세포무단백질합성

Cell-free protein synthesis

체외 단백질 합성 또는 CFPS라고도 알려진 세포 없는 단백질 합성은 세포가 없는 시스템에서 생물학적 기계를 이용하여 단백질을 생산하는 것으로, 즉 살아있는 세포를 사용하지 않는 것이다.시험관내 단백질 합성 환경은 세포의 생존성을 유지하는 데 필요한 세포벽이나 지근거리 상태에 의해 제한되지 않는다.[1]따라서 CFPS는 막단백질의 공동번역 용해화, 단백질 생산의 최적화, 비천연 아미노산 통합, 선택적 및 현장 고유 라벨링을 포함한 많은 응용 분야에 유리한 번역 환경의 직접 접근 및 제어를 가능하게 한다.[2][3]시스템의 개방성 때문에 pH, redox probleds, 온도, chaperones 등 다양한 표현 조건을 선별할 수 있다.세포 생존력을 유지할 필요가 없기 때문에 독성 단백질이 생성될 수 있다.null

소개

세포가 없는 반응의 일반적인 구성 요소로는 세포 추출물, 에너지 공급원, 아미노산 공급원, 마그네슘과 같은 공작용제, 원하는 유전자를 가진 DNA 등이 있다.세포 추출물은 관심 세포의 라이스를 제거하고 세포벽, DNA 게놈, 그리고 다른 파편들을 원심분리하여 얻는다.잔해들은 리보솜, 아미노실-tRNA 합성, 번역 개시 및 신장 계수, 핵 등을 포함한 필요한 세포 기계들이다.null

CFPS에는 플라스미드와 선형 표현 템플릿(LETs)의 두 가지 유형의 DNA가 사용될 수 있다.플라스미드는 원형이며, 오직 세포 안에서만 만들어진다.LETs는 인큐베이터에서 세포를 키우는 것보다 훨씬 더 빨리 DNA를 복제하는 PCR을 통해 훨씬 더 효과적으로 만들어질 수 있다.LETs는 만들기 쉽고 빠를수록, 플라스미드 수율은 보통 CFPS에서 훨씬 더 높다.이 때문에 오늘날 많은 연구가 플라스미드로 CFPS의 수율에 접근하기 위해 CFPS LET 수율을 최적화하는 데 초점을 맞추고 있다.null

에너지원은 세포가 없는 반응의 중요한 부분이다.보통 필요한 에너지원을 포함한 별도의 혼합물을 아미노산 공급과 함께 추출물에 첨가하여 반응을 일으킨다.일반적인 공급원은 인산염, 아세틸 인산염, 크레아틴 인산염이다.null

장점과 응용 프로그램

CFPS는 기존의 단백질 체내 합성보다 많은 장점을 가지고 있다.가장 주목할 만한 것은 추출물 제제를 포함한 세포 없는 반응은 보통 1~2일이 걸리는 반면 체내 단백질 표현은 1~2주가 걸릴 수 있다.[4][5][6][7]null

CFPS는 개방적인 반응이다.세포벽이 없기 때문에 화학적 환경을 직접 조작할 수 있다.샘플을 쉽게 채취하고 농도를 최적화하며 반응을 모니터링할 수 있다.대조적으로 일단 살아있는 세포에 DNA가 삽입되면, 그 반응이 끝나 세포가 라이스 될 때까지 접근할 수 없다.null

CFPS의 또 다른 장점은 독성에 대한 우려 부족이다.원하는 단백질과 라벨이 부착된 단백질은 합성 시 세포에 독성이 있다.[8]살아있는 세포가 사용되지 않기 때문에 제품 단백질의 독성은 큰 문제가 되지 않는다.null

이러한 장점들은 수많은 응용 프로그램을 가능하게 한다.[9][1]CFPS의 주요 적용 분야는 부자연스러운 아미노산을 단백질 구조에 통합하는 것이다(확장 유전코드 참조).반응의 개방성은 그러한 반응에 필요한 변형된 tRNA와 부자연스러운 아미노산을 삽입하는 데 이상적이다.null

합성생물학은 다른 많은 용도를 가지고 있으며 단백질 진화, 나노마차인, 핵산 회로, 백신과 약물 치료를 위한 바이러스 같은 입자 합성과 같은 분야에서 밝은 미래다.[10][11][12]null

제한 사항

CFPS와 관련된 한 가지 난제는 세포 추출물의 내생 핵에 의한 DNA의 저하다.이것은 특히 LETs에게 문제가 있다.세포는 DNA 가닥의 무작위 부위를 공격하는 엔도뉴클레아제를 가지고 있지만, 훨씬 더 흔한 것은 끝에서 DNA를 공격하는 엑도뉴클레아제들이다.플라스미드는 원형이고 외부핵이 부착될 수 있는 끝이 없기 때문에 후자의 영향을 받지 않는다.그러나 LETs는 두 가지 모두에 취약하다.LET 취약성 때문에 오늘날 많은 연구가 플라스미드를 이용한 CFPS의 수율에 접근하기 위해 CFPS LET 수율을 최적화하는 데 초점을 맞추고 있다.null

플라스미드를 이용한 이 개선된 보호의 한 예는 박테리오파지 람다 감 단백질의 사용이다.[13]감은 대장균(E. coliechia)에서 발견되는 엑소뉴클레아인 RecBCD의 억제제다.[14]겜을 사용하면서 LETs를 사용한 CFPS 수율이 크게 증가했고, 플라스미드를 사용한 CFPS 수율에 필적했다.[15]PURE 추출물도 만들 수 있어 외부 핵물질에 대한 우려를 없앨 수 있다.이러한 추출물은 만드는 데 비용이 많이 들고 현재 외생적인 DNA 저하 문제에 대한 경제적인 해결책이 아니다.null

셀프리 시스템 유형

오늘날 사용되고 있는 공통 세포 추출물은 대장균(ECE), 토끼 망막세포(RRL), 밀 배아(WGE), 곤충 세포(ICE), 효모 클루이버로미세스(D2P 시스템)로 만들어진다.[1][5]이 모든 추출물은 상업적으로 구할 수 있다.null

ECE는 몇 가지 이유로 가장 인기 있는 리사이트다.그것은 가장 값싼 추출물이고 창조하기에 가장 적은 시간 집약적이다.또 대장균의 다량 재배가 용이하고, 그 다음 균질화제나 소닉화기를 사용함으로써 쉽게 침이 고인다.[1]ECE는 또한 가장 높은 단백질 수율을 제공한다.그러나, 높은 수율 생산은 특히 변환 후 수정에서 합성된 단백질의 복잡성을 제한할 수 있다.그런 점에서, 추출물에서 수정 효소 시스템을 유지했다면, 효율이 낮은 진핵 계통이 유리할 수 있다.null

진핵 계통마다 장단점이 있다.예를 들어, WGE 추출물은 세 가지 진핵 추출물 중 가장 높은 수율을 생산하지만, 글리코실화 같은 일부 변환 후 수정에는 효과적이지 않다.[5]추출물을 선택할 때는 변환 후 수정의 유형, 원하는 수율 및 비용을 고려해야 한다.null

역사

세포 없는 단백질 합성은 60년 이상 사용되어 왔으며, 특히 코돈의 첫 번째 용해법은 1961년 마샬 니렌버그와 하인리히 마태이에 의해 국립보건원에서 이루어졌다.[1][16]그들은 세포가 없는 시스템을 사용하여 폴리-우라실 RNA 염기서열(또는 UUUUU...)을 생화학적 용어로 번역한 결과 합성된 폴리펩타이드 성분이 아미노산 페닐알라닌으로만 구성되어 있다는 것을 밝혀냈다.따라서 그들은 이 폴리페닐알라닌에서 코돈 UUU가 아미노산 페닐알라닌을 명시했다고 추론했다.이 작업을 연장하면서 니렌버그와 그의 동료들은 각 코돈의 뉴클레오티드 구성을 결정할 수 있었다.null

참고 항목

참조

  1. ^ a b c d e Gregorio, Nicole E.; Levine, Max Z.; Oza, Javin P. (2019). "A User's Guide to Cell-Free Protein Synthesis". Methods and Protocols. 2 (1): 24. doi:10.3390/mps2010024. PMC 6481089. PMID 31164605.
  2. ^ Roos, C; Kai, L; Haberstock, S; Proverbio, D; Ghoshdastider, U; Ma, Y; Filipek, S; Wang, X; Dötsch, V; Bernhard, F (2014). "High-Level Cell-Free Production of Membrane Proteins with Nanodiscs". Cell-Free Protein Synthesis. Methods in Molecular Biology. Vol. 1118. pp. 109–30. doi:10.1007/978-1-62703-782-2_7. ISBN 978-1-62703-781-5. PMID 24395412.
  3. ^ Roos, C; Kai, L; Proverbio, D; Ghoshdastider, U; Filipek, S; Dötsch, V; Bernhard, F (2013). "Co-translational association of cell-free expressed membrane proteins with supplied lipid bilayers". Molecular Membrane Biology. 30 (1): 75–89. doi:10.3109/09687688.2012.693212. PMID 22716775. S2CID 207503256.
  4. ^ Ma Y, Ghoshdastider U, Wang J, Ye W, Dötsch V, Filipek S, Bernhard F, Wang X (2012). "Cell-free expression of human glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase (HsGNA1) for inhibitor screening". Protein Expr. Purif. 86 (2): 120–6. doi:10.1016/j.pep.2012.09.011. PMID 23036358.
  5. ^ a b c Carlson ED, Gan R, Hodgman CE, Jewett MC (2012). "Cell-free protein synthesis: applications come of age". Biotechnol. Adv. 30 (5): 1185–94. doi:10.1016/j.biotechadv.2011.09.016. PMC 4038126. PMID 22008973.
  6. ^ Levine, Max Z.; Gregorio, Nicole E.; Jewett, Michael C.; Watts, Katharine R.; Oza, Javin P. (2019-02-25). "Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology". Journal of Visualized Experiments (144): e58882. doi:10.3791/58882. ISSN 1940-087X. PMID 30855561.
  7. ^ Williams, Layne C.; Gregorio, Nicole E.; So, Byungcheol; Kao, Wesley Y.; Kiste, Alan L.; Patel, Pratish A.; Watts, Katharine R.; Oza, Javin P. (2020). "The Genetic Code Kit: An Open-Source Cell-Free Platform for Biochemical and Biotechnology Education". Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8: 941. doi:10.3389/fbioe.2020.00941. PMC 7466673. PMID 32974303.
  8. ^ Jackson AM (2004). "Cell-free protein synthesis for proteomics". Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 2 (4): 308–319. doi:10.1093/bfgp/2.4.308. ISSN 1473-9550. PMID 15163366.
  9. ^ https://cellfreesystems.org/
  10. ^ Bundy, Bradley C.; Franciszkowicz, Marc J.; Swartz, James R. (2008). "Escherichia coli-based cell-free synthesis of virus-like particles". Biotechnology and Bioengineering. 100 (1): 28–37. doi:10.1002/bit.21716. PMID 18023052. S2CID 11657929.
  11. ^ Patriarchi T, Shen A, He W, Baikoghli M, Cheng RH, Xiang YK, Coleman MA, Tian L (2018). "Nanodelivery of a functional membrane receptor to manipulate cellular phenotype". Sci. Rep. 8 (1): 3556. Bibcode:2018NatSR...8.3556P. doi:10.1038/s41598-018-21863-3. PMC 5824837. PMID 29476125.
  12. ^ Tinafar, Aidan; Jaenes, Katariina; Pardee, Keith (8 August 2019). "Synthetic Biology Goes Cell-Free". BMC Biology. 17 (1): 64. doi:10.1186/s12915-019-0685-x. PMC 6688370. PMID 31395057.
  13. ^ "gam - Host-nuclease inhibitor protein gam - Escherichia phage lambda - gam gene & protein". www.uniprot.org. Retrieved 2017-10-20.
  14. ^ Murphy, Kenan C. (2007). "The λ Gam Protein Inhibits RecBCD Binding to dsDNA Ends". Journal of Molecular Biology. 371 (1): 19–24. doi:10.1016/j.jmb.2007.05.085. PMID 17583735.
  15. ^ Sitaraman, Kalavathy; Esposito, Dominic; Klarmann, George; Grice, Stuart F Le; Hartley, James L; Chatterjee, Deb K (2004). "A novel cell-free protein synthesis system". Journal of Biotechnology. 110 (3): 257–263. doi:10.1016/j.jbiotec.2004.02.014. PMID 15163516.
  16. ^ Nirenberg, M. W.; Matthaei, J. H. (1961). "The Dependence of Cell- Free Protein Synthesis in E. Coli Upon Naturally Occurring or Synthetic Polyribonucleotides". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (10): 1588–1602. Bibcode:1961PNAS...47.1588N. doi:10.1073/pnas.47.10.1588. PMC 223178. PMID 14479932.

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