰 양을 분리하는 것이 바람직하다.그러나 두꺼운 실리카겔 코팅을 한 대형 준비 TLC 플레이트를 사용해 100mg 이상의 재료를 분리할 수 있다.

  • 1단계

  • 2단계

  • 3단계

  • 4단계

  • 5단계

  • 6단계

  • 7단계

반응 및 복합 안정성 검사

TLC는 화학 반응의 완성을 확인하는 데도 사용된다.이를 판단하기 위해 반작용의 시작 부분에서 전체 지점이 플레이트의 시작 화학 물질 또는 물질에 의해 점유되는 것을 관찰한다.반응이 일어나기 시작하면 초기 화학 물질에 의해 형성된 부분이 줄어들기 시작하고 결국 시작 화학 물질의 전체 부분을 플레이트에 있는 새로운 제품으로 대체한다.완전히 새로운 지점의 형성이 반응의 완성을 결정한다.[12]

나아가 2차원 TLC는 정지상(보통 약간 산성인 실리카겔 등)에서 화합물이 안정적인지 확인하는 방법으로 자주 사용된다.이를 위해 시험한 복합 혼합물을 사각형 모양의 TLC 플레이트에서 두 번 용출한 다음 한 방향으로 90º 회전시킨다.정사각형의 대각선에 표적 화합물이 나타나면 실리카겔이 안정적이고 정화에도 안전하다.대각선 아래에 나타나면 실리카겔로 분해하는 것이다.이럴 경우 중화 실리카겔(예: 트리에틸아민 포함)이나 중성 알루미나 같은 대체 정지 단계를 사용해 정화를 시도할 수 있다.[13]

참고 항목

참조

  1. ^ Harry W. Lewis & Christopher J. Moody (13 Jun 1989). Experimental Organic Chemistry: Principles and Practice (Illustrated ed.). WileyBlackwell. pp. 159–173. ISBN 978-0-632-02017-1.
  2. ^ A.I. Vogel; A.R. Tatchell; B.S. Furnis; A.J. Hannaford & P.W.G. Smith (1989). Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (5th ed.). ISBN 978-0-582-46236-6.
  3. ^ a b Reich, E.; Schibli A. (2007). High-performance thin-layer chromatography for the analysis of medicinal plants (Illustrated ed.). New York: Thieme. ISBN 978-3-13-141601-8.
  4. ^ 상용 일반 및 예비용 박층 크로마토그래피 판의 두께 값을 나타낸 표
  5. ^ 박층 크로마토그래피:방법 http://www.reachdevices.com/TLC.html
  6. ^ a b 박층 크로마토그래피(TLC): 애니메이션을 이용한 원리
  7. ^ Fair, J. D.; Kormos, C. M. J. Chromatogr. A 2008, 1211(1–2), 49–54.(doi:10.1016/j.10a.28.09.085)
  8. ^ 박층 크로마토그래피 얼룩 http://www.reachdevices.com/TLC_stains.html
  9. ^ Jork, H, Funk, W, Fischer, W, Wimmer, H. (1990):박층 크로마토그래피: 시약 및 검출 방법, 제1a권, VCH, 와인하임, ISBN 3-527-27834
  10. ^ Jork, H, Funk, W, Fischer, W, Wimmer, H. (1994):박층 크로마토그래피: 시약 및 검출 방법, 1b, VCH, Weinheim
  11. ^ TLC 플레이트는 용매 없는 반응을 위한 편리한 플랫폼으로 조나단 M.스토다드, 롄 응우옌, 헥터 마타 차베스, 켈리 응우옌 화학. 2007년, 1240–1241년, doi:10.1039/b616311d
  12. ^ "Applications of Thin Layer Chromatography". News-Medical.net. 2018-09-18. Retrieved 2018-09-25.
  13. ^ "Thin Layer Chromatography: A Complete Guide to TLC". Chemistry Hall. 2020-01-02. Retrieved 2020-01-30.

참고 문헌 목록

  • F. 가이스(1987년):박층 크로마토그래피 평면 크로마토그래피 기초, 하이델베르크, 휴틱, ISBN 3-7785-0854-7
  • 저스투스 G. 키르치너(1978년):박층 크로마토그래피, 제2판, 와일리
  • 조셉 쉐르마, 버나드 프리드(1991):박층 크로마토그래피 안내서(= 크로마토그래픽 과학).Bd. 55).뉴욕주, 마르셀 드커 ISBN 0-8247-8335-2
  • Elke Han-Deinstorp: 적용 박층 크로마토그래피. 모범 사례 및 실수 방지.Wiley-VCH, Weinheim u. 2000년 ISBN 3-527-29839-8