중합효소 연쇄반응 최적화

Polymerase chain reaction optimization

중합효소 연쇄반응(PCR)은 DNA를 증폭시키는 분자생물학 도구로 분자생물학자들이 PCR 성능을 향상시키고 실패를 최소화하기 위해 개발한 PCR 최적화를 위한 다양한 기법이다.

오염 및 PCR

PCR 방법은 매우 민감해서, 몇 가지 순서에 걸친 증폭을 위해 단 한 번의 반응으로 몇 개의 DNA 분자만 필요로 한다.따라서 실험실 환경에 존재하는 DNA(박테리아, 바이러스 또는 인적 자원)로 인한 오염을 방지하기 위한 적절한 조치가 필요하다.이전 PCR 증폭에서 나온 제품들이 공통적인 오염원이기 때문에, 많은 분자생물학 실험실은 연구실을 별도의 영역으로 나누는 것을 포함하는 절차를 시행해 왔다.[1]한 실험실은 PCR 전 시약의 준비 및 취급과 PCR 반응의 설정, 젤 전기영양 또는 PCR 제품 정화 등 PCR 후 처리를 위한 다른 영역을 전담한다.PCR 반응 설정을 위해 많은 표준 운영 절차에는 필터 팁이 있는 피펫을 사용하고 신선한 실험실 장갑을 착용하며, 어떤 경우에는 UV 램프가 있는 층류 플로우 캐비닛을 작업 스테이션으로 사용하는 것이 포함된다(외부적합성을 파괴하기 위해).PCR은 실험용 PCR과 동일하게 설정되지만 템플릿 DNA가 없는 음성 대조군 반응에 대해 정기적으로 평가되며 실험용 PCR과 함께 수행된다.

헤어핀스

DNA의 이차 구조는 DNA 템플릿이나 프라이머를 접거나 매듭짓게 하여 제품 수율을 낮추거나 반응의 실패를 초래할 수 있다.헤어핀은 단일 가닥의 DNA 내에서 역반복 반복에서 뉴클레오티드 사이의 염기쌍화에 의해 야기되는 내부 접힘으로 구성되며, 일반적인 2차 구조로 PCR이 실패할 수 있다.

일반적으로 프라이머의 잠재적 2차 구조를 확인하거나, DNA 템플릿의 2차 구조를 최소화하기 위해 DMSO 또는 글리세롤을 PCR에 추가하는 프라이머 설계는 DNA 헤어핀이 의심되어 고장 이력이 있는 PCR의 최적화에 사용된다.[2]

중합효소 오류

Taq 중합효소는 3㎛에서 5㎛ 엑소누클레이저 활성도가 부족하다.따라서 Taq는 오류 방지 읽기 활동이 없으며, 이는 보완적 DNA 가닥의 반대편 베이스와 일치하지 않는 초점(즉, 확장된) DNA 가닥으로부터 새로 잘못 결합된 뉴클레오티드 베이스의 절연으로 구성된다.Taq 효소의 3 proof~5′ 교정이 부족하면 오류율(주기당 뉴클레오티드당 교정치수)이 약 1 1에 이르며 이는 PCR의 충실도에 영향을 미치며, 특히 시동물질의 양이 적은 PCR 초기에 오류가 발생하여 진부한 DNA가 상당부분 축적되는 현상을 초래한다.최종 제품에서 t 시퀀스.[3]

3′에서 5′까지 엑소누클레이저 활동을 설계한 몇몇 "고신뢰성" DNA 중합체는 제품의 염기서열이나 복제를 위해 PCR에 사용하기 위해 더 정확한 증폭을 가능하게 하는 사용이 가능하게 되었다.3′5′핵산 말단 가수 분해 효소 활동과 polymerases는 그 기초의 예로는:Thermococcus litoralis에서 추출한 것은 Pyrococcus furiosus에서 추출한 KOD DNA중합 효소, Thermococcus kodakaraensis KOD1의 재조합형이고 애꿎은,;Pfu DNA중합 효소,;Pwo는 Pyrococcus woesii에서 추출한;[4] 위하여 중합 효소, 280x 더 높은 성의 있는 그룹이 포함된다.lTaq와 비교했을 때 ity 증폭.[5]

마그네슘 농도

마그네슘은 온도 조절이 가능한 DNA 중합효소를 위한 공동 인자로서 필요하다.타크 중합효소는 마그네슘에 의존하는 효소로, 사용하기에 최적의 농도를 결정하는 것이 PCR 반응의 성공에 매우 중요하다.[6]템플릿 농도, dNTPs, 그리고 킬레이트화제(EDTA)나 단백질의 존재와 같은 반응 혼합물의 일부 성분은 존재하는 자유 마그네슘의 양을 감소시켜 효소의 활동을 감소시킬 수 있다.[7]잘못된 템플릿 부지에 바인딩되는 프라이머는 과도한 마그네슘 농도가 존재할 때 안정화되므로 반응의 특수성이 감소한다.과도한 마그네슘 농도는 또한 이중 좌초 DNA를 안정시키고 PCR 동안 제품 수율을 감소시키는 DNA의 완전한 변성을 방지한다.[6][7]MgCl의2 불충분한 해빙은 DNA 중합효소와 함께 공급된 염화 마그네슘 용액 내에 농도 구배 형성을 야기할 수 있으며 또한 많은 실패 실험에 기여한다.[7]

크기 및 기타 제한 사항

PCR은 최대 2~3천 개의 염기쌍의 DNA 템플릿으로 쉽게 작동한다.그러나 이 크기 이상에서는 중합효소에 의한 조기종료와 같은 길이 확률적 효과가 증가함에 따라 PCR의 효율성에 영향을 미치기 시작하므로 제품 수율이 감소하는 경우가 많다.가열 주기가 느리고 특수 중합체가 발생하여 최대 5만 개의 염기쌍의 큰 조각을 증폭시킬 수 있다.이것들은 DNA 결합 단백질과 결합하여 DNA에 대한 중합효소의 접착력을 강화한다.[8][9]

치메릭 폴리머아제 TopoTaq 및 PfuC2의 다른 중요한 특성에는 향상된 온도조절성, 특수성 및 오염물질 및 억제제가 포함된다.[10][11]이들은 초열성 메타노피루스 칸들리(Methanophyrs Kandleri)로부터 토포아세머레이스 V의[12] 고유한 나선-헤어핀-헬릭스(HHHH) DNA 결합 영역을 사용하여 설계되었다.치메릭 폴리머아제는 토종 효소의 많은 한계를 극복하고 세포 배양액과 심지어 음식 샘플로부터 직접 PCR 증폭에 사용되어 힘겨운 DNA 격리 단계를 우회한다.하이브리드 TopoTaq 폴리머아제(TopoTaq polymerase)의 강력한 스트랜드 변위 활성은 헤어핀과 G가 탑재된 이중 나선으로 인해 발생할 수 있는 PCR 문제를 해결하는 데 도움이 된다.G-C 함량이 높은 헬리케인은 용해 온도가 높아 조건에 따라 PCR을 손상시키는 경우가 많다.[13]

비특정 프라이밍

프라이머의 비특정 결합은 자주 발생하며 몇 가지 이유로 발생할 수 있다.여기에는 DNA 템플릿의 반복 시퀀스, 프라이머와 템플릿 사이의 비특정 결합, 템플릿의 G-C 함량이 높거나 낮거나 불완전한 프라이머 바인딩, 프라이머의 5' 끝부분이 템플릿에 연결되지 않은 채로 남아 있다.퇴행성 영장류의 비특정 구속도 일반적이다.어닐링 온도와 마그네슘 이온 농도의 조작은 특수성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.예를 들어, 낮은 농도의 마그네슘이나 다른 양이온들은 비특정 프라이머 상호작용을 방지하여 성공적인 PCR을 가능하게 할 수 있다.첫 번째 주기의 변성 단계 동안 고온(예: 90–98˚C)으로 가열되지 않는 한 활동이 차단되는 "핫 스타트" 중합효소 효소는 낮은 온도에서 반응 준비 시 비특이적인 프라이밍을 방지하기 위해 일반적으로 사용된다.화학 매개 핫 스타트 PCR은 항체 또는 압타머 기반 핫 스타트 PCR에 비해 중합효소 활성화를 위해 더 높은 온도와 긴 잠복기를 필요로 한다.[citation needed]

특수성을 높이기 위한 다른 방법으로는 중첩된 PCR과 터치다운 PCR이 있다.

프라이머 설계를 지원하기 위해 이론 PCR 결과(전자 PCR)의 컴퓨터 시뮬레이션을 수행할 수 있다.[14]

터치다운 중합효소 체인 반응 또는 터치다운 방식의 중합효소 체인 반응은 프라이머가 비특정 시퀀스를 증폭하지 않도록 하는 중합효소 체인 반응 방법이다.중합효소 연쇄반응 중 아닐링 온도는 프라이머 아닐링의 특수성을 결정한다.프라이머의 용해점은 어닐링 온도의 상한을 설정한다.이 지점 바로 아래의 온도에서는 프라이머와 템플릿 사이의 매우 구체적인 베이스 페어링만 발생한다.낮은 온도에서 프라이머는 덜 구체적으로 결합한다.비특정 프라이머 결합은 폴리머아제 연쇄 반응 결과를 모호하게 하는데, 이는 증폭 초기 단계에서 프라이머가 특정 시퀀스를 "스왑 아웃"하는 비특정 시퀀스가 폴리머아제 증폭의 지수적 특성 때문이다.

터치다운 폴리머아제 연쇄 반응 주기의 초기 단계는 높은 어닐링 온도를 가진다.어닐링 온도는 후속 사이클 집합마다 증분씩 감소한다(개별 사이클 수와 온도 감소 증가는 실험자가 선택한다).프라이머는 견딜 수 있는 비특정 결합의 최소 허용 온도인 최고 온도에서 미늘을 제거한다.따라서, 증폭된 첫 번째 시퀀스는 가장 큰 프라이머 특수성의 영역 사이의 시퀀스로서, 이것이 관심의 순서일 가능성이 가장 높다.이 파편들은 낮은 온도에서 후속 라운드 동안 더욱 증폭될 것이며, 프라이머가 낮은 온도에서 결합할 수 있는 비특정 시퀀스를 경쟁할 것이다.초기에 (고온 단계 중) 프라이머가 관심 순서에 결합되는 경우, 제품에 대한 후속 폴리머아제 연쇄 반응을 수행하여 해당 파편을 더욱 증폭시킬 수 있다.

프라이머 디머

한 프라이머의 3' 끝부분을 스스로 또는 두 번째 프라이머로 분리하면 프라이머 확장이 발생하여 PCR 겔에 저분자 중량 밴드로 보이는 이른바 프라이머 디머가 형성될 수 있다.[15]프라이머 조광기 형성은 종종 관심 있는 DNA 조각의 형성과 경쟁하며, 특히 3의 끝에 있는 프라이머 자체 또는 반응에 사용된 프라이머에 대한 보완성이 결여되도록 설계된 프라이머를 사용하지 않을 수 있다.프라이머 설계가 다른 요인에 의해 제약되고 프라이머-다이머가 발생하는 경우, 프라이머-다이머 형성을 제한하는 방법에는 MgCl2 농도의 최적화 또는 PCR의 어닐링 온도 증가가 포함될 수 있다.[15]

디옥시뉴클레오티드

디옥시뉴클레오티드(dNTPs)는 Mg2+ 이온을 결합시킬 수 있으므로 반응에서 자유 마그네슘 이온의 농도에 영향을 미칠 수 있다.또 dNTP를 과다하게 섭취하면 DNA 중합효소의 오류율을 높이고 반응까지 억제할 수 있다.[6][7]4개의 dNTP 비율의 불균형은 새로 형성된 DNA 가닥으로 잘못 결합되어 DNA 중합효소의 충실도가 저하되는 원인이 될 수 있다.[16]

참조

  1. ^ Balin BJ, Gérard HC, Arking EJ, et al. (1998). "Identification and localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer's brain". Med. Microbiol. Immunol. 187 (1): 23–42. doi:10.1007/s004300050071. PMID 9749980. S2CID 25307947. Extreme care was taken in all assays to avoid cross-contamination of both nucleic acid samples to be analyzed and reaction mixtures; such measures included preparation of nucleic acids in a laboratory separate from those in which PCR or reverse transcription (RT)-PCR assays were set up and use of eight different biologic hoods, each in a different laboratory, for setting up reactions.
  2. ^ "FAQs for Polymerases and Amplification". New England Biolabs.
  3. ^ Eckert KA, Kunkel TA (August 1991). "DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction". Genome Research. 1 (1): 17–24. doi:10.1101/gr.1.1.17. PMID 1842916.
  4. ^ Lundberg, Kelly S.; Shoemaker, Dan D.; Adams, Michael W.W.; Short, Jay M.; Sorge, Joseph A.; Mathur, Eric J. (1991). "High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus". Gene. 108 (1): 1–6. doi:10.1016/0378-1119(91)90480-y. PMID 1761218.
  5. ^ 뉴잉글랜드 비올라베스."Q5® High-Fidelity DNA 중합효소."사용 가능.
  6. ^ a b c Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M (2002). "Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach". J. Clin. Lab. Anal. 16 (1): 47–51. doi:10.1002/jcla.2058. PMC 6808141. PMID 11835531.
  7. ^ a b c d "Nucleic acid amplification protocols and guidelines". Archived from the original on 2009-02-02. Retrieved 2009-01-28. {{cite journal}}:Cite 저널은 필요로 한다. journal=(도움말)
  8. ^ Pavlov AR, Belova GI, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2002). "Helix-hairpin-helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (21): 3510–13515. Bibcode:2002PNAS...9913510P. doi:10.1073/pnas.202127199. PMC 129704. PMID 12368475.
  9. ^ Demidov VV (2002). "A happy marriage: advancing DNA polymerases with DNA topoisomerase supplements". Trends Biotechnol. 20 (12): 491. doi:10.1016/S0167-7799(02)02101-7.
  10. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2004). "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications". Trends Biotechnol. 22 (5): 253–260. doi:10.1016/j.tibtech.2004.02.011. PMID 15109812.
  11. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2004). "Thermostable Chimeric DNA Polymerases with High Resistance to Inhibitors". DNA Amplification: Current Technologies and Applications. Horizon Bioscience. pp. 3–20. ISBN 0-9545232-9-6.
  12. ^ Forterre P (2006). "DNA topoisomerase V: a new fold of mysterious origin". Trends Biotechnol. 24 (6): 245–247. doi:10.1016/j.tibtech.2006.04.006. PMID 16650908.
  13. ^ Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). "Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications: Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes". In Kieleczawa J (ed.). DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones and Bartlett. pp. 241–257. ISBN 0-7637-3383-0.
  14. ^ "Electronic PCR". NCBI - National Center for Biotechnology Information. Retrieved 13 March 2012.
  15. ^ a b Kramer MF, Coen DM (August 2006). "Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization". Curr Protoc Cytom. Appendix 3: A.3K.1–A.3K.15. doi:10.1002/0471142956.cya03ks37. PMID 18770830. S2CID 4658404.
  16. ^ Kunz BA, Kohalmi SE (1991). "Modulation of mutagenesis by deoxyribonucleotide levels". Annu. Rev. Genet. 25: 339–59. doi:10.1146/annurev.ge.25.120191.002011. PMID 1812810.