스머FP

SmURFP
형광 단백질은 세포 주기 진행을 시각화한다. IFP2.0-hGem(1/110) 형광은 녹색으로 표시되고 S/G2/M 단계가 강조 표시되며, smURFP-hCdtI(30/120) 형광은 빨간색으로 표시되고 G0/G1 단계가 강조 표시된다.

소형 적색 형광 단백질(smURFP)은 시아노박테리아(Tricodesium erythraeum) 피코빌리프로틴, α-알로피코시아닌에서 진화한 원적색 형광 단백질의 일종이다.[1][2] 토종 α-알로피코시아닌은 색소포레 피코시아노빌린을 부착하기 위해 리아제로 알려진 외생성 단백질을 필요로 한다. Phycocyanobilin is not present in mammalian cells. smURFP was evolved to covalently attach phycocyanobilin without a lyase and fluoresce, covalently attach biliverdin (ubiquitous to mammalian cells) and fluoresce, blue-shift fluorescence to match the organic fluorophore, Cy5, and not inhibit E. coli growth. smURFP was found after 12 rounds of ran돔 돌연변이 유발과 수작업으로 1,000,000개의 박테리아 군집을 선별한다.

특성.

smURFP는 흡수 및 방출량이 각각 642nm와 670nm인 호모디머다. 탠덤 다이머 smURFP(Tandem dimer smURFP)가 생성되어 smURFP와 유사한 성질을 가지고 있으며, smURFP는 단백질의 분해 반감기가 각각 17시간, 33시간으로 크롬포레(빌리버딘) 없이 매우 안정적이다. 이는 해파리에서 유래한 녹색 형광 단백질(eGFP) 단백질 분해 반감기가 24시간인 것과 견줄 만하다.[3] smURFP는 광자극성이 뛰어나 살아있는 세포에서 mCherry와[4] tdTTomato를[4] 수행한다. smURFP의 소멸계수(18만 MCM−1−1)는 극히 크고 양자수율(0.20)이 적당해 eGFP와 생물물리학적 밝기 비교가 가능하고 산호에서 유래한 대부분의 적색 또는 원적색 형광 단백질보다 약 2배 밝다. 호모디머임에도 불구하고 모든 테스트된 N-와 C-단자 퓨즈는 α-tubulin 및 라민 B1에 대한 용융이 어려운 등 정확한 세포 국산화 상태를 보여준다(그림).[1] smURFP는 흰 빛에 옅은 푸른빛이 비치기 때문에 스머프들의 이름을 따서 명명되었다.[1]

여기에서 smURFP 흡광도, 흥분도 및 방출 스펙트럼의 Excel 시트를 다운로드할 수 있다. smURFP 돌연변이(PDB: 6FZN)의 결정 구조는 푸엔잘리다-베르너 외 연구진에서 발표되었다.[5] 2020년 검토에서는 생체내 이미징을 위해 유전적으로 암호화되거나 외생적인 탐침으로서 smURFP의 최근 적용에 대해 논의하고 빌리버딘 가용성과 관련된 문제를 논의한다.[6]

이미지에는 smURFP를 발현하는 대장균, 대장균의 펠링, 매체 제거, 대장균 용해, NiNTA에 대한 smURFP 바인딩, smURFP 용출, 완충 교환 등이 표시된다.

나노 입자, 외생 탐침 및 체외 검사로 사용되는 smURFP

자유 smURFP는 직경이 2~3nm이며, 직경 10~14nm의 smURFP 나노입자는 유·수분 에멀젼으로 합성해 형광 상태를 유지할 수 있다. 이 형광 단백질 나노입자는 살아있는 생쥐에서 안정적이며 비침습성 종양 형광 촬영에 유용하다.[7]

유전자 암호화되지 않고 정제된 단백질인 자유 smURFP는 바이러스로 캡슐화하여 살아있는 생쥐의 생물분포를 비침습적이고 형광 촬영하는데 사용할 수 있다.[8][9]

smURFP는 형광을 켜기 위해 빌리버딘을 공동 부착하며 본질적으로 빌리버딘 센서다. 연구자들은 인간 혈청 내 빌리버딘의 경우 정제된 smURFP의 검출 한계는 0.4nM이며,[10] smURFP는 효소 활성을 검출하기 위한 시험관내 검사의 생성을 허용한다. 탐상 범위가 1.07 aM–0.01 mM이고 검출 한도가 0.2 aM인 트롬빈에 대한 검사가 개발되었다.[11]

Tandem dimer smURFP(Tandem dimer smURFP, TDSMURFP)는 7-transmbrane 수용체 Smoothened(SMO)라는 라벨을 붙이기 위해 외생 형광 마커로 사용되었으며, TDSMURFP는 대장균에서 정제되어 FACS(형성 활성 세포 분류)를 위해 분류하여 SMO에 부착되었다.[12] 이 소설의 외생 형광 단백질 라벨링은 단백질을 잘못 접거나 비활성화하거나 저하시키는 여러 단백질 삽입 부위, 유기 용제, 화학 반응 등을 선별하는 것을 피한다.

smURFP는 자가 라벨링 단백질이다.

소형 초적색 형광 단백질(smURFP)은 자가 라벨링 단백질이다. 기질은 불소를 유발하고, 부착하면 형광물질을 흡수하며, 형광 화물을 급조한다. smURFP[13] 태그는 도구 개발을 위한 새로운 속성을 가지고 있다.

소형 Ultra-Red 형광 단백질(SMURFP)은 헤일로-, 스냅-, CLIP-태그와 같은 자가 라벨링 단백질이다. smURFP 태그는 카복실산염에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커로 수정된 빌리버딘 기질을 화물 분자에 수용한다. 기판을 이용해 화물 분자만 공동 부착하는 헤일로-, 스냅-, CLIP 태그와 달리 빌리버딘은 불소가 유발되며, 생세포 내 화물 분자의 원적색 형광 추적이 가능하도록 smURFP 태그에 공동 부착된 형광을 'ON'으로 한다. 빌리버딘은 또한 기질 제거 없이 이미징이 가능하도록 플루오르세인 화물을 진압한다. 단일 카복시산염에 대한 빌리버딘 수정은 포유류 세포의 외부와 핵막을 통과하는 중성 분자를 생성한다.[14]

세포와 마우스에서의 색소포어 가용성

smURFP는 인간, 라민 B1과 유전적으로 융합되어 형광물질로 핵봉투를 보여주었다. 라민 B1 단백질의 국산화 세포 주기의 상이한 단계에서 변화한다.

정제 단백질이 정상화될 때 eGFP와 비교할 수 있는 생체물리학적 밝기를 보였음에도 불구하고 살아있는 세포에서는 이를 볼 수 없었다. 이것은 세포 내에 색소포레(빌리버딘)가 충분하지 않다는 것을 시사했다. 빌리버딘의 추가는 형광을 증가시켰지만 빌리버딘을 포함한 smURFP는 eGFP와 비교가 되지 않았다. 빌리버딘은 중성 pH에 두 개의 카르복실산을 가지고 있으며 이는 세포의 진입을 억제하고 있다. 빌리버딘디메틸에스테르는 더 친수성 아날로그로 세포막을 쉽게 통과한다. 빌리버딘디메틸에스테르가 있는 smURFP는 세포에서 eGFP와 비교가능한 형광을 보이며 박테리아 피토크롬 형광 단백질보다 더 밝다.

신경 배양으로 표현된 smURFP는 형광 단백질인 mCherry와 함께 보았던 라이소솜의 집적을 보여주지 않는다.

생쥐에서 smURFP 형광은 외생 빌리버딘이 없는 HT1080 종양 Xenografts에서 볼 수 있지만 형광은 산호 유래 적색 형광 단백질, mCherry[4], mCardinal보다 적다.[15] 가시 형광은 항상 사용 가능한 형광은 아니며 형광 단백질은 항상 유용하고 유전적으로 인코딩된 다른 형광 단백질과 비교되어야 한다. 외생 빌리버딘 또는 빌리버딘 디메틸 에스테르 정맥주사는 1~24시간 후 종양으로 표현되는 smURFP의 형광을 증가시키지 않는다. 집단 분광 분석은 에스테르 그룹이 빌리버딘 디메틸 에스테르에서 빠르게 제거되었다는 것을 보여주었다. 25μM 빌리버딘 또는 빌리버딘 디메틸 에스테르를 첨가하면 배설된 종양의 형광이 극적으로 증가하며 smURFP는 색소포레 없이 존재한다. 산호에서 유래한 적색 형광 단백질보다 형광물질에 비견되거나 더 큰 형광을 얻기 위해 생쥐의 색소포어 가용성을 최적화하기 위한 추가 연구가 필요하다.

세포에 색소포레 추가

빌리버딘 디메틸 에스테르, 빌리버딘, 피코시아노빌린은 프론티어 사이언티픽에서 상업적으로 구할 수 있다. 빌리버딘 디메틸 에스테르, 빌리버딘 또는 피코시아노빌린은 5 mM의 농도로 DMSO에 용해된다. 용액은 매우 어둡고 모든 것이 용해되도록 힘차게 피펫을 칠한다. 빌리버딘 디메틸 에스테르는 인산염 완충 식염수(PBS)나 행크의 균형잡힌 소금용액(HBSS) 등 일반 완충제에서는 녹지 않는다. 1-5 μM 빌리버딘 디메틸 에스테르를 10% 태아소보세럼(FBS)이 함유된 매체나 완충기에 넣는다. 세포에 25 μM 빌리버딘(막 침투성 물질로서가 아님)을 첨가한다. 빌리버딘은 smURFP 사이트를 포화시키지 않으며 최대 형광 강도를 달성하지 못한다. 빌리버딘 디메틸 에스테르는 최대의 형광 강도를 얻기 위해 사용되어야 한다. smURFP를 가능한 한 오랫동안 색소포레와 배양하여 색소포레와 함께 단백질 축적을 증가시킨다. 색소포를 최소 3시간 이상 방치하고 24시간이 권장된다. 색소를 제거하고 10% FBS가 들어 있는 용지와 페놀 적색 또는 이미징 버퍼가 없는 용기에 있는 이미지를 세척한다.

smURFP 유전 암호화 바이오센서

Far Red & Near 적외선 FUCCI는 다핵 세포의 탄생을 시각화하는데, 이것은 많은 암 세포에서 흔히 볼 수 있다.

키나제 FET 센서. smURFP는 스펙트럼 중첩으로 인해 많은 적색 형광 단백질에 유용한 수용체다. 합리적으로 설계된 적색 형광 단백질인 스태그RFP는 FET 센서를 쉽게 만들 수 있다. 스태그RFP는 원적외선 수용자 smURFP에 유용한 FET 기증자로 ERK키나제 FET 리포터가 평균 15%의 응답으로 탄생했다. 새 센서는 Src, Akt, ERK 등 3개의 키나스를 단일 셀에서 동시 시각화할 수 있도록 했다.[16]

형광 투과로 셀 사이클을 촬영하고 있어 미야와키 아쓰시와 동료들의 선구적인 연구는 세포 주기의 형광 영상을 가능하게 하는 형광 편재 기반 세포 주기 표시기(FUCCI)를 개발했다. 원래 녹색 형광 단백질인 mAG는 hGem(1/110)에, 주황색 형광 단백질(mKO2)은 hCdt1(30/120)에 융합됐다. 참고로, 이러한 핵융합은 핵 국산화 신호와 성능저하를 위한 편재현장을 포함하고 있는 파편이지만, 기능적인 단백질은 아니다. 녹색 형광 단백질은 S, G 또는2 M 단계에서 만들어지고 G0 또는 G1 단계에서 분해되며, 주황색 형광 단백질은 G0 또는 G1 단계에서 만들어지고 S, G 또는2 M 단계에서 파괴된다.[17] 원적외선 근적외선 FUCCI는 시아노박테리아 유래 형광 단백질(smURFP)과 박테리오피토크롬 유래 형광 단백질(이 링크에서 발견되는 영화)을 사용하여 개발되었다.[1]

대장균으로 표현된 smURFP(연청색).

참조

  1. ^ a b c d Rodriguez, Erik A.; Tran, Geraldine N.; Gross, Larry A.; Crisp, Jessica L.; Shu, Xiaokun; Lin, John Y.; Tsien, Roger Y. (2016-08-01). "A far-red fluorescent protein evolved from a cyanobacterial phycobiliprotein". Nature Methods. 13 (9): 763–9. doi:10.1038/nmeth.3935. ISSN 1548-7105. PMC 5007177. PMID 27479328.
  2. ^ 미국 특허 20180201655A1, 로드리게스, 에릭 A; 트랜, 제랄딘 앤 린, 존 Y 외 연구진, "알로피코시아닌 알파-부유닛은 라벨링 단백질(smURFP)을 진화시켰다." 2019-12-10을 발행했다.
  3. ^ Stack, J. H.; Whitney, M.; Rodems, S. M.; Pollok, B. A. (2000-12-01). "A ubiquitin-based tagging system for controlled modulation of protein stability". Nature Biotechnology. 18 (12): 1298–1302. doi:10.1038/82422. ISSN 1087-0156. PMID 11101811. S2CID 23741831.
  4. ^ a b c Shaner, Nathan C.; Campbell, Robert E.; Steinbach, Paul A.; Giepmans, Ben N. G.; Palmer, Amy E.; Tsien, Roger Y. (2004-12-01). "Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein". Nature Biotechnology. 22 (12): 1567–1572. doi:10.1038/nbt1037. ISSN 1087-0156. PMID 15558047. S2CID 205272166.
  5. ^ Fuenzalida-Werner, JP; Janowski, R; Mishra, K; Weidenfeld, I; Niessing, D; Ntziachristos, V; Stiel, AC (December 2018). "Crystal structure of a biliverdin-bound phycobiliprotein: Interdependence of oligomerization and chromophorylation". Journal of Structural Biology. 204 (3): 519–522. doi:10.1016/j.jsb.2018.09.013. PMID 30287387.
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  9. ^ Herbert, Fabian C.; Brohlin, Olivia R.; Galbraith, Tyler; Benjamin, Candace; Reyes, Cesar A.; Luzuriaga, Michael A.; Shahrivarkevishahi, Arezoo; Gassensmith, Jeremiah J. (2020-05-07). "Supramolecular Encapsulation of Small-Ultrared Fluorescent Proteins in Virus-Like Nanoparticles for Noninvasive In Vivo Imaging Agents". Bioconjugate Chemistry. 31 (5): 1529–1536. doi:10.1021/acs.bioconjchem.0c00190. ISSN 1043-1802. PMID 32343135.
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외부 링크